Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Эта работа была поддержана грантами Федерального министерства экономики и климатических действий Германии (ZIM) и Федерального министерства образования и исследований Германии (KMUinnovativ). Мы благодарим FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, США) за любезное предоставление кардиомиоцитов и Ncardia B.V. (Лейден, Нидерланды) за любезное предоставление кардиомиоцитов, используемых в этом исследовании.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс измерения сократимости и импеданса/EFP приведен на дополнительном рисунке 2.
1. Покрытие пластин
<ol><li>Откройте вакуумную упаковку и выньте пластину с 96 лунками. Процедуры обработки 96-луночных плит обоих модулей одинаковы. Ост?...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

Гибридная система импеданса/ЕФП/сократительной способности представляет собой комплексную методологию фармакологической и токсикологической оценки высокопроизводительной безопасности сердечных обязательств при разработке доклинических препаратов. Он обеспечивает современный п...

Одной из основных целей разработки современных лекарств является улучшение показателей успеха новых терапевтических средств в процессе открытия лекарств. Фармакологическое тестирование безопасности этих новых препаратов часто выявляет побочные реакции на сердечно-сосудистую систему, на которые приходится почти четверть коэффициента истощения препарата на доклинических стадиях1. Разработка и интеграция методологий нового подхода (NAM) играют ключевую роль в модернизации доклинической оценки, в частности основных аккумуляторных органов, таких как сердце. Поскольку эти методологии являются подходами, свободными от животных, использование моделей клеток на основе человека, таких как кардиомиоциты (КМ) индуцированного происхождения плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), стало рабочей лошадкой за последнее десятилетие для современной оценки фармакологических и токсикологических проблем безопасности2. Широко используемыми системами анализа для таких исследований являются микроэлектродная решетка (MEA) и чувствительные к напряжению экспериментальные подходы на основе красителей3.
Тем не менее, заявленная фенотипическая и функциональная незрелость этого типа клеток ставит препятствия на пути идеальной модели клеток на основе человека, с потенциалом для уменьшения трансляционных разрывов между неклиническими и клиническими исследованиями4.
На протяжении многих лет были проведены огромные исследования, чтобы понять причину подразумеваемого незрелого фенотипа и найти способы подтолкнуть процесс созревания человеческих iPSC-CMs in vitro.
Было показано, что отсутствие сигналов созревания сердца, таких как длительное время культивирования клеток, отсутствие других типов клеток поблизости или отсутствие гормональной стимуляции, влияет на процесс созревания5. Кроме того, нефизиологическая среда обычных пластин клеточных культур была идентифицирована как существенная причина, препятствующая созреванию человеческих iPSC-CM, из-за отсутствующей физиологической жесткости субстрата нативного сердца человека 5,6.
Для решения этой проблемы были разработаны различные системы анализа с акцентом на нативные физиологические условия, в том числе системы 3D-культур клеток, где клетки выровнены трехмерно, чтобы напоминать нативную сердечную архитектуру вместо типичных двумерных клеточных культур7. Хотя улучшенное созревание достигается с помощью 3D-анализов, потребность в квалифицированной рабочей силе и низкая пропускная способность этих систем препятствуют обильному использованию этого в процессе разработки лекарств, поскольку время и стоимость играют фундаментальную роль в оценке новых терапевтических средств на финансовом уровне8.
Важными показаниями для фармакологической и токсикологической оценки безопасности новых терапевтических средств являются изменения функциональных и структурных характеристик iPSC-КМ человека, поскольку индуцированные соединениями побочные реакции сердечно-сосудистой системы на лекарства обычно влияют на одно или оба из этих свойств 1,9. Известными примерами таких широких побочных реакций являются противораковые препараты семейства антрациклиновых. Здесь об опасных функциональных и неблагоприятных структурных воздействиях на сердечно-сосудистую систему широко сообщается во время и после лечения рака у пациентов, а также с помощью клеточных анализов in vitro 10,11.
В настоящем исследовании мы описываем комплексную методологию оценки как функциональных, так и структурных побочных эффектов соединений на hiPSC-CMs. Методология включает в себя анализ кардиомиоцитарной сократительной силы и импеданса/внеклеточного потенциала поля (EFP). Сократительная сила измеряется в физиологических механических условиях, при этом клетки культивируются на мягких (33 кПа) силиконовых субстратах, отражающих механическую среду нативной сердечной ткани человека.
Система оснащена 96-луночными пластинами для высокопроизводительного анализа iPSC-CMs человека для доклинических фармакологических и токсикологических исследований сердечной безопасности и, таким образом, обеспечивает преимущество для используемых в настоящее время 3D-подходов, таких как сердце Лангендорфа или сердечные срезы12,13.
В деталях гибридная система состоит из двух модулей, либо для оценки сократимости сердца в физиологических условиях, либо для анализа клеточной структурной токсичности в реальном времени 6,14. Оба модуля работают со специализированными высокопроизводительными 96-скважинными пластинами для быстрого и экономичного сбора данных.
Без необходимости в 3D-конструкции модуль сократимости использует специальные пластины, которые содержат гибкие силиконовые мембраны в качестве подложки для клеток вместо жесткого стекла или пластика, из которого обычно состоят обычные пластины клеточной культуры. Мембраны отражают типичные биомеханические свойства сердца человека и, следовательно, имитируют условия in vivo с высокой пропускной способностью. В то время как человеческие iPSC-CM часто не демонстрируют поведение взрослых кардиомиоцитов в отношении положительной инотропии, вызванной соединениями, в других клеточных анализах14, более взрослая реакция может быть оценена, когда клетки культивируются на пластинах модуля сократимости. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что iPSC-CMs проявляют положительные инотропные эффекты при обработке такими соединениями, как изопротеренол, S-Bay K8644 или омекамтивmecarbil 6,15. Здесь можно оценить несколько параметров сократимости, таких как первичные параметры, такие как амплитуда силы сжатия (мН/мм2), длительность биения и скорость биения, а также вторичные параметры цикла сжатия, такие как площадь под кривой, склоны сжатия и релаксации, вариации скорости биения и аритмии (дополнительный рисунок 1)16 . Медикаментозные изменения во всех параметрах оцениваются неинвазивно с помощью емкостного измерения расстояния. Необработанные данные впоследствии анализируются специализированным программным обеспечением.
Модуль структурной токсичности добавляет свои уникальные параметры импеданса и EFP в качестве показаний для структурной клеточной токсичности и анализа электрофизиологических свойств17,18. Технология электрической импедансной спектроскопии выявляет индуцированные соединениями изменения плотности клеток или целостности клеток и монослоев, контролируемые в режиме реального времени, как показано на человеческих iPSC-CM, обработанных известными кардиотоксическими соединениями13. При показаниях импеданса на разных частотах (1-100 кГц) можно дополнительно препарировать физиологический ответ, и, таким образом, достижимо выявление изменений в топографии мембраны, клеточно-клеточных или клеточно-матричных переходах. Дополнительная регистрация EFP человеческих iPSC-CMs дополнительно позволяет анализировать электрофизиологические эффекты, вызванные сложным лечением, как было показано в свете исследования CiPA17,19.
В настоящем исследовании использовались человеческие iPSC-CMs, получавшие эпирубицин и доксорубицин, которые хорошо описаны как кардиотоксические антрациклины, и эрлотиниб, ингибитор тирозинкиназы (TKI) с довольно низким риском сердечно-сосудистой токсичности. Хроническая оценка с применением эпирубицина, доксорубицина и эрлотиниба проводилась в течение 5 дней. Результат показывает незначительные изменения в сократимости и импедансе основания при обработке клеток эрлотинибом, но временное и дозозависимое токсическое снижение амплитуды сокращения и импеданса основания при лечении эпирубицином и доксорубицином соответственно. Острые измерения были выполнены с помощью блокатора кальциевых каналов нифедипина и показали снижение амплитуды сокращения, длительности потенциала поля и импеданса основания, демонстрируя кардиотоксические побочные эффекты этого соединения как на функциональном, так и на структурном уровнях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

Оценка сократимости сердца имеет огромное значение для разработки новых терапевтических средств и их безопасного перехода в клинические стадии. В то время как индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CMs), обещают служить в качестве актуальной для человека модели на доклинических этапах открытия лекарств и фармакологии безопасности, их зрелость все еще спорна в научном сообществе и находится в постоянном развитии. Мы представляем гибридную технологию сократимости и импеданса/внеклеточного потенциала поля (EFP), добавляя значительные функции про-созревания к стандартной платформе с 96 скважинами.
Система impedance/EFP контролирует функциональность сотовой связи в режиме реального времени. Помимо скорости биения сократительных клеток, показания электрической импедансной спектроскопии обнаруживают морфологические изменения, индуцированные соединениями, такие как плотность клеток и целостность клеточного монослоя. В другом компоненте гибридной системы анализа клеток клетки культивируются на биосоответствующих мембранах, которые имитируют механическую среду реальной сердечной ткани. Эта физиологическая среда поддерживает созревание hiPSC-CMs in vitro, что приводит к более взрослым сократительным реакциям, включая положительные инотропные эффекты после лечения изопротеренолом, S-Bay K8644 или омекамтивом мекарбилом. Такие параметры, как амплитуда силы сжатия (мН/мм2) и продолжительность биения, также выявляют последующие эффекты соединений с влиянием на электрофизиологические свойства и обработку кальция.
Гибридная система обеспечивает идеальный инструмент для целостного клеточного анализа, позволяя доклинической оценке сердечного риска выходить за рамки текущих перспектив клеточных анализов, связанных с человеком.

Влияние ингибитора киназы эрлотиниба на сократимость hiPSC-CMs показано на рисунке 1. Клетки обрабатывали концентрациями в диапазоне от 10 нМ до 10 мкМ в течение 5 дней и ежедневно регистрировали параметры биения. Эрлотиниб, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) и ингибит...

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Анализ изменений сократительной функции и клеточной целостности кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, имеет огромное значение для разработки доклинических препаратов. Гибридная система анализа клеток с 96 лунками рассматривает оба параметра в режиме реального времени и физиологическим образом для получения надежных, релевантных человеку результатов, необходимых для безопасного перехода к клиническим стадиям.

Гибридная система анализа клеток для оценки структурных и сократительных изменений кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, для доклинической оценки сердечного риска

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Метод может помочь ответить на доклинический вопрос, связанный с сердечной безопасностью и токсичностью, используя реальные человеческие данные для безопасного перехода новых кандидатов на лекарства в клинические стадии. Вместо использования набора различных методов in-vitro и in-vivo основным преимуществом этой гибридной системы является одновременная оценка кардиомиоцитов человека, полученных из iPC, электрофизиологических параметров и параметров жизнеспособности, а также анализ сократительных свойств в физиологических условиях. Этот метод может быть применен для открытия лекарственного средства, поскольку он охватывает электрофизиологические, структурные и сократительные изменения кардиомиоцитов и систему с более высокой пропускной способностью, которая позволяет одновременно тестировать 69 скважин.Чтобы начать покрытие пластины, оставьте нижнюю часть сжимающей пластины закрытой дополнительно поставляемой мембранной защитой до измерения в модуле сократимости. Для посева кардиомиоцитов готовят разбавленный раствор геля EHS путем переноса 2,75 миллилитров готового к использованию раствора геля EHS и 8,25 миллилитров DPBS с кальцием и магнием в стерильную центрифужную трубку. Затем перемешайте раствор.Снимите мембранную защиту с пластины сокращения. Перенесите приготовленный раствор покрытия в резервуар стерильных реагентов в роботе автоматизации лаборатории. Используйте программу, добавьте 100 микролитров с роботом автоматизации лаборатории и добавьте 100 микролитров раствора покрытия на скважину.Затем поместите крышку обратно на 96-луночную пластину и высиживайте в течение трех часов при температуре 37 градусов цельсия. После размораживания и подсчета клеток отрегулируйте ячейки в рекомендуемой гальванической среде в соответствии с инструкциями производителя клеток, в результате чего получится 11 раз по 10-шестая клетка на 11 миллилитров для посева всей 96-луночной пластины. Используйте программу удаления 100 микролитров для удаления раствора геля EHS из скважин с помощью робота автоматизации лаборатории.Затем переложите 11 миллилитров клеточной суспензии в резервуар стерильного реагента, помещенный в робота автоматизации лаборатории, и засейте клетки 100 микролитрами суспензии на лунку. С помощью программы клетки добавляют 100 микролитров. Сразу после посева клеток перенесите гибкую 96-луночную пластину в инкубатор с контролируемой влажностью при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, и дайте клеткам осесть на ночь.Теплые 22 миллилитра поддерживающей среды кардиомиоцитов добавляют к каждой пластине до 37 градусов Цельсия в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Через 18-24 часа после посева пластин переложите свежую среду в стерильный резервуар реагентов и оставьте ее рядом с роботом автоматизации лаборатории. Затем выполните удаление среды с помощью программы, удалите 100 микролитров.Далее поместите резервуар реагента, содержащий свежую среду, в робот автоматизации лаборатории и дозируйте 200 микролитров свежей среды на скважину с помощью программы, добавьте 100 микролитров. Выполните этот шаг дважды, чтобы достичь 200 микролитров на скважину. Сразу после обмена средой переложите пластину в инкубатор.Выполняйте средний обмен через день до добавления соединения. За четыре-шесть часов до добавления соединения выполняют окончательное изменение среды, перемещая 22 миллилитра свежего и теплого буфера анализа в стерильный резервуар реагентов и оставляя его рядом с роботом автоматизации лаборатории. Сразу после обмена среды перенесите гибкую пластину обратно в инкубатор.За час до начала базового измерения перенесите пластину на соответствующее измерительное устройство. В управляющем программном обеспечении откройте Edit Protocol и выберите соответствующий режим измерения, Flex Site или Impedance EFP. Определите продолжительность или длину одного измерения до 30 секунд и интервал повторения до 10 минут перед сохранением номера протокола.Затем выберите Запустить протокол и продолжайте заполнять запрашиваемые поля. Когда параметры будут заданы, выберите Начать измерение. Выполняйте как минимум три базовых измерения с пятиминутными интервалами незадолго до добавления соединения.Удаляют 50 микролитров пробирного буфера из каждой скважины, не снимая гибкую 96-луночную пластину с измерительного прибора, с последующим добавлением 50 микролитров четырехкратно концентрированного раствора соединения в каждую скважину пластины согласно плану измерений. После добавления соединения выберите маркер добавления реагента для определения компаундной пластины и объема раствора соединения. Затем выберите «Продолжить стандартное измерение» или «Перейти к сериям измерений» в соответствии с экспериментальным планом.Репрезентативный анализ показывает влияние ингибитора киназы Эрлотиниба на сократимость кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. При самой низкой концентрации Эрлотиниб индуцировал статистически незначимое снижение амплитуды, тогда как микромолярные концентрации Эрлотиниба демонстрировали временное и дозозависимое кардиотоксическое действие. Начало эффекта наблюдалось через 96 часов при приеме одного микромоляра Эрлотиниба, в то время как лечение 10 микромолярами Эрлотиниба приводило к значительному снижению через 24 часа после добавления соединения.После применения 10 микромолярного эпирубицина клетки переставали биться в течение 24 часов. При применении одного микромолярного эпирубицина резкое снижение амплитуды через 24 ч сопровождалось полным прекращением биения до 48 ч. На 100 наномолярах наблюдалось зависящее от времени уменьшение амплитуды биения.При самой низкой концентрации 10 наномоляров амплитуда неуклонно колебалась, подтверждая, что эффект эпирубицина был только дозозависимым. Лечение доксорубицином и нифедипином в течение 24 часов снижает жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и времени. При применении повышающих концентраций нифедипина записи потенциала поля на клетках выявляют концентрационно-зависимое укорочение нормируемой длительности поля.Оценка нифедипина в отношении сократимости сердца также показала значительное снижение амплитуды, зависящей от концентрации, при остром измерении с 10 наномолярными и 13 наномолярными концентрациями. Важно помнить, что клетки, как правило, чувствительны к параметрам окружающей среды, таким как изменения температуры и рН, а также к механическому моделированию, которое особенно поддерживается на пластинах сжатия.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Инкапсуляция кардиомиоцитов в Фибрин Гидрогель для сердечной тканевой инженерии

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Использование микромасштабных кремниевые зонды для оценки Сотовый сократительной функции<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Гибридная μCT-FMT изображений и анализа изображений

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Стандартизированные и масштабируемые анализ для изучения Перфированный 3D ангиогенной прорастания iPSC полученных эндотелиальных клеток в Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Человеческие iPSC-производные кардиомиоцитные сети на multiwell микро-электродные массивы для периодических действий Потенциальные записи

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Доклиническая кардиологическая электрофизиология по двойному напряжению и оптическому картированию кальция органов человеческого сердца

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...