Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero federale tedesco per gli affari economici e l'azione per il clima (ZIM) e dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (KMUinnovativ). Ringraziamo FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) per aver gentilmente fornito cardiomiociti e Ncardia B.V. (Leiden, Paesi Bassi) per aver gentilmente fornito i cardiomiociti, utilizzati in questo studio.

NOTA: Il flusso di lavoro per la misura di contrattilità e impedenza/EFP è riportato nella figura supplementare 2.
1. Rivestimento della piastra
<ol><li>Aprire la confezione sottovuoto ed estrarre la piastra a 96 pozzetti. Le procedure di gestione per le piastre a 96 pozzetti di entrambi i moduli sono le stesse. Lasciare la piastra di contrazione coperta dalla protezione della membrana in dotazione fino alla misurazione nel modulo di contrattilità.</li>
	...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

Il sistema ibrido impedenza/EFP/contrattilità è una metodologia completa per la valutazione farmacologica e tossicologica della sicurezza ad alta produttività delle passività cardiache per lo sviluppo preclinico di farmaci. Fornisce un approccio moderno per i test di sicurezza preclinici senza l'uso di modelli animali, ma con capacità di produttività più elevate che riducono significativamente tempi e costi. Questo sistema ha il potenziale per essere utilizzato come approccio complementare per il Langendorff Heart...

Uno dei principali obiettivi dello sviluppo di farmaci moderni è il miglioramento del tasso di successo da banco a letto di nuove terapie nella pipeline di scoperta di farmaci. I test farmacologici di sicurezza di questi nuovi farmaci spesso rivelano reazioni avverse al farmaco sul sistema cardiovascolare che rappresentano quasi un quarto del tasso di abbandono del farmaco nelle fasi precliniche1. Lo sviluppo e l'integrazione di nuove metodologie di approccio (NAM) svolgono un ruolo chiave nella modernizzazione della valutazione preclinica, in particolare degli organi della batteria centrale come il cuore. Poiché queste metodologie sono approcci privi di animali, l'uso di modelli cellulari basati sull'uomo come i cardiomiociti (CM) di origine delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è diventato il cavallo di battaglia nell'ultimo decennio per la moderna valutazione delle questioni farmacologiche e tossicologiche di sicurezza2. I sistemi di analisi ampiamente utilizzati per tali indagini sono gli array di microelettrodi (MEA) e gli approcci sperimentali basati su coloranti sensibilialla tensione 3.
Tuttavia, la presunta immaturità fenotipica e funzionale di questo tipo di cellula pone ostacoli sulla strada di un modello cellulare ideale basato sull'uomo, con il potenziale di ridurre i divari traslazionali tra studi non clinici e clinici4.
Nel corso degli anni sono state condotte enormi ricerche per comprendere la ragione del fenotipo immaturo implicito e per trovare modi per spingere il processo di maturazione delle iPSC-CM umane in vitro.
La mancanza di segnali di maturazione cardiaca come tempi di coltura cellulare prolungati, l'assenza di altri tipi di cellule nelle vicinanze o la mancanza di stimolazione ormonale hanno dimostrato di influenzare il processo di maturazione5. Inoltre, l'ambiente non fisiologico delle piastre di coltura cellulare regolare è stato identificato come una causa significativa che impedisce la maturazione delle iPSC-CM umane, a causa della mancanza di rigidità fisiologica del substrato del cuore umano nativo 5,6.
Per affrontare questo problema sono stati sviluppati diversi sistemi di analisi incentrati sulle condizioni fisiologiche native, compresi i sistemi di coltura cellulare 3D in cui le cellule sono allineate tridimensionalmente per assomigliare all'architettura cardiaca nativa anziché alle tipiche colture cellulari bidimensionali7. Sebbene si ottenga una migliore maturazione con saggi 3D, la necessità di una forza lavoro qualificata e la bassa produttività di questi sistemi ostacolano un uso abbondante di questo nel processo di sviluppo dei farmaci, poiché tempi e costi giocano un ruolo fondamentale nella valutazione di nuove terapie a livello finanziario8.
Letture importanti per la valutazione farmacologica e tossicologica della sicurezza di nuove terapie sono i cambiamenti nelle caratteristiche funzionali e strutturali delle iPSC-CM umane, poiché le reazioni avverse al farmaco indotte da composti del sistema cardiovascolare di solito influenzano una o entrambe queste proprietà 1,9. Esempi ben noti di reazioni avverse così ampie sono i farmaci antitumorali della famiglia delle antracicline. Qui, effetti funzionali e strutturali avversi pericolosi sul sistema cardiovascolare sono ampiamente riportati durante e dopo il trattamento del cancro nei pazienti, nonché con saggi in vitro basati su cellule10,11.
Nel presente studio, descriviamo una metodologia completa per la valutazione degli effetti collaterali dei composti sia funzionali che strutturali sulle hiPSC-CM. La metodologia include l'analisi della forza contrattile dei cardiomiociti e l'analisi dell'impedenza/potenziale di campo extracellulare (EFP). La forza contrattile viene misurata in condizioni meccaniche fisiologiche, con le cellule coltivate su substrati di silicone morbido (33 kPa), che riflettono l'ambiente meccanico del tessuto cardiaco umano nativo.
Il sistema è dotato di piastre a 96 pozzetti per l'analisi ad alta produttività di iPSC-CM umane per studi farmacologici e tossicologici preclinici sulla sicurezza cardiaca, e quindi offre un vantaggio agli approcci 3D attualmente utilizzati come il cuore di Langendorff o le fette di cuore12,13.
Nel dettaglio, il sistema ibrido si compone di due moduli, sia per la valutazione della contrattilità cardiaca in condizioni fisiologiche che per l'analisi della tossicità strutturale cellulare in tempo reale 6,14. Entrambi i moduli funzionano con piastre specializzate ad alta produttività a 96 pozzetti per un'acquisizione dei dati rapida ed economica.
Senza la necessità di un costrutto 3D, il modulo di contrattilità impiega piastre speciali che contengono membrane siliconiche flessibili come substrato per le cellule invece del vetro rigido o della plastica di cui di solito sono costituite le normali piastre di coltura cellulare. Le membrane riflettono le tipiche proprietà del cuore biomeccanico umano e quindi imitano le condizioni in vivo in modo ad alta produttività. Mentre le iPSC-CM umane spesso non riescono a mostrare il comportamento dei cardiomiociti adulti per quanto riguarda l'inotropia positiva indotta da composti in altri saggi basati su cellule14, una reazione più simile all'adulto può essere valutata quando le cellule sono coltivate sulle piastre del modulo di contrattilità. In studi precedenti, è stato dimostrato che le iPSC-CM mostrano effetti inotropi positivi al trattamento con composti come isoproterenolo, S-Bay K8644 o omecamtiv mecarbil 6,15. Qui possono essere valutati più parametri di contrattilità, come parametri primari come l'ampiezza della forza di contrazione (mN / mm2), la durata del battito e la frequenza di battito, nonché parametri secondari del ciclo di contrazione come l'area sotto la curva, le pendenze di contrazione e rilassamento, le variazioni della frequenza di battito e le aritmie (Figura supplementare 1)16 . I cambiamenti indotti dal farmaco in tutti i parametri sono valutati in modo non invasivo mediante il rilevamento capacitivo della distanza. I dati grezzi vengono analizzati successivamente da software specializzati.
Il modulo di tossicità strutturale aggiunge i suoi parametri unici di impedenza e EFP come lettura per la tossicità cellulare strutturale e l'analisi delle proprietà elettrofisiologiche17,18. La tecnologia della spettroscopia di impedenza elettrica rivela cambiamenti indotti da composti nella densità cellulare o nell'integrità delle cellule e dei monostrati monitorati in tempo reale, come mostrato con iPSC-CM umane trattate con composti cardiotossici noti13. Con letture di impedenza a frequenze diverse (1-100 kHz) è possibile sezionare ulteriormente una risposta fisiologica, e quindi è possibile rivelare cambiamenti nella topografia della membrana, nelle giunzioni cellula-cellula o cellula-matrice. La registrazione EFP aggiuntiva delle iPSC-CM umane consente inoltre l'analisi degli effetti elettrofisiologici indotti dal trattamento con composti, come è stato dimostrato alla luce dello studio CiPA17,19.
Nel presente studio, sono state impiegate iPSC-CM umane, trattate con epirubicina e doxorubicina, entrambe ben descritte come antracicline cardiotossiche, ed erlotinib, un inibitore della tirosin-chinasi (TKI) con un rischio piuttosto basso di tossicità cardiovascolare. La valutazione cronica con epirubicina, doxorubicina ed erlotinib è stata eseguita per 5 giorni. Il risultato mostra lievi cambiamenti nella contrattilità e nell'impedenza basale quando le cellule sono state trattate con erlotinib, ma una diminuzione tossica dipendente dal tempo e dalla dose dell'ampiezza della contrazione e dell'impedenza basale quando trattati rispettivamente con epirubicina e doxorubicina. Le misurazioni acute sono state eseguite con il calcio-antagonista nifedipina e mostrano una diminuzione dell'ampiezza della contrazione, della durata del potenziale di campo e dell'impedenza di base, dimostrando effetti collaterali cardiotossici di questo composto a livello funzionale e strutturale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

La valutazione della contrattilità cardiaca è di immensa importanza per lo sviluppo di nuove terapie e la loro transizione sicura nelle fasi cliniche. Mentre i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) promettono di servire come modello rilevante per l'uomo nelle fasi precliniche della scoperta di farmaci e della farmacologia di sicurezza, la loro maturità è ancora controversa nella comunità scientifica e in costante sviluppo. Presentiamo una contrattilità ibrida e una tecnologia EFP (impedenza/potenziale di campo extracellulare), aggiungendo significative caratteristiche di pro-maturazione a una piattaforma standard del settore a 96 pozzetti.
Il sistema impedenza/EFP monitora la funzionalità cellulare in tempo reale. Oltre alla frequenza di battimento delle cellule contrattili, le letture della spettroscopia di impedenza elettrica rilevano cambiamenti morfologici indotti da composti come la densità cellulare e l'integrità del monostrato cellulare. Nell'altro componente del sistema di analisi delle cellule ibride, le cellule sono coltivate su membrane bio-compatibili che imitano l'ambiente meccanico del tessuto cardiaco reale. Questo ambiente fisiologico supporta la maturazione di hiPSC-CMs in vitro, portando a risposte contrattili più simili a quelle degli adulti, inclusi effetti inotropi positivi dopo il trattamento con isoproterenolo, S-Bay K8644 o omecamtiv mecarbil. Parametri come l'ampiezza della forza di contrazione (mN/mm2) e la durata del battito rivelano anche effetti a valle dei composti con influenza sulle proprietà elettrofisiologiche e sulla manipolazione del calcio.
Il sistema ibrido fornisce lo strumento ideale per l'analisi olistica delle cellule, consentendo la valutazione preclinica del rischio cardiaco oltre le attuali prospettive dei saggi cellulari rilevanti per l'uomo.

Gli effetti dell'inibitore della chinasi erlotinib sulla contrattilità delle hiPSC-CM sono mostrati nella Figura 1. Le cellule sono state trattate con concentrazioni comprese tra 10 nM e 10 μM per 5 giorni e i parametri di battimento sono stati registrati quotidianamente. Erlotinib, un EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) e inibitore della tirosin-chinasi con un rischio relativamente basso di cardiotossicità, ha avuto una dose minore e un effetto dipendente dal tempo sulle ...

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Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

L'analisi dei cambiamenti nella funzione contrattile e nell'integrità cellulare dei cardiomiociti umani derivati da iPSC è di immensa importanza per lo sviluppo di farmaci non clinici. Un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti affronta entrambi i parametri in tempo reale e in modo fisiologico per risultati affidabili e rilevanti per l'uomo, necessari per una transizione sicura nelle fasi cliniche.

Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Il metodo può aiutare a rispondere alle domande relative alla sicurezza cardiaca preclinica e alla tossicità utilizzando dati reali basati sull'uomo per una transizione sicura di nuovi farmaci candidati alle fasi cliniche. Invece di utilizzare una serie di diverse tecniche in vitro e in vivo, il principale vantaggio di questo sistema ibrido è la valutazione simultanea dei cardiomiociti derivati da iPC, dei parametri elettrofisiologici e di vitalità umani e l'analisi delle proprietà contrattili in condizioni fisiologiche. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci in quanto copre i cambiamenti elettrofisiologici, strutturali e contrattili dei cardiomiociti e un sistema a più alto rendimento che consente il test di 69 pozzetti contemporaneamente.Per iniziare il rivestimento della piastra, lasciare il fondo della piastra di contrazione coperto dalla protezione della membrana fornita in aggiunta fino alla misurazione nel modulo di contrattilità. Per la semina dei cardiomiociti, preparare una soluzione di rivestimento in gel EHS diluita trasferendo 2,75 millilitri di gel EHS soluzione pronta all'uso e 8,25 millilitri di DPBS con calcio e magnesio in una provetta da centrifuga sterile. Quindi mescolare la soluzione.Rimuovere la protezione della membrana dalla piastra di contrazione. Trasferire la soluzione di rivestimento preparata in un serbatoio di reagente sterile nel robot di automazione di laboratorio. Utilizzare il programma, aggiungere 100 microlitri con il robot di automazione di laboratorio e aggiungere 100 microlitri della soluzione di rivestimento per pozzetto.Quindi riposizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius. Dopo aver scongelato e contato le celle, regolare le celle nel mezzo di placcatura raccomandato secondo le istruzioni del produttore della cella, ottenendo 11 volte 10 alla sesta cella per 11 millilitri per seminare un'intera piastra da 96 pozzetti. Utilizzare il programma per rimuovere 100 microlitri per rimuovere la soluzione di gel EHS dai pozzetti con il robot di automazione di laboratorio.Successivamente, trasferire gli 11 millilitri di sospensione cellulare in un serbatoio di reagente sterile collocato nel robot di automazione di laboratorio e seminare le cellule con 100 microlitri di sospensione per pozzetto. Utilizzando il programma, le celle aggiungono 100 microlitri. Immediatamente dopo la semina cellulare, trasferire la piastra flessibile a 96 pozzetti nell'incubatore a umidità controllata a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, e lasciare che le cellule si depositino durante la notte.Riscaldare 22 millilitri di terreno di mantenimento dei cardiomiociti da aggiungere a ciascuna piastra a 37 gradi Celsius in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Da 18 a 24 ore dopo aver seminato le piastre, trasferire il terreno fresco in un serbatoio di reagente sterile e lasciarlo accanto al robot di automazione di laboratorio. Quindi eseguire la rimozione media con il programma, rimuovere 100 microlitri.Quindi posizionare il serbatoio del reagente contenente il mezzo fresco nel robot di automazione di laboratorio e erogare 200 microlitri del mezzo fresco per pozzetto con il programma, aggiungere 100 microlitri. Eseguire questo passaggio due volte per raggiungere 200 microlitri per pozzetto. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo, trasferire la piastra nell'incubatore.Eseguire uno scambio medio a giorni alterni fino all'aggiunta del composto. Da quattro a sei ore prima dell'aggiunta del composto, eseguire un cambiamento finale del mezzo trasferendo 22 millilitri di tampone di analisi fresco e caldo in un serbatoio di reagente sterile e lasciandolo accanto al robot di automazione di laboratorio. Immediatamente dopo lo scambio del mezzo trasferire nuovamente la piastra flessibile nell'incubatore.Un'ora prima della misurazione di base trasferire la piastra al rispettivo dispositivo di misurazione. Nel software di controllo aprire Edit Protocol e selezionare la rispettiva modalità di misurazione, Flex Site o Impedenza EFP. Definire la durata o la lunghezza di una misurazione a 30 secondi e un intervallo di ripetizione a 10 minuti prima di salvare il numero di protocollo.Quindi selezionare Avvia protocollo e continuare a compilare i campi richiesti. Quando i parametri sono impostati, selezionare Avvia misurazione. Eseguire un minimo di tre misurazioni di base a intervalli di cinque minuti poco prima dell'aggiunta del composto.Rimuovere 50 microlitri del tampone di analisi da ciascun pozzetto senza rimuovere la piastra flessibile a 96 pozzetti dal dispositivo di misurazione, seguita dall'aggiunta di 50 microlitri della soluzione composta concentrata quattro volte in ciascun pozzetto della piastra secondo il piano di misurazione. Dopo l'aggiunta del composto, selezionare Aggiungi marcatore reagente per definire la disposizione della piastra composta e il volume della soluzione composta. Quindi selezionare Procedi con la misurazione standard o procedere con le serie di misurazioni in base al piano sperimentale.L'analisi rappresentativa mostra gli effetti dell'inibitore della chinasi Erlotinib sulla contrattilità dei cardiomiociti umani derivati da iPSC. Alla concentrazione più bassa, Erlotinib ha indotto una diminuzione statisticamente insignificante dell'ampiezza, mentre le concentrazioni micromolari di Erlotinib hanno mostrato effetti cardiotossici tempo-dipendenti e dose-dipendenti. L'insorgenza dell'effetto è stata osservata a partire da 96 ore con un micromolare Erlotinib, mentre il trattamento con 10 micromolari Erlotinib ha determinato una diminuzione significativa 24 ore dopo l'aggiunta di composto.Dopo l'applicazione di 10 micromolari di epirubicina, le cellule hanno cessato di battere entro 24 ore. Con l'applicazione di un'epirubicina micromolare, una drastica diminuzione dell'ampiezza dopo 24 ore è stata seguita dalla completa cessazione del battito fino a 48 ore. A 100 nanomolari, è stata osservata una diminuzione dipendente dal tempo dell'ampiezza del battito.Alla concentrazione più bassa di 10 nanomolari, l'ampiezza fluttuava costantemente, confermando che l'effetto dell'epirubicina era solo dose-dipendente. Il trattamento con Doxorubicina e Nifedipina per 24 ore riduce la vitalità cellulare in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo. Dopo l'applicazione dell'aumento delle concentrazioni di Nifedipina, le registrazioni del potenziale di campo sulle cellule rivelano un accorciamento dipendente dalla concentrazione della durata del campo normalizzata.La valutazione della nifedipina per quanto riguarda la contrattilità cardiaca ha anche mostrato una significativa diminuzione dell'ampiezza dipendente dalla concentrazione dopo la misurazione acuta con concentrazioni di 10 nanomolari e 13 nanomolari. È importante ricordare che le cellule sono generalmente sensibili ai parametri ambientali come le variazioni di temperatura e pH, nonché la simulazione meccanica che è particolarmente supportata sulle piastre di contrazione.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Ricerca

Bioingegneria

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

L&#39;utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid Imaging μCT-FMT e analisi delle immagini

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Reti di cardiomiociti derivati da umani da iPSC su array di microelettrodi multiwell per registrazioni di potenziali azioni ricorrenti

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...