Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det tyske forbundsdepartementet for økonomiske saker og klimatiltak (ZIM) og fra det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (KMUinnovativ). Vi takker FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) for vennlig å gi kardiomyocytter og Ncardia B.V. (Leiden, Nederland) for vennlig å gi kardiomyocytter, brukt i denne studien.

MERK: Arbeidsflyten for kontraktilitet og impedans/EFP-måling er gitt i supplerende figur 2.
1. Plate belegg
<ol><li>Åpne den vakuumforseglede emballasjen og ta ut 96-brønnsplaten. Håndteringsprosedyrer for 96-brønnsplater på begge modulene er de samme. La sammentrekningsplaten være dekket av den ekstra tilførte membranbeskyttelsen til måling i kontraktilitetsmodulen.</li>
	<li>Belegg de fleksible 96-brønnsplatene for såing av kardiomyocytter.<ol>...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

Impedans/EFP/kontraktilitetshybridsystemet er en omfattende metodikk for farmakologisk og toksikologisk vurdering av hjerteforpliktelser for preklinisk legemiddelutvikling. Det gir en moderne tilnærming til preklinisk sikkerhetstesting uten bruk av dyremodeller, men med høyere gjennomstrømningskapasitet som reduserer tid og kostnader betydelig. Dette systemet har potensial til å bli brukt som en komplementær tilnærming til Langendorff-hjertet og andre dyremodeller for preklinisk funksjonell og strukturell toksisite...

Et av de viktigste målene for moderne medisinutvikling er forbedringen av suksessraten fra benk til seng for nye terapier i legemiddeloppdagelsesrørledningen. Sikkerhetsfarmakologisk testing av disse nye legemidlene avslører ofte bivirkninger på kardiovaskulærsystemet som står for nesten en fjerdedel av medikamentutmattelsesraten i prekliniske stadier1. Utvikling og integrering av nye tilnærmingsmetoder (NAMs) spiller en nøkkelrolle i moderniseringen av preklinisk vurdering, spesielt kjernebatteriorganer som hjertet. Siden disse metodene er dyrefrie tilnærminger, ble bruken av menneskebaserte cellemodeller som kardiomyocytter (CM) av indusert pluripotent stamcelleopprinnelse (iPSC) arbeidshesten i løpet av det siste tiåret for den moderne vurderingen av sikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske problemer2. Mye brukte analysesystemer for slike undersøkelser er mikroelektrode array (MEA) og spenningsfølsomme fargestoffbaserte eksperimentelle tilnærminger3.
Ikke desto mindre setter den påståtte fenotypiske og funksjonelle umodenheten til denne celletypen hindringer i veien for en ideell menneskebasert cellemodell, med potensial til å redusere translasjonsgap mellom ikke-kliniske og kliniske studier4.
Enorm forskning har blitt utført gjennom årene for å forstå årsaken til den underforståtte umodne fenotypen og for å finne måter å presse modningsprosessen til humane iPSC-CMs in vitro.
Manglende hjertemodningssignaler som forlengede cellekulturtider, fravær av andre celletyper i nærheten eller mangel på hormonell stimulering ble vist å påvirke modningsprosessen5. Også det ikke-fysiologiske miljøet til vanlige cellekulturplater ble identifisert som en signifikant årsak som hindrer modningen av humane iPSC-CM, på grunn av den manglende fysiologiske substratstivheten til det innfødte menneskelige hjertet 5,6.
Ulike analysesystemer med fokus på innfødte fysiologiske forhold ble utviklet for å takle dette problemet, inkludert 3D-cellekultursystemer der celler er justert tredimensjonalt for å ligne innfødt hjertearkitektur i stedet for typiske todimensjonale cellekulturer7. Selv om forbedret modning oppnås med 3D-analyser, hindrer behovet for en dyktig arbeidsstyrke og den lave gjennomstrømningen av disse systemene en rikelig bruk av dette i legemiddelutviklingsprosessen, siden tid og kostnader spiller en grunnleggende rolle i vurderingen av nye terapier på et økonomisk nivå8.
Viktige avlesninger for sikkerhetsfarmakologisk og toksikologisk vurdering av nye terapier er endringer i funksjonelle og strukturelle egenskaper ved humane iPSC-CM, siden sammensatte bivirkninger av kardiovaskulærsystemet vanligvis påvirker en eller begge av disse egenskapene 1,9. Kjente eksempler på slike brede bivirkninger er anti-kreftmedisiner av antracyklinfamilien. Her er farlige funksjonelle og negative strukturelle effekter på kardiovaskulærsystemet mye rapportert under og etter kreftbehandling hos pasienter, samt med in vitro cellebaserte analyser10,11.
I denne studien beskriver vi en omfattende metodikk for vurdering av både funksjonelle og strukturelle sammensatte bivirkninger på hiPSC-CM. Metodikken omfatter analyse av kardiomyocytt kontraktil kraft og impedans/ekstracellulært feltpotensial (EFP)-analyse. Den kontraktile kraften måles under fysiologiske mekaniske forhold, med cellene dyrket på myke (33 kPa) silikonsubstrater, noe som gjenspeiler det mekaniske miljøet i innfødt menneskelig hjertevev.
Systemet er utstyrt med 96-brønnsplater for høy gjennomstrømningsanalyse av humane iPSC-CMs for prekliniske hjertesikkerhetsfarmakologiske og toksikologiske studier, og gir dermed en fordel for dagens brukte 3D-tilnærminger som Langendorff hjerte- eller hjerteskiver12,13.
I detalj består hybridsystemet av to moduler, enten for vurdering av hjertekontraktilitet under fysiologiske forhold eller analyse av sanntids cellulær strukturell toksisitet 6,14. Begge modulene arbeider med spesialiserte 96-brønnsplater med høy gjennomstrømning for rask og kostnadseffektiv datainnsamling.
Uten behov for en 3D-konstruksjon, benytter kontraktilitetsmodulen spesialplater som inneholder fleksible silikonmembraner som substrat for cellene i stedet for det stive glasset eller plasten som vanlige cellekulturplater vanligvis består av. Membranene reflekterer typiske menneskelige biomekaniske hjerteegenskaper og etterligner derfor in vivo-forhold på en høy gjennomstrømningsmåte. Mens humane iPSC-CM ofte ikke viser voksen kardiomyocytadferd angående sammensatt indusert positiv inotropi i andre cellebaserte analyser14, kan en mer voksenlignende reaksjon vurderes når cellene dyrkes på platene i kontraktilitetsmodulen. I tidligere studier har det vist seg at iPSC-CM utviser positive inotrope effekter ved behandling med forbindelser som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Her kan flere kontraktilitetsparametere vurderes, for eksempel primære parametere som amplituden til sammentrekningskraft (mN / mm2), slagvarighet og takthastighet, samt sekundære parametere for sammentrekningssyklusen som areal under kurven, sammentreknings- og avslapningsskråninger, slaghastighetsvariasjoner og arytmier (supplerende figur 1)16 . Legemiddelinduserte endringer i alle parametere vurderes ikke-invasivt ved kapasitiv avstandsmåling. Rådataene analyseres deretter av spesialisert programvare.
Den strukturelle toksisitetsmodulen legger til sin unike impedans og EFP-parametere som avlesning for strukturell cellulær toksisitet og analyse av elektrofysiologiske egenskaper17,18. Den elektriske impedansspektroskopiteknologien avslører sammensatte induserte endringer i celletetthet eller celle- og monolagsintegritet overvåket i sanntid, som vist med humane iPSC-CM behandlet med kjente kardiotoksiske forbindelser13. Med impedansavlesninger ved forskjellige frekvenser (1-100 kHz) er det mulig å dissekere en fysiologisk respons ytterligere, og dermed er det oppnåelig å avsløre endringer i membrantopografi, celle-celle eller cellematrisekryss. Den ekstra EFP-registreringen av humane iPSC-CM-er muliggjør videre analyse av elektrofysiologiske effekter fremkalt ved sammensatt behandling, som vist i lys av CiPA-studien17,19.
I denne studien ble humane iPSC-CM brukt, behandlet med epirubicin og doksorubicin, begge godt beskrevet som kardiotoksiske antracykliner, og erlotinib, en tyrosinkinasehemmer (TKI) med en ganske lav risiko for kardiovaskulær toksisitet. Kronisk vurdering med epirubicin, doksorubicin og erlotinib ble utført i 5 dager. Resultatet viser små endringer i kontraktilitet og baseimpedans når celler ble behandlet med erlotinib, men en tids- og doseavhengig toksisk reduksjon i kontraksjonsamplitude og baseimpedans ved behandling med henholdsvis epirubicin og doksorubicin. Akutte målinger ble utført med kalsiumkanalblokker nifedipin og viser en reduksjon i kontraksjonsamplitude, feltpotensialvarighet og baseimpedans, som demonstrerer kardiotoksiske bivirkninger av denne forbindelsen på funksjonelle så vel som strukturelle nivåer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

Vurdering av hjertekontraktilitet er av enorm betydning for utviklingen av nye terapier og deres sikre overgang til kliniske stadier. Mens menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) holder løfte om å tjene som en menneskelig relevant modell i prekliniske faser av legemiddeloppdagelse og sikkerhetsfarmakologi, er deres modenhet fortsatt kontroversiell i det vitenskapelige samfunn og under konstant utvikling. Vi presenterer en EFP-teknologi (hybrid contractility and impedance/extracellular field potential), som tilfører betydelige pro-modningsfunksjoner til en industristandard 96-brønns plattform.
Impedans-/EFP-systemet overvåker cellulær funksjonalitet i sanntid. I tillegg til takthastigheten til kontraktile celler, oppdager de elektriske impedansspektroskopiavlesningene sammensatte morfologiske endringer som celletetthet og integritet av det cellulære monolaget. I den andre komponenten i hybridcelleanalysesystemet dyrkes cellene på biokompatible membraner som etterligner det mekaniske miljøet i ekte hjertevev. Dette fysiologiske miljøet støtter modningen av hiPSC-CMs in vitro, noe som fører til mer voksenlignende kontraktile responser, inkludert positive inotrope effekter etter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametere som amplituden av kontraksjonskraft (mN / mm2) og slagvarighet avslører også nedstrøms effekter av forbindelser med påvirkning på elektrofysiologiske egenskaper og kalsiumhåndtering.
Hybridsystemet gir det ideelle verktøyet for helhetlig celleanalyse, noe som muliggjør preklinisk hjerterisikovurdering utover dagens perspektiver for menneskerelevante cellebaserte analyser.

Effektene av kinasehemmeren erlotinib på kontraktiliteten til hiPSC-CM er vist i figur 1. Cellene ble behandlet med konsentrasjoner fra 10 nM til 10 μM i 5 dager, og beatparametere ble registrert daglig. Erlotinib, en EGFR (epidermal vekstfaktorreseptor) og tyrosinkinasehemmer med sammenlignbart lav risiko for kardiotoksisitet, hadde en mindre dose- og tidsavhengig effekt på hiPSC-CM bare ved konsentrasjoner i mikromolarområdet. Ved laveste konsentrasjon (10 nM) induserte erlotinib en st...

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Analysen av endringer i kontraktil funksjon og cellulær integritet av humane iPSC-avledede kardiomyocytter er av enorm betydning for ikke-klinisk legemiddelutvikling. Et hybrid 96-brønns celleanalysesystem adresserer begge parametrene i sanntid og fysiologisk måte for pålitelige, menneskerelevante resultater, som er nødvendige for en sikker overgang til kliniske stadier.

Hybridcelleanalysesystem for å vurdere strukturelle og kontraktile endringer av humane iPSC-avledede kardiomyocytter for preklinisk hjerterisikovurdering

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Metoden kan bidra til å svare på preklinisk hjertesikkerhet og toksisitetsrelatert spørsmål ved hjelp av ekte menneskebaserte data for en sikker overgang av nye legemiddelkandidater til kliniske stadier. I stedet for å bruke et sett med forskjellige in vitro- og in vivo-teknikker, er den største fordelen med dette hybridsystemet samtidig vurdering av humane iPC-avledede kardiomyocytt-, elektrofysiologiske og levedyktighetsparametere, og analyse av kontraktile egenskaper under fysiologiske forhold. Denne metoden kan brukes til narkotikaforskning, da den dekker elektrofysiologiske, strukturelle og kontraktile endringer av kardiomyocytter og et høyere gjennomstrømningssystem som muliggjør testing av 69 brønner samtidig.For å starte platebelegget, la bunnen av sammentrekningsplaten være dekket av den ekstra tilførte membranbeskyttelsen til måling i kontraktilitetsmodulen. For såing av kardiomyocytter, lag en fortynnet EHS-gelbeleggløsning ved å overføre 2,75 ml EHS-gel klar til bruk og 8,25 ml DPBS med kalsium og magnesium i et sterilt sentrifugerør. Bland deretter løsningen.Fjern membranbeskyttelsen fra sammentrekningsplaten. Overfør den forberedte overflatebehandlingsløsningen til et sterilt reagensreservoar i laboratorieautomatiseringsroboten. Bruk programmet, tilsett 100 mikroliter med laboratorieautomatiseringsroboten og tilsett 100 mikroliter av beleggløsningen per brønn.Legg deretter lokket tilbake på 96-brønnsplaten og inkuber i tre timer ved 37 grader Celsius. Etter tining og telling av cellene, juster cellene i det anbefalte pletteringsmediet i henhold til celleprodusentens instruksjoner, noe som resulterer i 11 ganger 10 til sjette celler per 11 milliliter for såing av en hel 96-brønnplate. Bruk programmet til å fjerne 100 mikroliter for å fjerne EHS-gelløsningen fra brønnene med laboratorieautomatiseringsroboten.Deretter overfører du 11 milliliter cellesuspensjon til et sterilt reagensreservoar plassert i laboratorieautomatiseringsroboten, og frø cellene med 100 mikroliter suspensjon per brønn. Ved hjelp av programmet legger celler til 100 mikroliter. Umiddelbart etter cellesådd, overfør den fleksible 96-brønnsplaten til den fuktighetsstyrte inkubatoren ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid, og la cellene slå seg ned over natten.Varm 22 milliliter kardiomyocytt vedlikeholdsmedium som skal legges til hver plate til 37 grader Celsius i et 50 milliliter sentrifugerør. 18 til 24 timer etter sådd av platene, overfør det ferske mediet til et sterilt reagensreservoar og la det ligge ved siden av laboratorieautomatiseringsroboten. Utfør deretter middels fjerning med programmet, fjern 100 mikroliter.Deretter plasserer du reagensbeholderen som inneholder det ferske mediet i laboratorieautomatiseringsroboten og dispenserer 200 mikroliter av det ferske mediet per brønn med programmet, tilsett 100 mikroliter. Utfør dette trinnet to ganger for å nå 200 mikroliter per brønn. Umiddelbart etter middels utveksling, overfør platen til inkubatoren.Utfør en middels utveksling annenhver dag til sammensatt tilsetning. Fire til seks timer før sammensatt tilsetning utfører en endelig mediumendring ved å overføre 22 milliliter frisk og varm analysebuffer til et sterilt reagensreservoar og la det stå ved siden av laboratorieautomatiseringsroboten. Umiddelbart etter middels utveksling overføres den fleksible platen tilbake til inkubatoren.En time før baselinemåling overføres platen til det respektive måleapparatet. Åpne Edit Protocol i kontrollprogramvaren og velg den respektive målemodusen, fleksstedet eller impedansen. Definer sveipevarigheten eller lengden på én måling til 30 sekunder og et repetisjonsintervall til 10 minutter før du lagrer protokollnummeret.Velg deretter Start protokoll og fortsett å fylle ut de forespurte feltene. Når parameterne er angitt, velger du Start måling. Utfør minst tre basismålinger i fem minutters intervaller kort tid før tilsetning av forbindelsen.Fjern 50 mikroliter av analysebufferen fra hver brønn uten å fjerne den fleksible 96-brønnsplaten fra måleenheten, etterfulgt av tilsetning av 50 mikroliter av den fire ganger konsentrerte forbindelsesløsningen i hver brønn på platen i henhold til måleplanen. Etter tilsetning av forbindelse, velg legg til reagensmarkør for å definere oppsettet for forbindelsesplaten og volumet av den sammensatte løsningen. Velg deretter Fortsett med standardmåling eller fortsett med måleserie i henhold til eksperimentplanen.Den representative analysen viser effekten av kinasehemmeren Erlotinib på kontraktiliteten til humane iPSC-avledede kardiomyocytter. Ved laveste konsentrasjon induserte erlotinib en statistisk ubetydelig reduksjon i amplitude, mens mikromolære konsentrasjoner av erlotinib viste tids- og doseavhengige kardiotoksiske effekter. Inntreden av effekten ble sett fra 96 timer med ett mikromolært erlotinib, mens behandling med 10 mikromolært erlotinib resulterte i en signifikant reduksjon 24 timer etter sammensatt addisjon.Etter påføring av 10 mikromolar epirubicin sluttet cellene å slå innen 24 timer. Ved bruk av ett mikromolært epirubicin ble en drastisk reduksjon i amplitude etter 24 timer etterfulgt av fullstendig beatstopp til 48 timer. Ved 100 nanomolar ble det observert en tidsavhengig reduksjon i slagamplitude.Ved den laveste konsentrasjonen av 10 nanomolar svingte amplituden jevnt, noe som bekreftet at effekten av Epirubicin bare var doseavhengig. Behandling med doksorubicin og nifedipin i 24 timer reduserer cellens levedyktighet på en konsentrasjons- og tidsavhengig måte. Ved bruk av økende Nifedipinkonsentrasjoner avslører feltpotensielle opptak på celler en konsentrasjonsavhengig forkortelse av feltvarigheten normalisert.Nifedipinvurdering vedrørende hjertekontraktilitet viste også signifikant konsentrasjonsavhengig amplitudereduksjon ved akutt måling med 10 nanomolære og 13 nanomolære konsentrasjoner. Det er viktig å huske at cellene generelt er følsomme for miljøparametere som temperatur- og pH-endringer, samt mekanisk simulering som støttes spesielt på sammentrekningsplatene.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Samsvarende Mikroskopi for 3D Structural Analysis of Dynamic Interaksjoner

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utnyttelse av mikro Silicon Cantilevers å vurdere Cellular kontraktile funksjon<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid μCT-FMT bildebehandling og bildeanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardisert og skalerbar analyse for å studere Perfusert 3D angiogenic spirende av iPSC-avledet endothelial Cells in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Human iPSC-avledet Cardiomyocyte nettverk opp på Multiwell mikro--elektrode oppstille for tilbakevendende aksjonen muligheter registreringene

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...