Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Este trabalho foi apoiado por subvenções do Ministério Federal Alemão para Assuntos Econômicos e Ação Climática (ZIM) e do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (KMUinnovativ). Agradecemos à FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EUA) por gentilmente fornecer cardiomiócitos e à Ncardia B.V. (Leiden, Holanda) por gentilmente fornecer cardiomiócitos, usados neste estudo.

NOTA: O fluxo de trabalho para a contratilidade e a medição da impedância/EFP é apresentado na Figura 2 Suplementar.
1. Revestimento da placa
<ol><li>Abra a embalagem selada a vácuo e retire a placa de 96 poços. Os procedimentos de manuseio para placas de 96 poços de ambos os módulos são os mesmos. Deixe a placa de contração coberta pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade.</li>
	<li>Revestir...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

O sistema híbrido impedância/EFP/contratilidade é uma metodologia abrangente para avaliação farmacológica e toxicológica de alta segurança de rendimento de passivos cardíacos para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. Ele fornece uma abordagem moderna para testes de segurança pré-clínicos sem o uso de modelos animais, mas com maiores capacidades de rendimento que reduzem significativamente o tempo e os custos. Este sistema tem o potencial de ser usado como uma abordagem complementar para o Langend...

Um dos principais objetivos do desenvolvimento de medicamentos modernos é a melhoria da taxa de sucesso do banco ao leito de novas terapêuticas no pipeline de descoberta de medicamentos. O teste farmacológico de segurança desses novos medicamentos geralmente revela reações adversas a medicamentos no sistema cardiovascular que representam quase um quarto da taxa de atrito de medicamentos nos estágios pré-clínicos1. O desenvolvimento e a integração de novas metodologias de abordagem (NAMs) desempenham um papel fundamental na modernização da avaliação pré-clínica, em particular dos órgãos da bateria central, como o coração. Como essas metodologias são abordagens livres de animais, o uso de modelos celulares de base humana, como cardiomiócitos (MCs) de origem de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), tornou-se o cavalo de batalha na última década para a avaliação moderna de questões farmacológicas e toxicológicas de segurança2. Os sistemas de ensaio amplamente utilizados para tais investigações são as abordagens experimentais baseadas em microeletrodos (MEA) e corantes sensíveis à tensão3.
No entanto, a alegada imaturidade fenotípica e funcional desse tipo de célula coloca obstáculos no caminho de um modelo celular ideal de base humana, com o potencial de reduzir as lacunas translacionais entre estudos não clínicos e clínicos4.
Uma tremenda pesquisa foi conduzida ao longo dos anos para entender a razão do fenótipo imaturo implícito e encontrar maneiras de impulsionar o processo de maturação dos iPSC-CMs humanos in vitro.
A falta de sinais de maturação cardíaca, como tempos prolongados de cultura celular, ausência de outros tipos de células nas proximidades ou falta de estimulação hormonal, mostrou afetar o processo de maturação5. Além disso, o ambiente não fisiológico das placas regulares de cultura celular foi identificado como uma causa significativa que impede a maturação dos CMiPS humanos, devido à falta de rigidez fisiológica do substrato do coração humano nativo 5,6.
Diferentes sistemas de ensaio com foco em condições fisiológicas nativas foram desenvolvidos para lidar com essa questão, incluindo sistemas de cultura de células 3D em que as células são alinhadas tridimensionalmente para se assemelharem à arquitetura cardíaca nativa em vez de culturas celulares bidimensionais típicas7. Embora a maturação melhorada seja obtida com ensaios 3D, a necessidade de uma força de trabalho qualificada e o baixo rendimento desses sistemas dificultam um uso abundante deste no processo de desenvolvimento de medicamentos, uma vez que o tempo e o custo desempenham um papel fundamental na avaliação de novas terapêuticas em nível financeiro8.
Leituras importantes para avaliação farmacológica e toxicológica de segurança de novas terapêuticas são alterações nas características funcionais e estruturais dos CMiPS humanos, uma vez que as reações adversas medicamentosas induzidas por compostos do sistema cardiovascular geralmente afetam uma ou ambas as propriedades 1,9. Exemplos bem conhecidos de reações adversas tão amplas são medicamentos anticancerígenos da família das antraciclinas. Aqui, efeitos funcionais e estruturais adversos perigosos sobre o sistema cardiovascular são amplamente relatados durante e após o tratamento do câncer em pacientes, bem como com ensaios in vitro baseados em células10,11.
No presente estudo, descrevemos uma metodologia abrangente para a avaliação dos efeitos colaterais de compostos funcionais e estruturais em CM-hiPSC. A metodologia inclui a análise da força contrátil dos cardiomiócitos e da impedância/análise do Potencial de Campo Extracelular (PPE). A força contrátil é medida sob condições fisiológicas mecânicas, com as células cultivadas em substratos de silicone macios (33 kPa), refletindo o ambiente mecânico do tecido cardíaco humano nativo.
O sistema é equipado com placas de 96 poços para análise de alto rendimento de CMiPS humanos para estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos de segurança cardíaca e, portanto, oferece uma vantagem às abordagens 3D atualmente usadas, como coração de Langendorff ou fatias cardíacas12,13.
Em detalhes, o sistema híbrido é composto por dois módulos, seja para a avaliação da contratilidade cardíaca em condições fisiológicas ou para a análise da toxicidade estrutural celular em tempo real 6,14. Ambos os módulos trabalham com placas especializadas de alto rendimento de 96 poços para aquisição de dados rápida e econômica.
Sem a necessidade de uma construção 3D, o módulo de contratilidade emprega placas especiais que contêm membranas de silicone flexíveis como substrato para as células, em vez do vidro rígido ou plástico que as placas de cultura celular regulares geralmente consistem. As membranas refletem as propriedades biomecânicas típicas do coração humano e, portanto, imitam as condições in vivo de uma maneira de alto rendimento. Embora as CMiPSC humanas muitas vezes não apresentem o comportamento dos cardiomiócitos adultos em relação à inotropia positiva induzida por compostos em outros ensaios baseados em células14, uma reação mais semelhante à adulta pode ser avaliada quando as células são cultivadas nas placas do módulo de contratilidade. Em estudos anteriores, foi demonstrado que as CMi iPSC apresentam efeitos inotrópicos positivos no tratamento com compostos como isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil 6,15. Aqui, múltiplos parâmetros de contratilidade podem ser avaliados, como parâmetros primários como a amplitude da força de contração (mN/mm2), duração do batimento e taxa de batimento, bem como parâmetros secundários do ciclo de contração, como área sob a curva, inclinações de contração e relaxamento, variações da taxa de batimento e arritmias (Figura Suplementar 1)16 . As alterações induzidas por drogas em todos os parâmetros são avaliadas de forma não invasiva por detecção capacitiva de distância. Os dados brutos são analisados posteriormente por softwares especializados.
O módulo de toxicidade estrutural adiciona seus parâmetros únicos de impedância e EFP como leitura da toxicidade celular estrutural e da análise das propriedades eletrofisiológicas17,18. A tecnologia de espectroscopia de impedância elétrica revela alterações induzidas por compostos na densidade celular ou na integridade celular e monocamada monitoradas em tempo real, como demonstrado com CMiPSC humanos tratados com compostos cardiotóxicos conhecidos13. Com leituras de impedância em diferentes frequências (1-100 kHz) é possível dissecar ainda mais uma resposta fisiológica e, assim, revelar mudanças na topografia da membrana, nas junções célula-célula ou célula-matriz é alcançável. O registro adicional de PFE de CMiPS humanos possibilita ainda a análise dos efeitos eletrofisiológicos provocados pelo tratamento composto, como foi demonstrado à luz do estudo CiPA17,19.
No presente estudo, foram empregados CMiPSC humanos, tratados com epirrubicina e doxorrubicina, ambos bem descritos como antraciclinas cardiotóxicas, e erlotinibe, um inibidor da tirosina quinase (TKI) com um risco bastante baixo de toxicidade cardiovascular. A avaliação crônica com epirrubicina, doxorrubicina e erlotinibe foi realizada por 5 dias. O resultado mostra pequenas alterações na contratilidade e impedância de bases quando as células foram tratadas com erlotinib, mas uma diminuição tóxica dependente do tempo e da dose na amplitude de contração e impedância de base quando tratadas com epirrubicina e doxorrubicina, respectivamente. As medidas agudas foram realizadas com o bloqueador dos canais de cálcio nifedipina e mostraram uma diminuição na amplitude de contração, duração do potencial de campo e impedância de base, demonstrando efeitos colaterais cardiotóxicos deste composto nos níveis funcionais e estruturais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

A avaliação da contratilidade cardíaca é de imensa importância para o desenvolvimento de novas terapêuticas e sua transição segura para os estágios clínicos. Embora os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) prometam servir como um modelo relevante para o ser humano em fases pré-clínicas de descoberta de medicamentos e farmacologia de segurança, sua maturidade ainda é controversa na comunidade científica e em constante desenvolvimento. Apresentamos uma tecnologia híbrida de contratilidade e impedância/potencial de campo extracelular (EFP), adicionando recursos significativos de promaturação a uma plataforma de 96 poços padrão da indústria.
O sistema de impedância/EFP monitora a funcionalidade celular em tempo real. Além da taxa de batimento das células contráteis, as leituras de espectroscopia de impedância elétrica detectam alterações morfológicas induzidas por compostos, como densidade celular e integridade da monocamada celular. No outro componente do sistema de análise de células híbridas, as células são cultivadas em membranas bio-compatíveis que imitam o ambiente mecânico do tecido cardíaco real. Este ambiente fisiológico suporta a maturação de hiPSC-CMs in vitro, levando a respostas contráteis semelhantes a mais adultos, incluindo efeitos inotrópicos positivos após o tratamento com isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil. Parâmetros como a amplitude da força de contração (mN/mm2) e a duração do batimento também revelam efeitos a jusante de compostos com influência nas propriedades eletrofisiológicas e no manuseio do cálcio.
O sistema híbrido fornece a ferramenta ideal para a análise holística de células, permitindo a avaliação pré-clínica do risco cardíaco além das perspectivas atuais de ensaios baseados em células relevantes para humanos.

Os efeitos do inibidor de quinase erlotinib sobre a contratilidade dos CM-hiPSC são mostrados na Figura 1. As células foram tratadas com concentrações variando de 10 nM a 10 μM por 5 dias e os parâmetros de batimento foram registrados diariamente. O erlotinibe, um EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e inibidor da tirosina quinase com um risco comparativamente baixo de cardiotoxicidade, teve uma dose menor e um efeito dependente do tempo nos CM-hiPSC apenas em concentra?...

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Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.

Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

O método pode ajudar a responder a questões pré-clínicas relacionadas à segurança cardíaca e toxicidade usando dados reais baseados em humanos para uma transição segura de novos candidatos a medicamentos para estágios clínicos. Em vez de utilizar um conjunto de diferentes técnicas in vitro e in vivo, a principal vantagem deste sistema híbrido é a avaliação simultânea de cardiomiócitos derivados de iPC humano, parâmetros eletrofisiológicos e de viabilidade, e a análise das propriedades contráteis em condições fisiológicas. Este método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, pois abrange alterações eletrofisiológicas, estruturais e contráteis de cardiomiócitos e um sistema de maior rendimento que permite o teste de 69 poços simultaneamente.Para iniciar o revestimento da placa, deixe o fundo da placa de contração coberto pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade. Para semear cardiomiócitos, prepare uma solução diluída de revestimento em gel EHS transferindo 2,75 mililitros de gel EHS pronto para uso e 8,25 mililitros de DPBS com cálcio e magnésio em um tubo centrífugo estéril. Em seguida, misture a solução.Remova o protetor de membrana da placa de contração. Transfira a solução de revestimento preparada para um reservatório de reagente estéril no robô de automação de laboratório. Use o programa, adicione 100 microlitros com o robô de automação de laboratório e adicione 100 microlitros da solução de revestimento por poço.Em seguida, coloque a tampa de volta na placa de 96 poços e incube por três horas a 37 graus Celsius. Após o descongelamento e a contagem das células, ajuste as células no meio de revestimento recomendado de acordo com as instruções do fabricante da célula, resultando em 11 vezes 10 a sextas células por 11 mililitros para semear uma placa inteira de 96 poços. Use o programa remover 100 microlitros para remover a solução de gel EHS dos poços com o robô de automação de laboratório.Em seguida, transfira os 11 mililitros de suspensão celular para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório e semeie as células com 100 microlitros de suspensão por poço. Usando o programa, as células adicionam 100 microlitros. Imediatamente após a semeadura da célula, transfira a placa flexível de 96 poços para a incubadora com umidade controlada a 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%, e deixe as células se estabelecerem durante a noite.Aqueça 22 mililitros de meio de manutenção de cardiomiócitos a serem adicionados a cada placa a 37 graus Celsius em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. 18 a 24 horas após a semeadura das placas, transfira o meio fresco para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação de laboratório. Em seguida, execute a remoção média com o programa, remova 100 microlitros.Em seguida, coloque o reservatório de reagente contendo o meio fresco no robô de automação de laboratório e dispense 200 microlitros do meio fresco por poço com o programa, adicione 100 microlitros. Execute esta etapa duas vezes para atingir 200 microlitros por poço. Imediatamente após a troca média, transfira a placa para a incubadora.Realize uma troca média a cada dois dias até a adição do composto. Quatro a seis horas antes da adição do composto, execute uma mudança final de meio, transferindo 22 mililitros de tampão de ensaio fresco e quente para um reservatório de reagente estéril e deixando-o ao lado do robô de automação de laboratório. Imediatamente após a troca média, transfira a placa flexível de volta para a incubadora.Uma hora antes da medição da linha de base, transfira a placa para o respectivo dispositivo de medição. No software de controle, abra Editar Protocolo e selecione o respectivo Modo de Medição, Local de Flexão ou Impedância EFP. Defina a duração ou o comprimento da varredura de uma medição para 30 segundos e um intervalo de repetição para 10 minutos antes de salvar o número do protocolo.Em seguida, selecione Iniciar Protocolo e continue a preencher os campos solicitados. Quando os parâmetros estiverem definidos, selecione Iniciar medição. Realize um mínimo de três medições basais em intervalos de cinco minutos pouco antes da adição do composto.Remova 50 microlitros do tampão de ensaio de cada poço sem remover a placa flexível de 96 poços do dispositivo de medição, seguido pela adição de 50 microlitros da solução composta quatro vezes concentrada em cada poço da placa de acordo com o plano de medição. Após a adição do composto, selecione adicionar marcador de reagente para definir o layout da placa composta e o volume da solução composta. Em seguida, selecione Prosseguir com a Medição Padrão ou prosseguir com a Série de Medição de acordo com o plano experimental.A Análise Representativa mostra os efeitos do inibidor da quinase Erlotinib na contratilidade dos cardiomiócitos humanos derivados da iPSC. Na concentração mais baixa, o erlotinib induziu uma diminuição estatisticamente insignificante da amplitude, enquanto as concentrações micromolares de erlotinib apresentaram efeitos cardiotóxicos dependentes do tempo e da dose. O início do efeito foi observado a partir de 96 horas com um erlotinibe micromolar, enquanto o tratamento com 10 erlotinib micromolares resultou numa diminuição significativa 24 horas após a adição do composto.Após a aplicação de 10 epirrubicina micromolar, as células pararam de bater dentro de 24 horas. Com a aplicação de uma epirrubicina micromolar, uma diminuição drástica da amplitude após 24 horas foi seguida pela cessação completa do batimento até 48 horas. Aos 100 nanomolares, observou-se uma diminuição dependente do tempo na amplitude do batimento.Na menor concentração de 10 nanomolares, a amplitude flutuou de forma constante, confirmando que o efeito da epirrubicina foi apenas dose-dependente. O tratamento com doxorrubicina e nifedipina por 24 horas reduz a viabilidade celular de forma dependente da concentração e do tempo. Após a aplicação de concentrações crescentes de nifedipina, os registros de potencial de campo nas células revelam um encurtamento dependente da concentração da duração do campo normalizado.A avaliação da nifedipina quanto à contratilidade cardíaca também mostrou uma diminuição significativa da amplitude dependente da concentração na medida aguda com concentrações nanomolares e 13 nanomolares. É importante lembrar que as células são geralmente sensíveis a parâmetros ambientais, como mudanças de temperatura e pH, bem como simulação mecânica, que é especialmente suportada nas placas de contração.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Bioengenharia

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...