Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio Federal Alemán de Asuntos Económicos y Acción Climática (ZIM) y del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (KMUinnovativ). Agradecemos a FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EE. UU.) por proporcionar amablemente cardiomiocitos y a Ncardia B.V. (Leiden, Países Bajos) por proporcionar amablemente cardiomiocitos, utilizados en este estudio.

NOTA: El flujo de trabajo para la medición de contractilidad e impedancia/EFP se da en la Figura complementaria 2.
1. Revestimiento de la placa
<ol><li>Abra el envase sellado al vacío y saque la placa de 96 pocillos. Los procedimientos de manipulación para las placas de 96 pocillos de ambos módulos son los mismos. Deje la placa de contracción cubierta por el protector de membrana suministrado adicionalmente hasta la medición en el módulo de contractil...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

El sistema híbrido de impedancia/EFP/contractilidad es una metodología integral para la evaluación farmacológica y toxicológica de seguridad de alto rendimiento de las responsabilidades cardíacas para el desarrollo preclínico de fármacos. Proporciona un enfoque moderno para las pruebas de seguridad preclínicas sin el uso de modelos animales, pero con mayores capacidades de rendimiento que reducen significativamente el tiempo y los costos. Este sistema tiene el potencial de ser utilizado como un enfoque complemen...

Uno de los principales objetivos del desarrollo de fármacos modernos es la mejora de la tasa de éxito de la mesa a la cama de nuevas terapias en la línea de descubrimiento de fármacos. Las pruebas farmacológicas de seguridad de estos nuevos fármacos a menudo revelan reacciones adversas al sistema cardiovascular que representan casi una cuarta parte de la tasa de deserción del fármaco en las etapas preclínicas1. El desarrollo y la integración de nuevas metodologías de enfoque (NAM) desempeñan un papel clave en la modernización de la evaluación preclínica, en particular los órganos centrales de la batería como el corazón. Dado que estas metodologías son enfoques libres de animales, el uso de modelos celulares basados en humanos como los cardiomiocitos (CM) de origen de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se convirtió en el caballo de batalla durante la última década para la evaluación moderna de cuestiones farmacológicas y toxicológicas de seguridad2. Los sistemas de ensayo ampliamente utilizados para tales investigaciones son la matriz de microelectrodos (MEA) y los enfoques experimentales basados en colorantes sensibles al voltaje3.
Sin embargo, la pretendida inmadurez fenotípica y funcional de este tipo celular pone obstáculos en el camino de un modelo celular ideal basado en humanos, con el potencial de reducir las brechas traslacionales entre los estudios no clínicos y clínicos4.
Se han realizado enormes investigaciones a lo largo de los años para comprender la razón del fenotipo inmaduro implícito y para encontrar formas de impulsar el proceso de maduración de los iPSC-CM humanos in vitro.
Se demostró que la falta de señales de maduración cardíaca, como tiempos prolongados de cultivo celular, ausencia de otros tipos celulares en la vecindad o falta de estimulación hormonal, afecta el proceso de maduración5. Además, el ambiente no fisiológico de las placas de cultivo celular regular fue identificado como una causa significativa que impide la maduración de las iPSC-CM humanas, debido a la rigidez del sustrato fisiológico faltante del corazón humano nativo 5,6.
Se desarrollaron diferentes sistemas de ensayo con un enfoque en las condiciones fisiológicas nativas para abordar este problema, incluidos los sistemas de cultivo celular 3D donde las células se alinean tridimensionalmente para parecerse a la arquitectura cardíaca nativa en lugar de los típicos cultivos celulares bidimensionales7. Aunque la maduración mejorada se obtiene con ensayos 3D, la necesidad de una mano de obra calificada y el bajo rendimiento de estos sistemas dificulta un uso abundante de esto en el proceso de desarrollo de fármacos, ya que el tiempo y el costo juegan un papel fundamental en la evaluación de nuevas terapias a nivel financiero8.
Las lecturas importantes para la evaluación farmacológica y toxicológica de la seguridad de nuevas terapias son los cambios en las características funcionales y estructurales de las iPSC-CM humanas, ya que las reacciones adversas del sistema cardiovascular inducidas por compuestos generalmente afectan una o ambas de estas propiedades 1,9. Ejemplos bien conocidos de reacciones adversas tan amplias son los medicamentos contra el cáncer de la familia de las antraciclinas. Aquí, los efectos funcionales y estructurales adversos peligrosos sobre el sistema cardiovascular son ampliamente reportados durante y después del tratamiento del cáncer en pacientes, así como con ensayos basados en células in vitro 10,11.
En el presente estudio, describimos una metodología integral para la evaluación de los efectos secundarios compuestos funcionales y estructurales en los hiPSC-CM. La metodología incluye el análisis de la fuerza contráctil de los cardiomiocitos y el análisis de impedancia/potencial de campo extracelular (EFP). La fuerza contráctil se mide en condiciones mecánicas fisiológicas, con las células cultivadas en sustratos de silicona blanda (33 kPa), lo que refleja el entorno mecánico del tejido cardíaco humano nativo.
El sistema está equipado con placas de 96 pocillos para el análisis de alto rendimiento de iPSC-CM humanos para estudios farmacológicos y toxicológicos preclínicos de seguridad cardíaca, y por lo tanto proporciona una ventaja a los enfoques 3D utilizados actualmente como el corazón de Langendorff o los cortes de corazón12,13.
En detalle, el sistema híbrido consta de dos módulos, ya sea para la evaluación de la contractilidad cardíaca en condiciones fisiológicas o para el análisis de la toxicidad estructural celular en tiempo real 6,14. Ambos módulos funcionan con placas especializadas de 96 pocillos de alto rendimiento para una adquisición de datos rápida y rentable.
Sin la necesidad de una construcción 3D, el módulo de contractilidad emplea placas especiales que contienen membranas de silicona flexibles como sustrato para las células en lugar del vidrio rígido o plástico en el que generalmente consisten las placas de cultivo celular regulares. Las membranas reflejan las propiedades biomecánicas típicas del corazón humano y, por lo tanto, imitan las condiciones in vivo de una manera de alto rendimiento. Mientras que las iPSC-CM humanas a menudo no muestran un comportamiento cardiomiocitario adulto con respecto a la inotropía positiva inducida por compuestos en otros ensayos basados en células14, se puede evaluar una reacción más adulta cuando las células se cultivan en las placas del módulo de contractilidad. En estudios previos, se ha demostrado que los iPSC-CM exhiben efectos inotrópicos positivos sobre el tratamiento con compuestos como isoproterenol, S-Bay K8644 u omecamtiv mecarbil 6,15. Aquí, se pueden evaluar múltiples parámetros de contractilidad, como parámetros primarios como la amplitud de la fuerza de contracción (mN / mm2), la duración del latido y la frecuencia de latido, así como parámetros secundarios del ciclo de contracción como el área debajo de la curva, las pendientes de contracción y relajación, las variaciones de la frecuencia de latido y las arritmias (Figura complementaria 1)16 . Los cambios inducidos por fármacos en todos los parámetros se evalúan de forma no invasiva mediante detección de distancia capacitiva. Los datos en bruto son analizados posteriormente por un software especializado.
El módulo de toxicidad estructural añade sus parámetros únicos de impedancia y EFP como lectura para la toxicidad celular estructural y el análisis de propiedades electrofisiológicas17,18. La tecnología de espectroscopia de impedancia eléctrica revela cambios inducidos por compuestos en la densidad celular o la integridad celular y monocapa monitoreados en tiempo real, como se muestra con iPSC-CMs humanos tratados con compuestos cardiotóxicos conocidos13. Con lecturas de impedancia a diferentes frecuencias (1-100 kHz) es posible diseccionar aún más una respuesta fisiológica, y así revelar cambios en la topografía de la membrana, las uniones célula-célula o célula-matriz es alcanzable. El registro adicional de EFP de iPSC-CMs humanas permite además el análisis de los efectos electrofisiológicos provocados por el tratamiento compuesto, como se demostró a la luz del estudio CiPA17,19.
En el presente estudio, se emplearon iPSC-CM humanos, tratados con epirrubicina y doxorrubicina, ambas bien descritas como antraciclinas cardiotóxicas, y erlotinib, un inhibidor de la tirosina cinasa (TKI) con un riesgo bastante bajo de toxicidad cardiovascular. La evaluación crónica con epirrubicina, doxorrubicina y erlotinib se realizó durante 5 días. El resultado muestra cambios menores en la contractilidad y la impedancia de base cuando las células fueron tratadas con erlotinib, pero una disminución tóxica dependiente del tiempo y la dosis en la amplitud de contracción y la impedancia de base cuando se trataron con epirrubicina y doxorrubicina respectivamente. Las mediciones agudas se realizaron con el bloqueador de los canales de calcio nifedipino y muestran una disminución en la amplitud de la contracción, la duración del potencial de campo y la impedancia base, demostrando efectos secundarios cardiotóxicos de este compuesto a nivel funcional y estructural.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

La evaluación de la contractilidad cardíaca es de inmensa importancia para el desarrollo de nuevas terapias y su transición segura a las etapas clínicas. Si bien los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) prometen servir como un modelo relevante para humanos en las fases preclínicas del descubrimiento de fármacos y la farmacología de seguridad, su madurez sigue siendo controvertida en la comunidad científica y en constante desarrollo. Presentamos una tecnología híbrida de contractilidad e impedancia / potencial de campo extracelular (EFP), agregando características significativas de pro-maduración a una plataforma de 96 pocillos estándar de la industria.
El sistema de impedancia/EFP monitorea la funcionalidad celular en tiempo real. Además de la velocidad de latido de las células contráctiles, las lecturas de espectroscopia de impedancia eléctrica detectan cambios morfológicos inducidos por compuestos, como la densidad celular y la integridad de la monocapa celular. En el otro componente del sistema de análisis de células híbridas, las células se cultivan en membranas biocompatibles que imitan el entorno mecánico del tejido cardíaco real. Este entorno fisiológico apoya la maduración de hiPSC-CMs in vitro, lo que lleva a respuestas contráctiles más adultas que incluyen efectos inotrópicos positivos después del tratamiento con isoproterenol, S-Bay K8644 u omecamtiv mecarbil. Parámetros como la amplitud de la fuerza de contracción (mN/mm2) y la duración del batido también revelan efectos posteriores de compuestos con influencia en las propiedades electrofisiológicas y el manejo del calcio.
El sistema híbrido proporciona la herramienta ideal para el análisis celular holístico, permitiendo la evaluación preclínica del riesgo cardíaco más allá de las perspectivas actuales de los ensayos basados en células relevantes para el ser humano.

Los efectos del inhibidor de la quinasa erlotinib sobre la contractilidad de los hiPSC-CM se muestran en la Figura 1. Las células fueron tratadas con concentraciones que oscilaron entre 10 nM y 10 μM durante 5 días y los parámetros de latido se registraron diariamente. Erlotinib, un EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) e inhibidor de la tirosina cinasa con un riesgo comparativamente bajo de cardiotoxicidad, tuvo una dosis menor y un efecto dependiente del tiempo sobre hi...

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Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

El análisis de los cambios en la función contráctil y la integridad celular de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC es de inmensa importancia para el desarrollo de fármacos no clínicos. Un sistema híbrido de análisis celular de 96 pocillos aborda ambos parámetros en tiempo real y de manera fisiológica para obtener resultados confiables y relevantes para el ser humano, necesarios para una transición segura a las etapas clínicas.

Sistema de análisis de células híbridas para evaluar cambios estructurales y contráctiles de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC para la evaluación preclínica del riesgo cardíaco

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

El método puede ayudar a responder preguntas preclínicas relacionadas con la seguridad cardíaca y la toxicidad utilizando datos reales basados en humanos para una transición segura de nuevos candidatos a fármacos a etapas clínicas. En lugar de utilizar un conjunto de diferentes técnicas in vitro e in vivo, la principal ventaja de este sistema híbrido es la evaluación simultánea de cardiomiocitos derivados de iPC, parámetros electrofisiológicos y de viabilidad humanos, y el análisis de las propiedades contráctiles en condiciones fisiológicas. Este método se puede aplicar para el descubrimiento de fármacos, ya que cubre cambios electrofisiológicos, estructurales y contráctiles de cardiomiocitos y un sistema de mayor rendimiento que permite la prueba de 69 pocillos simultáneamente.Para comenzar el recubrimiento de la placa, deje la parte inferior de la placa de contracción cubierta por el protector de membrana suministrado adicionalmente hasta la medición en el módulo de contractilidad. Para sembrar cardiomiocitos, prepare una solución diluida de recubrimiento de gel EHS transfiriendo 2,75 mililitros de solución de gel EHS lista para usar y 8,25 mililitros de DPBS con calcio y magnesio en un tubo de centrífuga estéril. Luego mezclar la solución.Retire el protector de membrana de la placa de contracción. Transfiera la solución de recubrimiento preparada a un depósito de reactivo estéril en el robot de automatización de laboratorio. Use el programa, agregue 100 microlitros con el robot de automatización de laboratorio y agregue 100 microlitros de la solución de recubrimiento por pozo.Luego vuelva a colocar la tapa en la placa de 96 pocillos e incube durante tres horas a 37 grados centígrados. Después de descongelar y contar las células, ajuste las celdas en el medio de recubrimiento recomendado de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la celda, lo que resulta en 11 veces 10 a la sexta celda por 11 mililitros para sembrar una placa completa de 96 pocillos. Utilice el programa de eliminación de 100 microlitros para eliminar la solución de gel EHS de los pozos con el robot de automatización de laboratorio.A continuación, transfiera los 11 mililitros de suspensión celular a un depósito de reactivo estéril colocado en el robot de automatización de laboratorio y siembre las células con 100 microlitros de suspensión por pocillo. Usando el programa, las células agregan 100 microlitros. Inmediatamente después de la siembra celular, transfiera la placa flexible de 96 pocillos a la incubadora con control de humedad a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, y deje que las células se asienten durante la noche.Calentar 22 mililitros de medio de mantenimiento de cardiomiocitos para agregar a cada placa a 37 grados centígrados en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. De 18 a 24 horas después de sembrar las placas, transfiera el medio fresco a un depósito de reactivo estéril y déjelo junto al robot de automatización de laboratorio. Luego realice la eliminación del medio con el programa, retire 100 microlitros.A continuación, coloque el depósito de reactivo que contiene el medio fresco en el robot de automatización de laboratorio y dispense 200 microlitros del medio fresco por pocillo con el programa, agregue 100 microlitros. Realiza este paso dos veces para llegar a los 200 microlitros por pocillo. Inmediatamente después del intercambio medio, transfiera la placa a la incubadora.Realice un intercambio medio cada dos días hasta la adición compuesta. De cuatro a seis horas antes de la adición del compuesto, realice un cambio final del medio transfiriendo 22 mililitros de tampón de ensayo fresco y caliente a un depósito de reactivo estéril y dejándolo al lado del robot de automatización de laboratorio. Inmediatamente después del intercambio medio, transfiera la placa flexible de nuevo a la incubadora.Una hora antes de la medición de referencia, transfiera la placa al dispositivo de medición correspondiente. En el software de control, abra Editar protocolo y seleccione el modo de medición, el sitio flexible o la impedancia EFP respectivos. Defina la duración o longitud del barrido de una medida a 30 segundos y un intervalo de repetición a 10 minutos antes de guardar el número de protocolo.A continuación, seleccione Iniciar protocolo y continúe rellenando los campos solicitados. Cuando se establezcan los parámetros, seleccione Iniciar medición. Realice un mínimo de tres mediciones de referencia en intervalos de cinco minutos poco antes de la adición del compuesto.Retire 50 microlitros del tampón de ensayo de cada pocillo sin retirar la placa flexible de 96 pocillos del dispositivo de medición, seguido de la adición de 50 microlitros de la solución compuesta cuatro veces concentrada en cada pocillo de la placa de acuerdo con el plan de medición. Después de la adición compuesta, seleccione agregar marcador de reactivo para definir el diseño de la placa compuesta y el volumen de la solución compuesta. A continuación, seleccione Continuar con la medición estándar o continuar con la serie de mediciones de acuerdo con el plan experimental.El análisis representativo muestra los efectos del inhibidor de quinasa Erlotinib sobre la contractilidad de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. A la concentración más baja, Erlotinib indujo una disminución estadísticamente insignificante en la amplitud, mientras que las concentraciones micromolares de Erlotinib mostraron efectos cardiotóxicos dependientes del tiempo y la dosis. El inicio del efecto se observó a partir de las 96 horas con un Erlotinib micromolar, mientras que el tratamiento con 10 micromolares de Erlotinib dio lugar a una disminución significativa 24 horas después de la adición del compuesto.Después de la aplicación de 10 micromolares de epirrubicina, las células dejaron de latir en 24 horas. Con la aplicación de una epirrubicina micromolar, una disminución drástica de la amplitud después de 24 horas fue seguida por el cese completo de la latido hasta las 48 horas. A 100 nanomolares, se observó una disminución dependiente del tiempo en la amplitud del latido.En la concentración más baja de 10 nanomolares, la amplitud fluctuó constantemente, confirmando que el efecto de la epirubicina era sólo dependiente de la dosis. El tratamiento con doxorrubicina y nifedipina durante 24 horas reduce la viabilidad celular de forma dependiente de la concentración y el tiempo. Tras la aplicación de concentraciones crecientes de nifedipina, los registros de potencial de campo en las células revelan un acortamiento dependiente de la concentración de la duración del campo normalizado.La evaluación de nifedipino con respecto a la contractilidad cardíaca también mostró una disminución significativa de la amplitud dependiente de la concentración en la medición aguda con concentraciones de 10 nanomolares y 13 nanomolares. Es importante recordar que las células son generalmente sensibles a los parámetros ambientales como los cambios de temperatura y pH, así como a la simulación mecánica que se apoya especialmente en las placas de contracción.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

La encapsulación de los cardiomiocitos en un hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Investigación

Bioingeniería

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

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Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Redes de cardiomiocitos derivados de iPSC humanos en matrices de microelectrodos multipolos para grabaciones potenciales de acción recurrente

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...