Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Detta arbete stöddes av bidrag från det tyska federala ministeriet för ekonomi och klimatåtgärder (ZIM) och från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (KMUinnovativ). Vi tackar FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) för att vänligen tillhandahålla kardiomyocyter och Ncardia B.V. (Leiden, Nederländerna) för att vänligen tillhandahålla kardiomyocyter, som används i denna studie.

OBS: Arbetsflödet för kontraktilitet och impedans/EFP-mätning anges i tilläggsfigur 2.
1. Plåtbeläggning
<ol><li>Öppna den vakuumförseglade förpackningen och ta ut 96-brunnsplattan. Hanteringsprocedurer för 96-brunnsplattor av båda modulerna är desamma. Låt kontraktionsplattan täckas av det extra medföljande membranskyddet tills mätning i kontraktilitetsmodulen.</li>
	<li>Täck de flexibla 96-brunnsplattorna för sådd av kardiomyocyter.<ol><...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

Hybridsystemet impedans/EFP/kontraktilitet är en omfattande metod för farmakologisk och toxikologisk bedömning av hjärtskulder för preklinisk läkemedelsutveckling med hög genomströmning. Det ger ett modernt tillvägagångssätt för preklinisk säkerhetstestning utan användning av djurmodeller, men med högre genomströmningskapacitet som avsevärt minskar tid och kostnader. Detta system har potential att användas som ett kompletterande tillvägagångssätt för Langendorff Heart och andra djurmodeller för pre...

Ett av de viktigaste målen med modern läkemedelsutveckling är att förbättra framgångsgraden från bänk till säng för nya terapier i pipelinen för läkemedelsupptäckt. Säkerhetsfarmakologiska tester av dessa nya läkemedel avslöjar ofta biverkningar på hjärt-kärlsystemet som står för nästan en fjärdedel av läkemedelsförlusten vid prekliniska stadier1. Utvecklingen och integrationen av nya metodmetoder (NAMs) spelar en nyckelroll i moderniseringen av preklinisk bedömning, särskilt kärnbatteriorgan som hjärtat. Eftersom dessa metoder är djurfria tillvägagångssätt blev användningen av människobaserade cellmodeller som kardiomyocyter (CM) av inducerat pluripotent stamcellsursprung (iPSC) arbetshästen under det senaste decenniet för den moderna bedömningen av säkerhetsfarmakologiska och toxikologiska frågor2. Allmänt använda analyssystem för sådana undersökningar är mikroelektrodmatris (MEA) och spänningskänsliga färgämnesbaserade experimentella metoder3.
Icke desto mindre sätter den påstådda fenotypiska och funktionella omogenheten av denna celltyp hinder i vägen för en idealisk människobaserad cellmodell, med potential att minska translationella luckor mellan icke-kliniska och kliniska studier4.
Enorm forskning har genomförts genom åren för att förstå orsaken till den underförstådda omogna fenotypen och för att hitta sätt att driva mognadsprocessen för humana iPSC-CMs in vitro.
Brist på hjärtmognadssignaler som förlängda cellodlingstider, frånvaro av andra celltyper i närheten eller brist på hormonell stimulering visade sig påverka mognadsprocessen5. Den icke-fysiologiska miljön hos vanliga cellodlingsplattor identifierades också som en signifikant orsak som hindrar mognaden av humana iPSC-CM på grund av den saknade fysiologiska substratstyvheten hos det ursprungliga mänskliga hjärtat 5,6.
Olika analyssystem med fokus på inhemska fysiologiska förhållanden utvecklades för att hantera denna fråga, inklusive 3D-cellodlingssystem där celler är inriktade tredimensionellt för att likna inhemsk hjärtarkitektur istället för typiska tvådimensionella cellkulturer7. Även om förbättrad mognad uppnås med 3D-analyser, hindrar behovet av en kvalificerad arbetskraft och den låga genomströmningen av dessa system en riklig användning av detta i läkemedelsutvecklingsprocessen, eftersom tid och kostnad spelar en grundläggande roll i bedömningen av nya terapier på finansiell nivå8.
Viktiga avläsningar för säkerhetsfarmakologisk och toxikologisk bedömning av nya terapier är förändringar i funktionella och strukturella egenskaper hos humana iPSC-CM, eftersom sammansatta inducerade biverkningar i hjärt-kärlsystemet vanligtvis påverkar en eller båda av dessa egenskaper 1,9. Välkända exempel på sådana breda biverkningar är läkemedel mot cancer i antracyklinfamiljen. Här rapporteras farliga funktionella och negativa strukturella effekter på hjärt-kärlsystemet i stor utsträckning under och efter cancerbehandling hos patienter samt med in vitro-cellbaserade analyser10,11.
I den aktuella studien beskriver vi en omfattande metodik för bedömning av både funktionella och strukturella sammansatta biverkningar på hiPSC-CM. Metodiken inkluderar analys av kardiomyocytkontraktil kraft och impedans / extracellulär fältpotential (EFP) analys. Den kontraktila kraften mäts under fysiologiska mekaniska förhållanden, med cellerna odlade på mjuka (33 kPa) silikonsubstrat, vilket återspeglar den mekaniska miljön i naturlig mänsklig hjärtvävnad.
Systemet är utrustat med 96-brunnsplattor för analys med hög genomströmning av humana iPSC-CM för prekliniska hjärtsäkerhetsfarmakologiska och toxikologiska studier, och ger därmed en fördel för för närvarande använda 3D-metoder som Langendorff-hjärta eller hjärtskivor12,13.
I detalj består hybridsystemet av två moduler, antingen för bedömning av hjärtkontraktilitet under fysiologiska förhållanden eller analys av cellulär strukturell toxiciteti realtid 6,14. Båda modulerna arbetar med specialiserade 96-brunnsplattor med hög genomströmning för snabb och kostnadseffektiv datainsamling.
Utan behov av en 3D-konstruktion använder kontraktilitetsmodulen specialplattor som innehåller flexibla silikonmembran som substrat för cellerna istället för det styva glaset eller plasten som vanliga cellodlingsplattor vanligtvis består av. Membranen återspeglar typiska humana biomekaniska hjärtegenskaper och efterliknar därför in vivo-förhållanden på ett sätt med hög genomströmning. Medan humana iPSC-CMs ofta misslyckas med att visa vuxen kardiomyocytbeteende angående sammansatt inducerad positiv inotropi i andra cellbaserade analyser14, kan en mer vuxenliknande reaktion bedömas när cellerna odlas på plattorna i kontraktilitetsmodulen. I tidigare studier har det visats att iPSC-CM uppvisar positiva inotropa effekter vid behandling med föreningar som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Här kan flera kontraktilitetsparametrar bedömas, såsom primära parametrar som amplituden för sammandragningskraft (mN / mm2), slagvaraktighet och slaghastighet, samt sekundära parametrar för kontraktionscykeln som område under kurvan, sammandragning och avslappningslutningar, takthastighetsvariationer och arytmier (kompletterande figur 1)16 . Läkemedelsinducerade förändringar i alla parametrar bedöms icke-invasivt genom kapacitiv avståndsavkänning. Rådata analyseras därefter av specialiserad programvara.
Den strukturella toxicitetsmodulen lägger till sina unika impedans- och EFP-parametrar som en avläsning för strukturell cellulär toxicitet och analys av elektrofysiologiska egenskaper17,18. Den elektriska impedansspektroskopitekniken avslöjar föreningsinducerade förändringar i celldensitet eller cell- och monolagerintegritet övervakad i realtid, vilket visas med humana iPSC-CM behandlade med kända kardiotoxiska föreningar13. Med impedansavläsningar vid olika frekvenser (1-100 kHz) är det möjligt att dissekera ett fysiologiskt svar ytterligare, och därmed är det möjligt att avslöja förändringar i membrantopografi, cell-cell- eller cellmatriskorsningar. Den ytterligare EFP-registreringen av humana iPSC-CM möjliggör ytterligare analys av elektrofysiologiska effekter som framkallas av föreningsbehandling, vilket visades i ljuset av CiPA-studien17,19.
I den aktuella studien användes humana iPSC-CM, behandlade med epirubicin och doxorubicin, båda väl beskrivna som kardiotoxiska antracykliner, och erlotinib, en tyrosinkinashämmare (TKI) med en ganska låg risk för kardiovaskulär toxicitet. Kronisk bedömning med epirubicin, doxorubicin och erlotinib utfördes i 5 dagar. Resultatet visar mindre förändringar i kontraktilitet och basimpedans när celler behandlades med erlotinib, men en tids- och dosberoende toxisk minskning av kontraktionsamplitud och basimpedans vid behandling med epirubicin respektive doxorubicin. Akuta mätningar utfördes med kalciumkanalblockeraren nifedipin och visar en minskning av sammandragningsamplituden, fältpotentialvaraktighet och basimpedans, vilket visar kardiotoxiska biverkningar av denna förening på funktionella såväl som strukturella nivåer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

Hjärtkontraktilitetsbedömning är av enorm betydelse för utvecklingen av nya terapier och deras säkra övergång till kliniska stadier. Medan humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) lovar att fungera som en människorelevant modell i prekliniska faser av läkemedelsupptäckt och säkerhetsfarmakologi, är deras mognad fortfarande kontroversiell i det vetenskapliga samfundet och under ständig utveckling. Vi presenterar en hybridkontraktilitet och impedans/extracellulär fältpotential (EFP) -teknik, vilket ger betydande pro-mognadsfunktioner till en branschstandard 96-brunnsplattform.
Impedansen/EFP-systemet övervakar mobilfunktionaliteten i realtid. Förutom takthastigheten för kontraktila celler upptäcker de elektriska impedansspektroskopiavläsningarna föreningsinducerade morfologiska förändringar som celldensitet och integritet hos det cellulära monoskiktet. I den andra komponenten i hybridcellanalyssystemet odlas cellerna på biokompatibla membran som efterliknar den mekaniska miljön i verklig hjärtvävnad. Denna fysiologiska miljö stöder mognad av hiPSC-CMs in vitro, vilket leder till mer vuxenliknande kontraktila svar inklusive positiva inotropa effekter efter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametrar som amplituden för sammandragningskraft (mN/mm2) och slagvaraktighet avslöjar också nedströmseffekter av föreningar med påverkan på elektrofysiologiska egenskaper och kalciumhantering.
Hybridsystemet ger det perfekta verktyget för holistisk cellanalys, vilket möjliggör preklinisk hjärtriskbedömning utöver de nuvarande perspektiven för humanrelevanta cellbaserade analyser.

Effekterna av kinashämmare erlotinib på kontraktiliteten hos hiPSC-CM visas i figur 1. Cellerna behandlades med koncentrationer från 10 nM till 10 μM i 5 dagar och beatparametrar registrerades dagligen. Erlotinib, en EGFR (epidermal tillväxtfaktorreceptor) och tyrosinkinashämmare med en jämförelsevis låg risk för kardiotoxicitet, hade en mindre dos och tidsberoende effekt på hiPSC-CM endast vid koncentrationer i det mikromolära intervallet. Vid den lägsta koncentrationen (10 nM)...

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Analysen av förändringar i kontraktil funktion och cellulär integritet hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter är av enorm betydelse för icke-klinisk läkemedelsutveckling. Ett hybrid 96-brunns cellanalyssystem adresserar båda parametrarna på ett realtids- och fysiologiskt sätt för tillförlitliga, människorelevanta resultat, nödvändiga för en säker övergång till kliniska stadier.

Hybridcellanalyssystem för att bedöma strukturella och kontraktila förändringar av humana iPSC-härledda kardiomyocyter för preklinisk hjärtriskutvärdering

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Metoden kan hjälpa till att svara på prekliniska hjärtsäkerhets- och toxicitetsrelaterade frågor med hjälp av verkliga humanbaserade data för en säker övergång av nya läkemedelskandidater till kliniska stadier. Istället för att använda en uppsättning olika in vitro- och in vivo-tekniker är den största fördelen med detta hybridsystem samtidig bedömning av humana iPC-härledda kardiomyocyt-, elektrofysiologiska och viabilitetsparametrar och analys av kontraktila egenskaper under fysiologiska förhållanden. Denna metod kan tillämpas för läkemedelsupptäckt eftersom den täcker elektrofysiologiska, strukturella och kontraktila förändringar av kardiomyocyter och ett högre genomströmningssystem som möjliggör testning av 69 brunnar samtidigt.För att påbörja plåtbeläggningen, låt botten av sammandragningsplattan täckas av det extra medföljande membranskyddet tills mätning i kontraktilitetsmodulen. För sådd av kardiomyocyter, förbered en utspädd EHS-gelbeläggningslösning genom att överföra 2,75 ml EHS-gel färdig att använda lösning och 8,25 ml DPBS med kalcium och magnesium i ett sterilt centrifugrör. Blanda sedan lösningen.Ta bort membranskyddet från sammandragningsplattan. Överför den beredda beläggningslösningen till en steril reagensbehållare i laboratorieautomationsroboten. Använd programmet, tillsätt 100 mikroliter med labbautomatiseringsroboten och tillsätt 100 mikroliter beläggningslösning per brunn.Lägg sedan tillbaka locket på 96-brunnsplattan och inkubera i tre timmar vid 37 grader Celsius. Efter upptining och räkning av cellerna, justera cellerna i det rekommenderade pläteringsmediet enligt celltillverkarens instruktioner, vilket resulterar i 11 gånger 10 till sjätte celler per 11 ml för sådd av en hel 96-brunnsplatta. Använd programmet ta bort 100 mikroliter för att ta bort EHS-gellösningen från brunnarna med labbautomatiseringsroboten.Överför sedan 11 ml cellsuspension till en steril reagensbehållare placerad i laboratorieautomationsroboten och frö cellerna med 100 mikroliter suspension per brunn. Med hjälp av programmet lägger celler till 100 mikroliter. Omedelbart efter cellsådd, överför den flexibla 96-brunnsplattan till den fuktstyrda inkubatorn vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och låt cellerna sätta sig över natten.Värm 22 ml kardiomyocytunderhållsmedium som ska tillsättas till varje platta till 37 grader Celsius i ett 50 ml centrifugrör. 18 till 24 timmar efter sådd av plattorna, överför det färska mediet till en steril reagensbehållare och lämna den bredvid labbautomatiseringsroboten. Utför sedan medium borttagning med programmet, ta bort 100 mikroliter.Placera sedan reagensbehållaren som innehåller det färska mediet i laboratorieautomationsroboten och dosera 200 mikroliter av det färska mediet per brunn med programmet, tillsätt 100 mikroliter. Utför detta steg två gånger för att nå 200 mikroliter per brunn. Omedelbart efter medium utbyte, överför plattan till inkubatorn.Utför ett medium utbyte varannan dag tills sammansatt tillsats. Fyra till sex timmar före tillsats av föreningar utför du en slutlig mediumförändring genom att överföra 22 ml färsk och varm analysbuffert till en steril reagensbehållare och lämna den bredvid labbautomatiseringsroboten. Omedelbart efter medium utbyte överför den flexibla plattan tillbaka till inkubatorn.En timme före baslinjemätningen överför plattan till respektive mätanordning. I kontrollprogramvaran öppnar du Edit Protocol och väljer respektive mätläge, Flex Site eller Impedance EFP. Definiera sveplängden eller längden för en mätning till 30 sekunder och ett repetitionsintervall till 10 minuter innan du sparar protokollnumret.Välj sedan Starta protokoll och fortsätt att fylla i de begärda fälten. När parametrarna har angetts väljer du Starta mätning. Utför minst tre baslinjemätningar i fem minuters intervall strax före sammansatt tillsats.Ta bort 50 mikroliter av analysbufferten från varje brunn utan att ta bort den flexibla 96-brunnsplattan från mätanordningen, följt av tillsats av 50 mikroliter av den fyra gånger koncentrerade sammansatta lösningen i varje brunn på plattan enligt mätplanen. Efter tillsats av förening väljer du lägg till reagensmarkör för att definiera den sammansatta plattans layout och volymen av den sammansatta lösningen. Välj sedan Fortsätt med standardmätning eller fortsätt med mätserier enligt experimentplanen.Den representativa analysen visar effekterna av kinashämmaren Erlotinib på kontraktiliteten hos humana iPSC-härledda kardiomyocyter. Vid den lägsta koncentrationen inducerade Erlotinib en statistiskt obetydlig minskning av amplituden, medan mikromolära koncentrationer av Erlotinib visade tids- och dosberoende kardiotoxiska effekter. Effekten sågs från 96 timmar med en mikromolär Erlotinib, medan behandling med 10 mikromolära Erlotinib resulterade i en signifikant minskning 24 timmar efter sammansatt tillsats.Efter appliceringen av 10 mikromolära Epirubicin upphörde cellerna att slå inom 24 timmar. Med appliceringen av ett mikromolärt Epirubicin följdes en drastisk minskning av amplituden efter 24 timmar av fullständigt taktstopp till 48 timmar. Vid 100 nanomolar observerades en tidsberoende minskning av taktamplituden.Vid den lägsta koncentrationen av 10 nanomolar fluktuerade amplituden stadigt, vilket bekräftade att effekten av Epirubicin endast var dosberoende. Behandlingen med Doxorubicin och Nifedipin i 24 timmar minskar cellviabiliteten på ett koncentrations- och tidsberoende sätt. Vid applicering av ökande nifedipinkoncentrationer avslöjar fältpotentialinspelningar på celler en koncentrationsberoende förkortning av fältvaraktigheten normaliserad.Nifedipinbedömning avseende hjärtkontraktilitet visade också en signifikant koncentrationsberoende amplitudminskning vid akut mätning med 10 nanomolära och 13 nanomolära koncentrationer. Det är viktigt att komma ihåg att cellerna i allmänhet är känsliga för miljöparametrar som temperatur- och pH-förändringar samt mekanisk simulering som särskilt stöds på sammandragningsplattorna.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapsling av Cardiomyocytes i en Fibrin Hydrogel för hjärtvävnad Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelat mikroskopi för 3D Strukturell Analys av dynamisk samverkan

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utnyttjande av Microscale Silicon Konsoler att bedöma Cellular kontraktila funktion<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid μCT-FMT bildbehandling och bildanalys

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardiserad och skalbar analys för att studera Parfymiserad 3D angiogen Sprouting av iPSC-härledda endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Humana iPSC-härledda Kardiomyocyte nätverk på Multiwell Micro-elektrod arrayer för återkommande åtgärder potentiella inspelningar

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjärtelektrofysiologisk bedömning av dubbel spänning och kalciumoptisk kartläggning av mänskliga organotypiska hjärtskivor

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...