Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Diese Arbeit wurde durch Zuwendungen des Bundesministeriums für Wirtschaft und Klimapolitik (ZIM) und des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (KMUinnovativ) gefördert. Wir danken FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) für die freundliche Bereitstellung von Kardiomyozyten und Ncardia B.V. (Leiden, Niederlande) für die freundliche Bereitstellung von Kardiomyozyten, die in dieser Studie verwendet wurden.

HINWEIS: Der Arbeitsablauf für die Kontraktilitäts- und Impedanz-/EFP-Messung ist in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.
1. Plattenbeschichtung
<ol><li>Öffnen Sie die vakuumversiegelte Verpackung und nehmen Sie die 96-Well-Platte heraus. Die Handhabung der 96-Well-Platten beider Module ist gleich. Lassen Sie die Kontraktionsplatte bis zur Messung im Kontraktilitätsmodul durch den zusätzlich mitgelieferten Membranschutz abgedeckt.</li>
	<li>Beschic...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

Das Impedanz-/EFP-/Kontraktilitäts-Hybridsystem ist eine umfassende Methodik für die pharmakologische und toxikologische Bewertung der kardialen Verbindlichkeiten im Hochdurchsatz für die präklinische Arzneimittelentwicklung. Es bietet einen modernen Ansatz für präklinische Sicherheitstests ohne den Einsatz von Tiermodellen, aber mit höheren Durchsatzkapazitäten, die Zeit und Kosten erheblich reduzieren. Dieses System hat das Potenzial, als komplementärer Ansatz für das Langendorff-Herz und andere Tiermodelle z...

Eines der Hauptziele der modernen Arzneimittelentwicklung ist die Verbesserung der Erfolgsrate neuer Therapeutika in der Wirkstoffforschungspipeline vom Labor bis zum Krankenbett. Pharmakologische Sicherheitstests dieser neuen Medikamente zeigen häufig unerwünschte Arzneimittelwirkungen auf das Herz-Kreislauf-System, die fast ein Viertel der Fluktuationsrate in präklinischen Stadien ausmachen1. Die Entwicklung und Integration neuer Ansatzmethoden (NAMs) spielt eine Schlüsselrolle bei der Modernisierung der präklinischen Bewertung, insbesondere der Kernorgane der Batterie wie des Herzens. Da es sich bei diesen Methoden um tierversuchsfreie Ansätze handelt, wurde die Verwendung humanbasierter Zellmodelle wie Kardiomyozyten (CMs) mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) in den letzten zehn Jahren zum Arbeitspferd für die moderne Bewertung von sicherheitspharmakologischen und toxikologischen Fragestellungen2. Weit verbreitete Assay-Systeme für solche Untersuchungen sind Mikroelektroden-Arrays (MEA) und spannungsempfindliche farbstoffbasierte experimentelle Ansätze3.
Nichtsdestotrotz stellt die behauptete phänotypische und funktionelle Unreife dieses Zelltyps Hindernisse für ein ideales humanbasiertes Zellmodell dar, mit dem Potenzial, translationale Lücken zwischen nicht-klinischen und klinischen Studien zu verringern4.
Im Laufe der Jahre wurde eine enorme Forschung durchgeführt, um den Grund für den implizierten unreifen Phänotyp zu verstehen und Wege zu finden, den Reifungsprozess von humanen iPSC-CMs in vitro voranzutreiben.
Es wurde gezeigt, dass fehlende kardiale Reifungssignale wie verlängerte Zellkulturzeiten, das Fehlen anderer Zelltypen in der Nähe oder ein Mangel an hormoneller Stimulation den Reifungsprozess beeinflussen5. Auch die nicht-physiologische Umgebung regulärer Zellkulturplatten wurde als eine signifikante Ursache identifiziert, die die Reifung von humanen iPSC-CMs aufgrund der fehlenden physiologischen Substratsteifigkeit des nativen menschlichen Herzens behindert 5,6.
Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Assay-Systeme entwickelt, die sich auf native physiologische Bedingungen konzentrieren, darunter 3D-Zellkultursysteme, bei denen Zellen dreidimensional ausgerichtet sind, um einer nativen Herzarchitektur anstelle von typischen zweidimensionalen Zellkulturen zu ähneln7. Obwohl mit 3D-Assays eine verbesserte Reifung erreicht wird, behindern der Bedarf an qualifizierten Arbeitskräften und der geringe Durchsatz dieser Systeme eine reichliche Verwendung im Arzneimittelentwicklungsprozess, da Zeit und Kosten eine grundlegende Rolle bei der Bewertung neuer Therapeutika auf finanzieller Ebene spielen8.
Wichtige Erkenntnisse für die pharmakologische und toxikologische Sicherheitsbewertung neuer Therapeutika sind Veränderungen der funktionellen und strukturellen Eigenschaften humaner iPSC-CMs, da verbindungsinduzierte unerwünschte Arzneimittelwirkungen des kardiovaskulären Systems in der Regel eine oder beide dieser Eigenschaften beeinflussen 1,9. Bekannte Beispiele für solche breiten Nebenwirkungen sind Krebsmedikamente der Anthrazyklin-Familie. Hier wird ausführlich über gefährliche funktionelle und nachteilige strukturelle Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System während und nach der Krebsbehandlung bei Patienten sowie mit zellbasierten In-vitro-Assays berichtet10,11.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine umfassende Methodik zur Bewertung von funktionellen und strukturellen Nebenwirkungen von hPSC-CMs. Die Methodik umfasst die Analyse der Kardiomyozytenkontraktionskraft und der Impedanz/Analyse des extrazellulären Feldpotentials (EFP). Die kontraktile Kraft wird unter physiologisch-mechanischen Bedingungen gemessen, wobei die Zellen auf weichen (33 kPa) Silikonsubstraten kultiviert werden, die die mechanische Umgebung des natürlichen menschlichen Herzgewebes widerspiegeln.
Das System ist mit 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzanalyse von humanen iPSC-CMs für präklinische pharmakologische und toxikologische Studien zur kardialen Sicherheit ausgestattet und bietet damit einen Vorteil gegenüber derzeit verwendeten 3D-Ansätzen wie Langendorff-Herz oder Herzschnitten12,13.
Im Detail besteht das Hybridsystem aus zwei Modulen, entweder zur Beurteilung der kardialen Kontraktilität unter physiologischen Bedingungen oder zur Analyse der zellulären Strukturtoxizitätin Echtzeit 6,14. Beide Module arbeiten mit speziellen 96-Well-Platten mit hohem Durchsatz für eine schnelle und kostengünstige Datenerfassung.
Ohne dass ein 3D-Konstrukt erforderlich ist, verwendet das Kontraktilitätsmodul spezielle Platten, die flexible Silikonmembranen als Substrat für die Zellen enthalten, anstelle des steifen Glases oder Kunststoffs, aus dem normale Zellkulturplatten normalerweise bestehen. Die Membranen spiegeln typische biomechanische Herzeigenschaften des Menschen wider und ahmen daher in vivo Bedingungen im Hochdurchsatz nach. Während humane iPSC-CMs in anderen zellbasierten Assays oft kein adultes Kardiomyozytenverhalten in Bezug auf die verbindungsinduzierte positive Inotropie zeigen14, kann eine erwachsenere Reaktion beurteilt werden, wenn die Zellen auf den Platten des Kontraktilitätsmoduls kultiviert werden. In früheren Studien wurde gezeigt, dass iPSC-CMs positive inotrope Wirkungen bei der Behandlung mit Verbindungen wie Isoproterenol, S-Bay K8644 oder Omecamtiv Mecarbil 6,15 zeigen. Hier können mehrere Kontraktilitätsparameter bewertet werden, wie z. B. primäre Parameter wie die Amplitude der Kontraktionskraft (mN/mm2), die Schlagdauer und die Schlagfrequenz sowie sekundäre Parameter des Kontraktionszyklus wie Fläche unter der Kurve, Kontraktions- und Relaxationssteigungen, Schlaggeschwindigkeitsschwankungen und Arrhythmien (ergänzende Abbildung 1)16 . Medikamenteninduzierte Veränderungen in allen Parametern werden nicht-invasiv durch kapazitive Distanzmessung erfasst. Die Rohdaten werden anschließend von einer speziellen Software analysiert.
Das Modul für strukturelle Toxizität fügt seine einzigartigen Impedanz- und EFP-Parameter als Anzeige für die strukturelle zelluläre Toxizität und die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaftenhinzu 17,18. Die elektrische Impedanzspektroskopie-Technologie zeigt verbindungsinduzierte Veränderungen der Zelldichte oder der Zell- und Monoschichtintegrität, die in Echtzeit überwacht werden, wie bei humanen iPSC-CMs gezeigt wurde, die mit bekannten kardiotoxischen Verbindungen behandelt wurden13. Mit Impedanzanzeigen bei verschiedenen Frequenzen (1-100 kHz) ist es möglich, eine physiologische Reaktion weiter zu sezieren und somit Veränderungen in der Membrantopographie, Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Verbindungen aufzudecken. Die zusätzliche EFP-Aufzeichnung von humanen iPSC-CMs ermöglicht darüber hinaus die Analyse von elektrophysiologischen Effekten, die durch die Behandlung mit Wirkstoffen hervorgerufen werden, wie im Lichte der CiPA-Studiegezeigt wurde 17,19.
In der vorliegenden Studie wurden humane iPSC-CMs verwendet, die mit Epirubicin und Doxorubicin, die beide als kardiotoxische Anthrazykline beschrieben werden, und Erlotinib, einem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) mit einem relativ geringen Risiko für kardiovaskuläre Toxizität, behandelt wurden. Die chronische Beurteilung mit Epirubicin, Doxorubicin und Erlotinib wurde über 5 Tage durchgeführt. Das Ergebnis zeigt geringfügige Veränderungen der Kontraktilität und Basenimpedanz, wenn die Zellen mit Erlotinib behandelt wurden, aber eine zeit- und dosisabhängige toxische Abnahme der Kontraktionsamplitude und Basenimpedanz, wenn sie mit Epirubicin bzw. Doxorubicin behandelt wurden. Akute Messungen wurden mit dem Calciumkanalblocker Nifedipin durchgeführt und zeigten eine Abnahme der Kontraktionsamplitude, der Feldpotentialdauer und der Basenimpedanz, was kardiotoxische Nebenwirkungen dieser Verbindung sowohl auf funktioneller als auch auf struktureller Ebene zeigte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

Die Beurteilung der kardialen Kontraktilität ist von immenser Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapeutika und deren sicheren Übergang in die klinischen Stadien. Während human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) vielversprechend sind, als humanrelevantes Modell in präklinischen Phasen der Arzneimittelforschung und Sicherheitspharmakologie zu dienen, ist ihre Reife in der wissenschaftlichen Gemeinschaft immer noch umstritten und wird ständig weiterentwickelt. Wir präsentieren eine hybride Kontraktilitäts- und Impedanz-/extrazelluläres Feldpotenzial (EFP)-Technologie, die einer branchenüblichen 96-Well-Plattform signifikante Reifungsmerkmale hinzufügt.
Das Impedanz-/EFP-System überwacht die zelluläre Funktionalität in Echtzeit. Neben der Schlagrate kontraktiler Zellen erkennen die elektrischen Impedanzspektroskopie-Anzeigen verbindungsinduzierte morphologische Veränderungen wie Zelldichte und Integrität der zellulären Monoschicht. In der anderen Komponente des Hybridzellanalysesystems werden die Zellen auf biokonformen Membranen kultiviert, die die mechanische Umgebung von echtem Herzgewebe nachahmen. Diese physiologische Umgebung unterstützt die Reifung von hiPSC-CMs in vitro, was nach der Behandlung mit Isoproterenol, S-Bay K8644 oder omecamtiver Mecarbil zu eher adulten kontraktilen Reaktionen führt, einschließlich positiver inotroper Effekte. Parameter wie die Amplitude der Kontraktionskraft (mN/mm2) und die Schlagdauer zeigen auch nachgeschaltete Effekte von Verbindungen mit Einfluss auf die elektrophysiologischen Eigenschaften und den Umgang mit Kalzium.
Das Hybridsystem bietet das ideale Werkzeug für die ganzheitliche Zellanalyse und ermöglicht eine präklinische kardiale Risikobewertung über die aktuellen Perspektiven humanrelevanter zellbasierter Assays hinaus.

Die Auswirkungen des Kinase-Inhibitors Erlotinib auf die Kontraktilität von hiPSC-CMs sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Zellen wurden 5 Tage lang mit Konzentrationen im Bereich von 10 nM bis 10 μM behandelt und die Schlagparameter wurden täglich aufgezeichnet. Erlotinib, ein EGFR (epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) und Tyrosinkinase-Inhibitor mit einem vergleichsweise geringen Risiko für Kardiotoxizität, hatte nur bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich eine geringe dosis- und...

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Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.

Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Die Methode kann dazu beitragen, präklinische Fragen zur kardialen Sicherheit und Toxizität unter Verwendung realer humanbasierter Daten zu beantworten, um einen sicheren Übergang neuer Arzneimittelkandidaten in die klinische Phase zu ermöglichen. Anstatt eine Reihe verschiedener In-vitro- und In-vivo-Techniken zu verwenden, besteht der Hauptvorteil dieses Hybridsystems in der gleichzeitigen Bewertung von humanen iPC-abgeleiteten Kardiomyozyten, elektrophysiologischen und Lebensfähigkeitsparametern sowie in der Analyse kontraktiler Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen. Diese Methode kann für die Wirkstoffforschung angewendet werden, da sie elektrophysiologische, strukturelle und kontraktile Veränderungen von Kardiomyozyten und ein System mit höherem Durchsatz abdeckt, das die gleichzeitige Untersuchung von 69 Bohrlöchern ermöglicht.Um mit der Plattenbeschichtung zu beginnen, lassen Sie den Boden der Kontraktionsplatte bis zur Messung im Kontraktilitätsmodul mit dem zusätzlich mitgelieferten Membranschutz abgedeckt. Für die Aussaat von Kardiomyozyten bereiten Sie eine verdünnte EHS-Gelbeschichtungslösung vor, indem Sie 2,75 Milliliter EHS-Gel-gebrauchsfertige Lösung und 8,25 Milliliter DPBS mit Kalzium und Magnesium in ein steriles Zentrifugenröhrchen überführen. Mischen Sie dann die Lösung.Entfernen Sie den Membranschutz von der Kontraktionsplatte. Übertragen Sie die vorbereitete Beschichtungslösung in ein steriles Reagenzienreservoir im Laborautomatisierungsroboter. Verwenden Sie das Programm, fügen Sie 100 Mikroliter mit dem Laborautomatisierungsroboter hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter der Beschichtungslösung pro Vertiefung hinzu.Dann den Deckel wieder auf die 96-Well-Platte setzen und drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Auftauen und Zählen der Zellen stellen Sie die Zellen in das empfohlene Beschichtungsmedium gemäß den Anweisungen des Zellherstellers ein, was zu 11 mal 10 bis sechsten Zellen pro 11 Milliliter für die Aussaat einer gesamten 96-Well-Platte führt. Verwenden Sie das Programm 100 Mikroliter entfernen, um die EHS-Gellösung mit dem Laborautomatisierungsroboter aus den Vertiefungen zu entfernen.Als nächstes überführen Sie die 11 Milliliter Zellsuspension in ein steriles Reagenzreservoir, das im Laborautomatisierungsroboter platziert wird, und säen die Zellen mit 100 Mikrolitern Suspension pro Well. Mit dem Programm fügen Zellen 100 Mikroliter hinzu. Unmittelbar nach der Zellaussaat die flexible 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, in den feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator geben und die Zellen über Nacht absetzen lassen.In einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen werden 22 Milliliter Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium auf jede Platte auf 37 Grad Celsius gegeben. 18 bis 24 Stunden nach der Aussaat der Platten das frische Medium in ein steriles Reagenzreservoir überführen und neben dem Laborautomatisierungsroboter abstellen. Führen Sie dann die Mediumentfernung mit dem Programm durch und entfernen Sie 100 Mikroliter.Als nächstes legen Sie das Reagenzienreservoir mit dem frischen Medium in den Laborautomatisierungsroboter und geben Sie 200 Mikroliter des frischen Mediums pro Vertiefung mit dem Programm ab, fügen Sie 100 Mikroliter hinzu. Führen Sie diesen Schritt zweimal durch, um 200 Mikroliter pro Vertiefung zu erreichen. Unmittelbar nach dem Mediumwechsel die Platte in den Inkubator überführen.Führen Sie jeden zweiten Tag einen Mediumwechsel durch, bis die Verbindung zugegeben wird. Vier bis sechs Stunden vor der Zugabe der Verbindung führen Sie einen letzten Mediumwechsel durch, indem Sie 22 Milliliter frischen und warmen Assay-Puffer in ein steriles Reagenzienreservoir überführen und neben dem Laborautomatisierungsroboter belassen. Unmittelbar nach dem Mediumwechsel die flexible Platte wieder in den Inkubator überführen.Eine Stunde vor der Basismessung die Platte in das jeweilige Messgerät überführen. Öffnen Sie in der Steuerungssoftware Protokoll bearbeiten und wählen Sie den jeweiligen Messmodus, Flex Site oder Impedanz EFP aus. Definieren Sie die Sweep-Dauer oder -Länge einer Messung auf 30 Sekunden und ein Wiederholungsintervall auf 10 Minuten, bevor Sie die Protokollnummer speichern.Wählen Sie dann Protokoll starten und fahren Sie mit dem Ausfüllen der erforderlichen Felder fort. Wenn die Parameter eingestellt sind, wählen Sie Messung starten. Führen Sie mindestens drei Baseline-Messungen in Fünf-Minuten-Intervallen kurz vor der Zugabe der Verbindung durch.Entfernen Sie 50 Mikroliter des Assay-Puffers aus jeder Vertiefung, ohne die flexible 96-Well-Platte aus dem Messgerät zu entfernen, gefolgt von der Zugabe von 50 Mikrolitern der vierfach konzentrierten Verbindungslösung in jede Vertiefung der Platte gemäß dem Messplan. Wählen Sie nach der Zugabe der Verbindung Reagenzmarker hinzufügen, um das Layout der Verbindungsplatte und das Volumen der Verbindungslösung zu definieren. Wählen Sie dann Mit Standardmessung fortfahren oder mit Messreihen gemäß Versuchsplan fortfahren.Die repräsentative Analyse zeigt die Wirkungen des Kinase-Inhibitors Erlotinib auf die Kontraktilität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Bei der niedrigsten Konzentration induzierte Erlotinib eine statistisch unsignifikante Abnahme der Amplitude, während mikromolare Konzentrationen von Erlotinib zeit- und dosisabhängige kardiotoxische Wirkungen zeigten. Der Beginn der Wirkung wurde nach 96 Stunden mit einem mikromolaren Erlotinib beobachtet, während die Behandlung mit 10 mikromolaren Erlotinib 24 Stunden nach Zugabe der Verbindung zu einer signifikanten Abnahme führte.Nach der Anwendung von 10 mikromolaren Epirubicin hörten die Zellen innerhalb von 24 Stunden auf zu schlagen. Bei der Anwendung eines mikromolaren Epirubicins folgte auf eine drastische Abnahme der Amplitude nach 24 Stunden eine vollständige Beendigung des Schlages bis 48 Stunden. Bei 100 Nanomolaren wurde eine zeitabhängige Abnahme der Schlagamplitude beobachtet.Bei der niedrigsten Konzentration von 10 Nanomolaren schwankte die Amplitude stetig, was bestätigte, dass die Wirkung von Epirubicin nur dosisabhängig war. Die Behandlung mit Doxorubicin und Nifedipin über 24 Stunden reduziert die Zelllebensfähigkeit konzentrations- und zeitabhängig. Bei Anwendung steigender Nifedipin-Konzentrationen zeigen Feldpotentialaufnahmen an Zellen eine konzentrationsabhängige Verkürzung der Felddauer normalisiert.Die Nifedipin-Bewertung in Bezug auf die kardiale Kontraktilität zeigte ebenfalls eine signifikante konzentrationsabhängige Amplitudenabnahme bei akuter Messung mit 10 nanomolaren und 13 nanomolaren Konzentrationen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zellen im Allgemeinen empfindlich auf Umweltparameter wie Temperatur- und pH-Änderungen sowie auf mechanische Simulationen reagieren, die besonders auf den Kontraktionsplatten unterstützt werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Forschung

Biotechnik

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...