Name: sperm collection and computer-assisted sperm analysis in the teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2022-10-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Norges universitet för livsvetenskaper och det amerikanska Fulbright-programmet. Författarna vill tacka Anthony Peltier och Lourdes Carreon G Tan vid NMBU för underhåll av fiskanläggningar och Guillaume Gourmelin från ISC LPGP vid INRAE (Frankrike) för att ha tillhandahållit fisk- och laboratorieutrymme för att ytterligare testa dessa metoder.

Alla försök och djurhantering utfördes i enlighet med rekommendationerna om försöksdjurens välbefinnande vid Norges biovetenskapliga universitet (NMBU). Experimenten utfördes med vuxen (6-9 månader gammal) manlig japansk medaka (Hd-rR-stam) uppvuxen vid NMBU (Ås, Norge). Metoderna testades också kort i 9 månader gammal manlig japansk medaka (CAB-stam) uppvuxen vid National Research Institute for Agriculture, Food, and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrike).
1. Beredning av...

Osmolalitet är en viktig faktor vid aktivering av fisksperma36,37. I allmänhet är spermier immotila i testiklarna och blir rörliga i media som är hyperosmotiska i förhållande till sädesvätska för marina fiskar och hypo-osmotiska i förhållande till sädesvätska för sötvattensfiskar37. I likhet med blod är sädesplasma i sötvattensfiskar vanligtvis lägre än hos marina fiskar (cirka 300 mOsmol/kg jämfört med 400 mOsmol/kg...

Japansk medaka är en liten, äggläggande sötvattensteleostfisk som är infödd i Östasien. Medaka har blivit ett utmärkt modellsystem för ryggradsdjur för ekotoxikologi, utvecklingsgenetik, genomik och evolutionsbiologi och fysiologistudier 1,2. I likhet med den populära zebrafisken är de relativt lätta att odla och mycket resistenta mot många vanliga fisksjukdomar 1,2. Det finns flera fördelar med att använda medaka som modell, inklusive en kort generationstid, transparenta embryon 1,2 och ett sekvenserat genom3. Till skillnad från zebrafisk har medaka en könsbestämmande gen 4 samt en hög temperatur (från4-40 °C) och salthalt (euryhalinarter) tolerans5. Dessutom har många genetiska och anatomiska verktyg, liksom protokoll 6,7,8,9,10,11,12, utvecklats i medaka för att underlätta studien av dess biologi.
Reproduktion är en viktig fysiologisk funktion eftersom det gör det möjligt för en art att fortsätta. Ryggradsdjurens reproduktion kräver en myriad av exakt orkestrerade händelser, inklusive produktion av oocyter hos kvinnor och produktion av spermier hos män. Spermier är unika celler, producerade genom den komplexa processen med spermatogenes, där det finns ett antal kontrollpunkter på plats för att garantera leverans av en högkvalitativ produkt13. Könscellskvalitet har blivit ett fokus i vattenbruks- och fiskpopulationsstudier på grund av dess inverkan på gödslingsframgång och larvöverlevnad. Spermiekvalitet är därför en viktig indikator på manlig fertilitet hos ryggradsdjur.
Tre användbara faktorer för att bedöma fiskspermakvalitet är rörlighet, progressivitet och livslängd. Procentmotilitet och progressiv rörlighet är vanliga indikatorer på spermiekvalitet eftersom progressiv rörelse är nödvändig för och korrelerar starkt med befruktningsframgång14,15. Rörelsens varaktighet är också en viktig indikator hos fisk eftersom spermierna förblir helt rörliga i mindre än 2 minuter hos de flesta teleostarter och spermiernas bana i allmänhet är mindre linjär än hos däggdjur15. Många studier som bedömde spermiernas rörlighet förlitade sig emellertid tidigare på subjektiva eller semikvantitativa metoder för att analysera spermier15,16. Till exempel har spermiernas rörlighet i medaka tidigare uppskattats visuellt under ett mikroskop17. Det har också uppskattats genom att registrera spermiernas rörelse och använda bildprogramvara för att slå samman ramar och mäta simväg och hastighet18,19,20. Sådana tillvägagångssätt saknar ofta robusthet, vilket ger olika resultat beroende på den person som utför analysen15,21.
Datorstödd spermieanalys (CASA) utvecklades ursprungligen för däggdjur. CASA är en snabb kvantitativ metod för att bedöma spermiekvaliteten genom att registrera och mäta hastighet och bana på ett automatiserat sätt15. Hos fiskar har den använts i olika arter för att övervaka effekterna av flera vattenföroreningar på spermiekvaliteten, för att identifiera intressanta förfäder för att förbättra stamstocken, för att förbättra effektiviteten i kryokonservering och lagring och för att optimera förhållandena för befruktning15. Därför är det ett kraftfullt verktyg för att på ett tillförlitligt sätt bedöma spermiekvaliteten hos olika ryggradsdjur. På grund av den viktiga mångfalden i reproduktionsstrategier mellan fiskar skiljer sig dock spermierna från teleostfisk från däggdjur och från en fiskart till en annan. Teleostfisk, som främst befruktar ägg externt genom att släppa ut könsceller i vatten, har högkoncentrerade spermier som är relativt enkla i struktur utan akrosom, till skillnad från däggdjur, som gödslar internt och därför inte behöver kompensera för utspädning i vatten, men måste tåla mer viskösa vätskor14. Dessutom rör sig spermier från de flesta fiskar snabbt men är helt rörliga i mindre än 2 minuter efter aktivering, även om det finns flera undantag15,22. Eftersom rörligheten kan minska snabbt hos de flesta fiskar, bör extrem försiktighet iakttas med tidpunkten för analys efter aktivering vid bestämning av ett spermieanalysprotokoll för fisk.
Reproduktion är ett av de områden inom biologin där teleostar och medaka har använts i stor utsträckning som modellorganismer. Faktum är att medaka-män visar intressanta reproduktiva och sociala beteenden, till exempel kompisvakt23,24. Dessutom finns flera transgena linjer för att studera den neuroendokrina kontrollen av reproduktion i denna art25,26,27. Spermieprovtagning, ett förfarande som är relativt enkelt i större fiskar, kan vara mer komplicerat i små modellfiskar eftersom de producerar mindre spermier och är mer känsliga. Av denna anledning, de flesta studier som involverar spermieprovtagning i medaka extrakt milt (fisksperma) genom att krossa dissekerade testiklar 17,28,29,30. Några studier använder också en modifierad bukmassage för att uttrycka milten direkt till aktiverande medium18,19,20; Men med denna metod är det svårt att visualisera mängden och färgen på milt extraherad. I zebrafisk används bukmassage vanligtvis för att uttrycka milt, som omedelbart samlas i ett kapillärrör31,32,33. Denna metod möjliggör uppskattning av volymen av milt, samt observation av ejakulerad färg, vilket är en snabb och enkel indikator på spermiekvalitet32,33. Därför saknas ett tydligt och väl beskrivet protokoll för spermauppsamling och analys för medaka.
Denna artikel beskriver därför två metoder för spermieuppsamling i den lilla modellen fisk japansk medaka: testiklar dissektion och bukmassage med kapillärrör. Det visar att båda metoderna är möjliga för medaka och visar att bukmassage kan utföras ett upprepat antal gånger eftersom fisken snabbt återhämtar sig från proceduren. Det beskriver också ett protokoll för datorstödd spermieanalys i medaka för att på ett tillförlitligt sätt mäta flera viktiga indikatorer på medaka spermiekvalitet (rörlighet, progressivitet, livslängd och relativ spermiekoncentration). Dessa procedurer, specificerade för denna användbara lilla teleostmodell, kommer att öka förståelsen för de miljömässiga, fysiologiska och genetiska faktorer som påverkar fertiliteten hos ryggradsdjur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective with phase contrast</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP90100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-c-s</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt smooth forceps</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20 micron counting chamber slide</td>
			<td>Microptic</td>
			<td>20.2.25&#160;</td>
			<td>Leja 2 chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>H8264-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding sponge</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCA Evolution</td>
			<td>Microptic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortex</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1301B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection and computer-assisted sperm analysis in the teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Japansk medaka (Oryzias latipes) är en teleostfisk och en framväxande ryggradsdjursmodell för ekotoxikologi, utvecklings-, genetik- och fysiologiforskning. Medaka används också i stor utsträckning för att undersöka ryggradsdjurens reproduktion, vilket är en viktig biologisk funktion eftersom det gör att en art kan fortsätta. Spermiekvalitet är en viktig indikator på manlig fertilitet och därmed reproduktionsframgång. Tekniker för att extrahera spermier och spermieanalys är väl dokumenterade för många arter, inklusive teleostfisk. Att samla spermier är relativt enkelt i större fiskar men kan vara mer komplicerat i små modellfiskar eftersom de producerar mindre spermier och är mer känsliga. Denna artikel beskriver därför två metoder för spermauppsamling i den lilla modellfisken, japansk medaka: testiklardissektion och bukmassage. Detta dokument visar att båda tillvägagångssätten är möjliga för medaka och visar att bukmassage kan utföras ett upprepat antal gånger eftersom fisken snabbt återhämtar sig från proceduren. Denna artikel beskriver också ett protokoll för datorstödd spermieanalys i medaka för att objektivt bedöma flera viktiga indikatorer på medaka spermiekvalitet (rörlighet, progressivitet, varaktighet av rörlighet, relativ koncentration). Dessa procedurer, specificerade för denna användbara lilla teleostmodell, kommer att öka förståelsen för de miljömässiga, fysiologiska och genetiska faktorer som påverkar fertiliteten hos ryggradsdjur.

Typ av erhållna data Spermiemotilitetsanalys från SCA Evolution-programvaran ger data om rörlighet (procentandel rörliga och immotila spermier), samt progressivitet (procentandel progressiva och icke-progressiva spermier) och hastighet (procentandel av snabba, medelstora och långsamma spermier). Den kombinerar också progressivitet och hastighet (snabb progressiv, medium progressiv, icke-progressiv). Dessa etiketter är baserade på mätningar (figur 3A) och beräkni...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Denna artikel beskriver två snabba och effektiva metoder för att samla spermier från den lilla modellen fisk medaka (Oryzias latipes), samt ett protokoll för tillförlitlig bedömning av spermiekvalitet med hjälp av datorstödd spermieanalys (CASA).

Spermieuppsamling och datorstödd spermieanalys i teleostmodellen japansk medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Denna teknik möjliggör provtagning av milt från en liten modellfisk, japansk Madaka, och undersökning av dess kvalitet på ett konsekvent sätt. Specifikt spermieuppsamling genom bukmassage möjliggör upprepad provtagning på samma fisk eftersom detta tillvägagångssätt inte är invasivt. Dessutom kan denna teknik tillämpas för bevarande av Madaka spermier.Spermiekvalitet är en viktig indikator på befruktningsframgång, och därför en viktig parameter att analysera i ekologiska och hela produktiva fysiologistudier. Börja med att förbereda en mjuk svamp genom att klippa den så att den passar självbelåtet i en petriskål. Skär en rak linje i mitten av svampen, som är tillräckligt lång för att hålla fisken på sin ventrala sida uppåt.Efter bedövning av fisken, torka fiskens buk genom att försiktigt torka av den med en pappershandduk. Placera fisken i tråget på den fuktiga hållsvampen med den ventrala sidan uppåt, så att dess gälar utsätts för bedövningslösningen i svampen. Om området runt cloaca är vått, torka försiktigt undersidan av buken med en engångsvävnadstork.Under ett dissekerande mikroskop placerar du mikropipetten med ett fäst aspiratorrör mot fiskens cloaca. Massera nu fiskens buk genom att försiktigt klämma med en trubbig ände släta pincett i en rostral till caudal rörelse. För återhämtning av fisken, släpp den från svampen i det tidigare beredda återhämtningsvattnet innan du återför fisken till akvariesystemet.Överför den uppsamlade milten till ett rör som innehåller förvärmd aktiveringslösning och pipettlösning upp och ner flera gånger med hjälp av andningsrörsenheten. Homogenisera de utspädda spermierna försiktigt genom att snärta rören före analys. Efter avlivning torkar fisken den som visats tidigare och placerar fisken under ett dissekerande mikroskop med vänster sidosida uppåt.Använd en liten dissekerande sax, skär en flik dorsalt från cloaca och sedan över revbenen till gälarna för att exponera de inre organen. Leta reda på testiklarna och skär fästet i båda ändarna med fina pincett. Ta bort testiklarna och överför dem till ett berett rör som innehåller förvärmd aktiveringslösning.Använd tången för att krossa testiklarna flera gånger mot rörets sida för att frigöra spermierna, vilket kan visualiseras av lösningens något grumliga utseende. För att påbörja analysen, öppna programvaran för spermieanalys och välj motilitetsmodulen. Ställ in konfigurationerna i programvaran för alla parametrar.Placera en förvärmd engångs 20 mikrometer räknekammarglas under mikroskopet på ett uppvärmt stadium, inställt på 27 grader Celsius. Pipettera provet i kammaren på bilden tills det fylls, men utan överfyllning. Torka försiktigt bort överflödiga prover från kammarens ingång för att förhindra driftrörelse av celler i lösningen.Välj analysera för att titta på provet under mikroskopet. Se till att mikroskopet är fokuserat och välj analysera igen för att registrera spermierna i fältet. Flytta bilden till ett nytt område i provet i bildrutan och upprepa proceduren för tre till fem olika synfält, så att du undviker luftbubblor, cellmassor eller artefakter.För att se resultaten, välj resultat och dubbelklicka på ett fält för att visualisera det enskilda fältet eller för att manuellt söka efter felmärkta eller ospårade spermier. Om det behövs högerklickar du på enskilda spermier för att märka om rörligheten. I den aktuella studien användes datorstödd spermieanalys för att registrera olika hastighets- och rörelseparametrar.De beräknade värdena inkluderar rakhetsindex, linjäritetsindex och wobble. Aktiveringslösningarnas osmolaritet påverkade spermiernas rörlighet från testiklarnas dissektion. Spermierna var immotila i akvarievatten, men rörliga i HBSS med hög och låg osmolaritet.Motiliteten reduceras emellertid signifikant vid 36 milli osmol per kilo, jämfört med lösningar med högre osmolalitet. Motiliteten påverkades också av spermieuppsamlingsmetoden, där spermierna är betydligt mer rörliga i testiklarnas dissektionsmetod jämfört med bukmassage. En högre andel av cellerna var också progressiva och fler celler var antingen medelstora eller snabbrörliga.Den procentuella rörligheten och progressiviteten är signifikant högre i spermierna som lagras vid fyra grader Celsius eller på is, jämfört med 27 grader Celsius lagring. Miljö- och bostadsförhållandena påverkade också spermiernas rörlighet något. Ingen signifikant skillnad i spermiernas rörlighet sågs i spermierna som samlades in efter och före gytning.Manspersoner inrymda utan kvinnor i en månad visade hög rörlighet, men skillnaden var obetydlig. För spermieuppsamling genom bukmassage behövs träning för att lära sig rätt tångtryck och rörelse och för att undvika avföringskontaminering. Denna teknik kommer att vara mycket användbar för att undersöka till exempel effekterna av olika föroreningar på manlig fertilitet i ekotoxikologiska studier, där Medaka är en vanligt förekommande modell.

Research

JoVE Journal

Biology

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Skörd sperma och artificiell insemination av Möss

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Tekniker för Imaging Ca 2 + Signalering i mänskliga spermier

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Datorstödd Storskaliga Visualisering och kvantifiering av bukspottkörtel Islet Mass, storleksfördelning och Arkitektur

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Två typer av analyser för att upptäcka Frog spermier Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Bedöma Skillnader i spermier konkurrensförmåga i<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Aviär seminstation av Svabbprover Massage och isolering av DNA från spermier

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...