Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère fédéral allemand de l’Économie et de l’Action pour le climat (ZIM) et du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (KMUinnovativ). Nous remercions FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, États-Unis) d’avoir aimablement fourni des cardiomyocytes et Ncardia B.V. (Leiden, Pays-Bas) d’avoir aimablement fourni des cardiomyocytes, utilisés dans cette étude.

NOTE: Le flux de travail pour la mesure de la contractilité et de l’impédance/EFP est donné dans la figure supplémentaire 2.
1. Revêtement de plaque
<ol><li>Ouvrez l’emballage scellé sous vide et retirez la plaque de 96 puits. Les procédures de manutention pour les plaques à 96 puits des deux modules sont les mêmes. Laissez la plaque de contraction recouverte par le protège-membrane fourni en plus jusqu’à la mesure dans le module de contract...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

Le système hybride impédance/EFP/contractilité est une méthodologie complète pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique de sécurité à haut débit des passifs cardiaques pour le développement préclinique de médicaments. Il fournit une approche moderne pour les tests de sécurité précliniques sans l’utilisation de modèles animaux, mais avec des capacités de débit plus élevées qui réduisent considérablement le temps et les coûts. Ce système a le potentiel d’être utilisé comme une appro...

L’un des principaux objectifs du développement de médicaments modernes est l’amélioration du taux de réussite du laboratoire au chevet du patient des nouveaux traitements dans le pipeline de découverte de médicaments. Les tests pharmacologiques d’innocuité de ces nouveaux médicaments révèlent souvent des réactions indésirables sur le système cardiovasculaire qui représentent près du quart du taux d’attrition des médicaments aux stades précliniques1. Le développement et l’intégration de méthodologies de nouvelle approche (MNA) jouent un rôle clé dans la modernisation de l’évaluation préclinique, en particulier des organes de batterie de base comme le cœur. Étant donné que ces méthodologies sont des approches sans animaux, l’utilisation de modèles cellulaires humains tels que les cardiomyocytes (CM) d’origine de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) est devenue le cheval de bataille au cours de la dernière décennie pour l’évaluation moderne des questions pharmacologiques et toxicologiquesde sécurité 2. Les systèmes d’essai largement utilisés pour de telles études sont les approches expérimentales à base de microélectrodes (MEA) et de colorants sensibles à la tension3.
Néanmoins, l’immaturité phénotypique et fonctionnelle revendiquée de ce type cellulaire met des obstacles à un modèle cellulaire humain idéal, avec le potentiel de réduire les écarts translationnels entre les études non cliniques et cliniques4.
D’énormes recherches ont été menées au fil des ans pour comprendre la raison du phénotype immature implicite et trouver des moyens de pousser le processus de maturation des CSPi-CM humaines in vitro.
Il a été démontré que l’absence de signaux de maturation cardiaque tels que des temps de culture cellulaire prolongés, l’absence d’autres types de cellules à proximité ou un manque de stimulation hormonale affectait le processus de maturation5. En outre, l’environnement non physiologique des plaques de culture cellulaire régulières a été identifié comme une cause importante qui entrave la maturation des CSPi-CM humaines, en raison de la rigidité physiologique manquante du substrat du cœur humain natif 5,6.
Différents systèmes de dosage axés sur les conditions physiologiques natives ont été développés pour résoudre ce problème, y compris des systèmes de culture cellulaire 3D où les cellules sont alignées en trois dimensions pour ressembler à une architecture cardiaque native au lieu de cultures cellulaires bidimensionnelles typiques7. Bien qu’une maturation améliorée soit obtenue avec des tests 3D, le besoin d’une main-d’œuvre qualifiée et le faible débit de ces systèmes entravent une utilisation abondante de celle-ci dans le processus de développement de médicaments, car le temps et le coût jouent un rôle fondamental dans l’évaluation de nouveaux traitements sur le plan financier8.
Les lectures importantes pour l’évaluation pharmacologique et toxicologique de l’innocuité des nouveaux traitements sont les changements dans les caractéristiques fonctionnelles et structurelles des CSPi-CM humaines, puisque les effets indésirables du système cardiovasculaire induits par des composés affectent généralement l’une de ces propriétés ou les deux 1,9. Des exemples bien connus de ces effets indésirables généraux sont les médicaments anticancéreux de la famille des anthracyclines. Ici, des effets fonctionnels dangereux et structurels indésirables sur le système cardiovasculaire sont largement rapportés pendant et après le traitement du cancer chez les patients ainsi qu’avec des tests cellulaires in vitro 10,11.
Dans la présente étude, nous décrivons une méthodologie complète pour l’évaluation des effets secondaires des composés fonctionnels et structurels sur les CM-HIPSC. La méthodologie comprend l’analyse de la force contractile des cardiomyocytes et de l’analyse de l’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP). La force contractile est mesurée dans des conditions mécaniques physiologiques, les cellules étant cultivées sur des substrats de silicone mous (33 kPa), reflétant l’environnement mécanique du tissu cardiaque humain natif.
Le système est équipé de plaques à 96 puits pour l’analyse à haut débit des CSPi-CM humaines pour les études pharmacologiques et toxicologiques précliniques de sécurité cardiaque, et offre ainsi un avantage aux approches 3D actuellement utilisées comme le cœur de Langendorff ou les tranches cardiaques12,13.
Dans le détail, le système hybride se compose de deux modules, soit pour l’évaluation de la contractilité cardiaque dans des conditions physiologiques, soit pour l’analyse de la toxicité structurelle cellulaire en temps réel 6,14. Les deux modules fonctionnent avec des plaques spécialisées à haut débit de 96 puits pour une acquisition de données rapide et rentable.
Sans avoir besoin d’une construction 3D, le module de contractilité utilise des plaques spéciales contenant des membranes de silicone flexibles comme substrat pour les cellules au lieu du verre rigide ou du plastique qui compose généralement les plaques de culture cellulaire régulières. Les membranes reflètent les propriétés cardiaques biomécaniques humaines typiques et imitent donc les conditions in vivo de manière à haut débit. Alors que les iPSC-CM humaines échouent souvent à afficher le comportement des cardiomyocytes adultes en ce qui concerne l’inotropie positive induite par les composés dans d’autres tests cellulaires14, une réaction plus adulte peut être évaluée lorsque les cellules sont cultivées sur les plaques du module de contractilité. Dans des études antérieures, il a été démontré que les CSPi-CM présentent des effets inotropes positifs lors du traitement avec des composés tels que l’isoprotérénol, le S-Bay K8644 ou l’omecamtiv mecarbil 6,15. Ici, plusieurs paramètres de contractilité peuvent être évalués, tels que des paramètres primaires tels que l’amplitude de la force de contraction (mN/mm2), la durée du battement et la vitesse de battement, ainsi que des paramètres secondaires du cycle de contraction tels que l’aire sous la courbe, les pentes de contraction et de relaxation, les variations de taux de battement et les arythmies (Figure supplémentaire 1)16 . Les changements induits par les médicaments dans tous les paramètres sont évalués de manière non invasive par détection capacitive de distance. Les données brutes sont analysées par la suite par un logiciel spécialisé.
Le module de toxicité structurale ajoute ses paramètres uniques d’impédance et d’EFP comme lecture de la toxicité cellulaire structurelle et de l’analyse des propriétés électrophysiologiques17,18. La technologie de spectroscopie d’impédance électrique révèle des changements induits par des composés dans la densité cellulaire ou l’intégrité des cellules et des monocouches surveillée en temps réel, comme le montrent les CM-CSPi humaines traitées avec des composés cardiotoxiques connus13. Avec des lectures d’impédance à différentes fréquences (1-100 kHz), il est possible de disséquer davantage une réponse physiologique, ce qui permet de révéler des changements dans la topographie membranaire, les jonctions cellule-cellule ou cellule-matrice. L’enregistrement EFP supplémentaire des CSPi-CM humaines permet en outre d’analyser les effets électrophysiologiques induits par le traitement composé, comme l’a montré l’étude CiPA17,19.
Dans la présente étude, des CSPi-CM humaines ont été utilisées, traitées avec de l’épirubicine et de la doxorubicine, toutes deux bien décrites comme des anthracyclines cardiotoxiques, et de l’erlotinib, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) présentant un risque plutôt faible de toxicité cardiovasculaire. L’évaluation chronique avec l’épirubicine, la doxorubicine et l’erlotinib a été réalisée pendant 5 jours. Le résultat montre des changements mineurs dans la contractilité et l’impédance de base lorsque les cellules ont été traitées avec l’erlotinib, mais une diminution toxique dépendante du temps et de la dose de l’amplitude de contraction et de l’impédance de base lorsqu’elles sont traitées avec l’épirubicine et la doxorubicine respectivement. Des mesures aiguës ont été effectuées avec la nifédipine, un bloqueur des canaux calciques, et montrent une diminution de l’amplitude de contraction, de la durée du potentiel de champ et de l’impédance de base, démontrant les effets secondaires cardiotoxiques de ce composé aux niveaux fonctionnel et structurel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

L’évaluation de la contractilité cardiaque est d’une importance capitale pour le développement de nouveaux traitements et leur transition en toute sécurité vers les stades cliniques. Alors que les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont prometteurs pour servir de modèle pertinent pour l’homme dans les phases précliniques de la découverte de médicaments et de la pharmacologie de sécurité, leur maturité est encore controversée dans la communauté scientifique et en développement constant. Nous présentons une technologie hybride de contractilité et d’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP), ajoutant des caractéristiques de pro-maturation significatives à une plate-forme standard de 96 puits.
Le système d’impédance/EFP surveille la fonctionnalité cellulaire en temps réel. Outre la vitesse de battement des cellules contractiles, les lectures de spectroscopie d’impédance électrique détectent les changements morphologiques induits par les composés tels que la densité cellulaire et l’intégrité de la monocouche cellulaire. Dans l’autre composant du système d’analyse cellulaire hybride, les cellules sont cultivées sur des membranes bio-conformes qui imitent l’environnement mécanique du tissu cardiaque réel. Cet environnement physiologique favorise la maturation des CSPhi-CM in vitro, conduisant à davantage de réponses contractiles de type adulte, y compris des effets inotropes positifs après traitement à l’isoprotérénol, au S-Bay K8644 ou à l’omecamtiv mecarbil. Des paramètres tels que l’amplitude de la force de contraction (mN/mm2) et la durée de battement révèlent également les effets en aval des composés ayant une influence sur les propriétés électrophysiologiques et la manipulation du calcium.
Le système hybride fournit l’outil idéal pour l’analyse cellulaire holistique, permettant une évaluation préclinique du risque cardiaque au-delà des perspectives actuelles des tests cellulaires pertinents pour l’homme.

Les effets de l’inhibiteur de kinase erlotinib sur la contractilité des hiPSC-CMs sont illustrés à la Figure 1. Les cellules ont été traitées avec des concentrations allant de 10 nM à 10 μM pendant 5 jours et des paramètres de battement ont été enregistrés quotidiennement. L’erlotinib, un EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) et un inhibiteur de la tyrosine kinase présentant un risque de cardiotoxicité comparativement faible, n’a eu une dose mineure et u...

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Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

L’analyse des changements dans la fonction contractile et l’intégrité cellulaire des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC est d’une importance capitale pour le développement de médicaments non cliniques. Un système hybride d’analyse cellulaire à 96 puits aborde les deux paramètres en temps réel et de manière physiologique pour obtenir des résultats fiables et pertinents pour l’homme, nécessaires à une transition sûre vers les stades cliniques.

Système d’analyse cellulaire hybride pour évaluer les changements structurels et contractiles de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi pour l’évaluation préclinique du risque cardiaque

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

La méthode peut aider à répondre à une question préclinique liée à la sécurité cardiaque et à la toxicité en utilisant des données humaines réelles pour une transition sûre des nouveaux médicaments candidats aux stades cliniques. Au lieu d’utiliser un ensemble de différentes techniques in vitro et in vivo, le principal avantage de ce système hybride est l’évaluation simultanée du cardiomyocyte humain dérivé de l’iPC, des paramètres électrophysiologiques et de viabilité, et l’analyse des propriétés contractiles dans des conditions physiologiques. Cette méthode peut être appliquée à la découverte de médicaments car elle couvre les changements électrophysiologiques, structurels et contractiles des cardiomyocytes et un système à débit plus élevé qui permet de tester 69 puits simultanément.Pour commencer le revêtement de la plaque, laissez le fond de la plaque de contraction recouvert par le protecteur de membrane fourni en plus jusqu’à la mesure dans le module de contractilité. Pour l’ensemencement des cardiomyocytes, préparez une solution diluée d’enrobage de gel EHS en transférant 2,75 millilitres de solution de gel EHS prête à l’emploi et 8,25 millilitres de DPBS avec du calcium et du magnésium dans un tube centrifuge stérile. Ensuite, mélangez la solution.Retirez le protège-membrane de la plaque de contraction. Transférer la solution de revêtement préparée dans un réservoir de réactifs stérile dans le robot d’automatisation du laboratoire. Utilisez le programme, ajoutez 100 microlitres avec le robot d’automatisation de laboratoire et ajoutez 100 microlitres de solution de revêtement par puits.Replacez ensuite le couvercle sur la plaque de 96 puits et incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Après avoir décongelé et compté les cellules, ajustez les cellules dans le milieu de placage recommandé conformément aux instructions du fabricant de la cellule, ce qui donne 11 fois 10 à la sixième cellule par 11 millilitres pour ensemencer une plaque entière de 96 puits. Utilisez le programme retirer 100 microlitres pour retirer la solution de gel EHS des puits avec le robot d’automatisation de laboratoire.Ensuite, transférez les 11 millilitres de suspension cellulaire dans un réservoir de réactifs stériles placé dans le robot d’automatisation du laboratoire et ensemencez les cellules avec 100 microlitres de suspension par puits. En utilisant le programme, les cellules ajoutent 100 microlitres. Immédiatement après l’ensemencement cellulaire, transférez la plaque flexible de 96 puits dans l’incubateur à humidité contrôlée à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et laissez les cellules se déposer pendant la nuit.Chauffer 22 millilitres de milieu d’entretien cardiomyocytaire à ajouter à chaque plaque à 37 degrés Celsius dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. 18 à 24 heures après l’ensemencement des plaques, transférez le milieu frais dans un réservoir de réactif stérile et laissez-le à côté du robot d’automatisation du laboratoire. Ensuite, effectuez l’élimination du milieu avec le programme, retirez 100 microlitres.Ensuite, placez le réservoir de réactif contenant le milieu frais dans le robot d’automatisation du laboratoire et distribuez 200 microlitres de milieu frais par puits avec le programme, ajoutez 100 microlitres. Effectuez cette étape deux fois pour atteindre 200 microlitres par puits. Immédiatement après l’échange de milieu, transférez la plaque dans l’incubateur.Effectuer un échange moyen tous les deux jours jusqu’à l’ajout du composé. Quatre à six heures avant l’ajout du composé, effectuez un dernier changement de milieu en transférant 22 millilitres de tampon de dosage frais et chaud dans un réservoir de réactifs stérile et en le laissant à côté du robot d’automatisation du laboratoire. Immédiatement après l’échange moyen, transférez la plaque flexible dans l’incubateur.Une heure avant la mesure de référence, transférez la plaque à l’appareil de mesure respectif. Dans le logiciel de contrôle, ouvrez Modifier le protocole et sélectionnez le mode de mesure, le site Flex ou l’EFP d’impédance correspondant. Définissez la durée ou la durée de balayage d’une mesure à 30 secondes et un intervalle de répétition à 10 minutes avant d’enregistrer le numéro de protocole.Sélectionnez ensuite Démarrer le protocole et continuez à remplir les champs demandés. Lorsque les paramètres sont définis, sélectionnez Démarrer la mesure. Effectuer au moins trois mesures de base à intervalles de cinq minutes peu de temps avant l’ajout du composé.Retirer 50 microlitres du tampon d’essai de chaque puits sans retirer la plaque flexible de 96 puits de l’appareil de mesure, puis ajouter 50 microlitres de la solution composée quatre fois concentrée dans chaque puits de la plaque selon le plan de mesure. Après l’ajout du composé, sélectionnez Ajouter un marqueur de réactif pour définir la disposition de la plaque composée et le volume de la solution composée. Sélectionnez ensuite Procéder à la mesure standard ou Continuer avec la série de mesures selon le plan expérimental.L’analyse représentative montre les effets de l’inhibiteur de kinase Erlotinib sur la contractilité des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC. À la concentration la plus faible, l’erlotinib a induit une diminution statistiquement non significative de l’amplitude, tandis que les concentrations micromolaires d’erlotinib ont montré des effets cardiotoxiques dépendants du temps et de la dose. L’apparition de l’effet a été observée à partir de 96 heures avec un erlotinib micromolaire, tandis que le traitement par 10 micromolaires d’erlotinib a entraîné une diminution significative 24 heures après l’ajout du composé.Après l’application de 10 micromolaires Epirubicin, les cellules ont cessé de battre dans les 24 heures. Avec l’application d’une épirubicine micromolaire, une diminution drastique de l’amplitude après 24 heures a été suivie d’un arrêt complet du battement jusqu’à 48 heures. À 100 nanomolaires, une diminution de l’amplitude du battement en fonction du temps a été observée.À la concentration la plus faible de 10 nanomolaires, l’amplitude fluctuait régulièrement, confirmant que l’effet de l’épirubicine n’était que dose-dépendante. Le traitement par doxorubicine et nifédipine pendant 24 heures réduit la viabilité cellulaire de manière dépendante de la concentration et du temps. Lors de l’application de concentrations croissantes de nifédipine, les enregistrements du potentiel de champ sur les cellules révèlent un raccourcissement dépendant de la concentration de la durée du champ normalisée.L’évaluation de la nifédipine concernant la contractilité cardiaque a également montré une diminution significative de l’amplitude dépendante de la concentration lors de la mesure aiguë avec 10 concentrations nanomolaires et 13 nanomolaires. Il est important de se rappeler que les cellules sont généralement sensibles aux paramètres environnementaux tels que les changements de température et de pH ainsi qu’à la simulation mécanique qui est particulièrement prise en charge sur les plaques de contraction.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

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Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

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