Name: rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection
Uploaded: 2022-08-23T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rat Burn Model to Study Full-Thickness Cutaneous Thermal Burn and Infection at JoVE.com

Gli autori ringraziano la Divisione di Medicina Comparata dell'Università della Carolina del Nord per la fornitura e la cura degli animali. Ringraziamo Lauren Ralph e Mia Evangelista del Pathology Services Core per l'assistenza tecnica esperta con istopatologia / patologia digitale, incluso il sezionamento dei tessuti e l'imaging. Questa ricerca è stata sostenuta da una borsa di ricerca del Dipartimento della Difesa (numero di premio W81XWH-20-1-0500, GR e TV).

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Nord e sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite. Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley maschi e femmine (250-300 g) di età compresa tra 7 e 9 settimane. Tutti gli animali sono stati alloggiati in un ciclo luce-buio di 12 ore: 12 h con libero accesso al cibo e all'acqua ad libitum. Lavora sempre con il tuo veterinario istituzionale su...

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+frequency+domain+imaging+of+burn+wounds+in+a+preclinical+model+of+graded+burn+severity.">Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity.</a> Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).</li><li>Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proliferation+of+Pseudomonas+aeruginosa+by+KGF+in+an+experimental+burn+model+using+human+cultured+keratinocytes.">Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes.</a> Burns. 33 (5), 613-620 (2007).</li><li>Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+distant+muscle+fibers+following+thermal+injury+i+n+Wistar+rats.">Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).</li><li>Davies, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+blood+nitric+oxide+reveals+a+burn-dependent+decrease+of+nitric+oxide+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).</li><li>Gouma, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+estimation+of+total+body+surface+area+and+determination+of+a+new+value+of+Meeh's+constant+in+rats.">A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats.</a> Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).</li><li>Dawson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface-area/body-weight+relationship+in+mice.">The surface-area/body-weight relationship in mice.</a> Australian Journal of Biological Sciences. 20 (3), 687-690 (1967).</li><li>Moins-Teisserenc, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+altered+immune+status+after+burn+injury+is+associated+with+bacterial+infection+and+septic+shock.">Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock.</a> Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).</li><li>Robins, E. 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Sono stati presentati diversi modelli di ustioni per studiare la fisiopatologia delle ustioni 8,12,16,17. Nel presente studio, abbiamo impiegato un modello di ratto per sviluppare un protocollo semplice e riproducibile per indurre un'ustione a tutto spessore seguita da un'infezione batterica per simulare un trauma da ustione infetto nei pazienti. La scelta del ratto come modello animale per imi...

Le ustioni sono tra le forme più devastanti di trauma, con tassi di mortalità che raggiungono il 12% anche nei centri specializzati per ustioni 1,2,3. Secondo rapporti pubblicati di recente, ~ 486.000 pazienti ustionati richiedono cure mediche ogni anno negli Stati Uniti, con quasi 3.500 morti 1,2,3,4,5,6. Le ustioni impongono una grande sfida per il sistema immunitario dei pazienti e creano una significativa ferita aperta, che è lenta a guarire, lasciandoli suscettibili alla colonizzazione cutanea, polmonare e sistemica con batteri nosocomiali e opportunisti. La disregolazione immunitaria combinata con l'infezione batterica è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità nei pazienti ustionati7.
Un modello di ustione e infezione animale è essenziale per studiare la patogenesi delle infezioni batteriche a seguito di danni cutanei e soppressione immunitaria associata a traumi da ustione. Tali modelli consentono la progettazione e la valutazione di nuovi metodi per il trattamento delle infezioni batteriche nei pazienti ustionati. I ratti e gli esseri umani condividono caratteristiche fisiologiche e patologiche cutanee simili che sono state precedentemente documentate8. Inoltre, i ratti sono di dimensioni più piccole, rendendoli più facili da gestire, più economici e più facili da procurarsi e mantenere rispetto ai modelli animali più grandi.
Queste caratteristiche rendono i ratti un animale modello ideale per studiare ustioni e infezioni9. Sfortunatamente, la tecnica per l'induzione della bruciatura è incoerente e spesso descritta in minima parte 10,11,12,13,14. Il presente protocollo è progettato per sviluppare una procedura semplice, economica e riproducibile per creare una lesione da ustione a tutto spessore coerente in un modello di ratto che simula lo scenario clinico e può essere utilizzata per valutare la soppressione immunitaria e l'infezione batterica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>309597</td>
			<td>Used to inject the analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microtube</td>
			<td>Olympus, USA</td>
			<td>24-282</td>
			<td>Used to carry morphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NBF</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>16004-115</td>
			<td>Used to fix the skin piece for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used to inject the lactate ringer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethyl alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific, USA</td>
			<td>BP28184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperio AT2 Digital Pathology&#160; Slide Scanner with ImageScope software</td>
			<td>Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Scanning of H &#38; E slides and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetrimide agar plates</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>285420</td>
			<td>Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper rods</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used to induce the burn injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>OMEGA Surgical supply, USA</td>
			<td>4225-IMC</td>
			<td>Used to apply eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster, USA</td>
			<td>Golden A5</td>
			<td>Used to remove the dorsal side hairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye lube</td>
			<td>Dechra, UK</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluff filled underpads</td>
			<td>Medline, USA</td>
			<td>MSC281225</td>
			<td>Used in the burn procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11027-12</td>
			<td>Used to hold the skin piece</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Oasis, USA</td>
			<td>PK412</td>
			<td>Used to clean the applied nair cream from the dorsal side&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-resistant gloves</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used to hold the heated copper rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>IDEXX laboratories, USA</td>
			<td>ProCyte Dx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific, USA</td>
			<td>vetFlo-0730</td>
			<td>Used to anesthesize the animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal, USA</td>
			<td>NDC46066-755-04</td>
			<td>Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporiser</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer&#39;s solution</td>
			<td>icumedical, USA</td>
			<td>NDC0990-7953-09</td>
			<td>Used to resuscitate the rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreader</td>
			<td>Fischer Scientific, USA</td>
			<td>14-665-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol Agar</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>211407</td>
			<td>Selective media plates for Staphylococcus aureus growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicollect tubes (K2EDTA)</td>
			<td>greiner bio-one, USA</td>
			<td>450480</td>
			<td>Used to collect the blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morphine</td>
			<td>Mallinckrodt, UK</td>
			<td>NDC0406-8003-30</td>
			<td>This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller Hinton Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>275730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller Hinton II Agar</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>211438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair hair removal lotion</td>
			<td>Nair, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used to remove the residual hairs on dorsal side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 23 G</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td>305193</td>
			<td>Used to inject the lactate ringer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoScientific, USA</td>
			<td>Genesys 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley rats, male and female</td>
			<td>Charles River Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>7-9 weeks old for burn induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissor</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14501-14</td>
			<td>Used to cut the desired skin piece</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue collection tubes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>220101236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Kinematica, Inc, USA</td>
			<td>POLYTRON PT2100</td>
			<td>Used to homogenize the tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fischer Scientific, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used to induce the burn injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighted heating pad</td>
			<td>Comfytemp, USA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used during the procedure to keep rat&#39;s body warm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection

Le metodologie di induzione delle ustioni sono descritte in modo incoerente nei modelli di ratto. Un modello uniforme di ferita da ustione, che rappresenta lo scenario clinico, è necessario per eseguire ricerche di ustioni riproducibili. Il presente protocollo descrive un metodo semplice e riproducibile per creare ~ 20% di superficie corporea totale (TBSA) ustioni a tutto spessore nei ratti. Qui, una barra di rame di 22,89 cm2 (5,4 cm di diametro) riscaldata a 97 °C a bagnomaria è stata applicata sulla superficie della pelle di ratto per indurre la lesione da ustione. Una barra di rame con un'alta conduttività termica è stata in grado di dissipare il calore più in profondità nel tessuto cutaneo per creare un'ustione a tutto spessore. L'analisi istologica mostra epidermide attenuata con danno coagulativo all'estensione a tutto spessore del derma e del tessuto sottocutaneo. Inoltre, questo modello è rappresentativo delle situazioni cliniche osservate nei pazienti ustionati ospedalizzati a seguito di lesioni da ustione come la disregolazione immunitaria e le infezioni batteriche. Il modello può ricapitolare l'infezione batterica sistemica da entrambi i batteri Gram-positivi e Gram-negativi. In conclusione, questo articolo presenta un modello di ustione di ratto facile da imparare e robusto che imita le situazioni cliniche, tra cui la disregolazione immunitaria e le infezioni batteriche, che è di notevole utilità per lo sviluppo di nuovi farmaci antibiotici topici per ustioni e infezioni.

Il protocollo qui presentato è altamente riproducibile e ha provocato una lesione da ustione di terzo grado a tutto spessore nei ratti. La ferita da ustione appare bianca cerosa dopo l'induzione dell'ustione (Figura 2B). Il colore della lesione da ustione è cambiato da bianco a marrone nel corso di 72 ore dopo l'ustione (Figura 2B-E).
L'analisi istologica ha confermato un'ustione a tutto spessore (p...

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Rat Burn Model to Study Full-Thickness Cutaneous Thermal Burn and Infection

Un modello che imiti lo scenario clinico delle ustioni e delle infezioni è necessario per promuovere la ricerca sulle ustioni. Il presente protocollo dimostra un modello semplice e riproducibile di infezione da ustione da ratto paragonabile a quello dell'uomo. Ciò facilita lo studio delle ustioni e delle infezioni successive all'ustione per lo sviluppo di nuovi trattamenti antibiotici topici.

Modello di ratto burn per studiare l'ustione termica cutanea a tutto spessore e l'infezione

Burn induction methodologies are inconsistently described in rat models. A uniform burn wound model, which represents the clinical scenario, is necessary ...

Questo modello di lesione da ustione è in grado di ricapitolare le situazioni cliniche osservate nei pazienti ustionati ospedalizzati a seguito di ustioni come la disregolazione immunitaria e le infezioni batteriche. Questo metodo per indurre ustioni nei ratti è facile da imparare e può essere utilizzato per lo sviluppo e la valutazione di nuovi farmaci tropicali per ustioni e infezioni. Questo modello può essere utilizzato per valutare la guarigione delle ferite e la progressione dell'infezione batterica nel sito di ustione.Questo metodo di induzione delle ustioni può essere utilizzato anche in modelli murini e altri modelli animali per l'induzione delle ustioni e per studiare l'infezione batterica delle ferite da ustione. Inizia a preparare il ratto anestetizzato per la ferita da ustione spostandolo su una piastra elettrica in posizione prona. Utilizzando un applicatore con punta di cotone, applicare lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.Radere l'area dorsale del ratto con un tagliacapelli elettrico in un grande rettangolo dalle scapole fino alla base della coda. Pulire i peli sciolti dalla zona rasata usando il tessuto imbevuto di soluzione salina. Applicare la lozione depilatoria sulla zona rasata utilizzando un applicatore con punta di cotone.Dopo tre minuti, pulire l'area con una spugna di garza bagnata due volte per rimuovere la lozione e prevenire l'irritazione della pelle. Spegnere l'isoflurano e rimuovere il cono del naso prima di posizionare il ratto nella gabbia di recupero. Il giorno dell'esperimento di lesione da ustione, impostare la temperatura del bagno d'acqua a 97 gradi Celsius e un'ora prima dell'esperimento, posizionare 420 grammi di quattro barre di rame nel bagno d'acqua.Una volta che il ratto non risponde al pizzicamento della punta su tutti gli arti, posizionarlo sulla piastra elettrica in posizione prona e iniettare 20 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di morfina attraverso la radice intraperitoneale o IP, per la gestione del dolore. Quindi, controllare la temperatura del bagno d'acqua. Impostare il timer e indossare i guanti resistenti al calore.Prendi una barra di rame riscaldata dal bagno d'acqua e toccala sulla zona del dorso per sette secondi. Applicare immediatamente le tre ustioni successive una dopo l'altra utilizzando un'asta per sito di combustione e produrre una superficie corporea totale di circa il 20% della superficie totale bruciata a contatto completo. Dopo l'ustione, rianimare l'animale iniettando 0,1 millilitri per grammo di peso corporeo della soluzione di Ringer lattato attraverso la via IP.Una volta fatto, spegnere l'isoflurano. Rimuovere il cono del naso e posizionare il topo sul tappetino termico. Il giorno dell'ustione e dell'infezione, centrifugare separatamente la coltura di Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus a 4.000 volte g per 5 minuti.Lavare il pellet con soluzione salina normale prima di diluire il pellet utilizzando soluzione salina a 0,1 densità ottica a 600 nanometri. Diluire 200 microlitri della sospensione batterica con 800 microlitri di soluzione salina e ottenere l'inoculo batterico desiderato di 2 per 10 alle unità formanti colonie 7th o CFU per millilitro. 15 minuti dopo l'ustione, iniettare per via sottocutanea 50 microlitri di inoculo diluito dei batteri vicino all'area bruciata utilizzando un ago calibro 29.Posizionare il topo sulla piastra elettrica per il recupero. Dopo 15-20 minuti, trasferire l'animale recuperato in una gabbia pulita. Immediatamente dopo la lesione da ustione, valutare morfologicamente la lesione cutanea in termini di colore e margine.Dopo l'eutanasia, analizzare l'emocromo completo per determinare l'effetto dell'induzione dell'ustione sul sistema immunitario dell'ospite. Raccogli il tessuto del ratto eutanasia in una provetta da 10 millilitri. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore tissutale e diluire serialmente gli omogenati tissutali in soluzione salina normale.Piastra 100 microlitri di omogenato non diluito e tutte le diluizioni di ciascun campione di tessuto raccolto da ratti infetti da P.Aeruginosa su piastre di agar cetrimide. Dopo aver incubato le piastre per 16-18 ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice, contare le colonie batteriche sulle piastre. Moltiplicarli per il rapporto di diluizione per ottenere il conteggio dei CFU per millilitro e normalizzarlo con il peso del tessuto per calcolare il tessuto del programma CFU.Questo protocollo altamente riproducibile ha provocato una lesione da ustione a tutto spessore di terzo grado nei ratti. Il colore della lesione da ustione è cambiato da bianco a marrone in 24 ore a 72 ore dopo l'ustione. Nell'analisi istologica, i campioni di pelle di animali bruciati hanno mostrato lesioni su tutti gli strati a 24, 48 e 72 ore dopo la lesione da ustione, mentre la pelle non bruciata ha mostrato una chiara distinzione di epidermide, derma e strati di tessuto sottocutaneo.La distruzione dello strato epidermico e il danneggiamento dello spessore completo del derma con grasso sottocutaneo e muscolo scheletrico sono stati osservati in campioni di pelle bruciata. Nelle 24 ore successive alla combustione, un'ustione a tutto spessore era più profonda di 2,61 millimetri. Nella valutazione della clearance batterica, il recupero batterico è stato osservato in tutti i ratti con ustioni.Durante l'infezione da P.aeruginosa PAO1, il numero di batteri recuperati 24 ore dopo l'infezione dalla pelle del ratto bruciato era inferiore all'inoculo iniziale di 1 per 10 al 6 ° CFU. Tuttavia, è aumentato 48 e 72 ore dopo l'infezione. Nell'infezione da S.aureus, ATC25923, è stato osservato un aumento di 2 log 10 in tutti i punti temporali della pelle rispetto all'inoculo iniziale, suggerendo che l'instaurazione dell'infezione da S.aureus è dovuta alla replicazione attiva nei tessuti.Il tessuto sottocutaneo e i muscoli hanno mostrato una carica batterica superiore rispetto al polmone e alla milza. I dati hanno mostrato che i ratti bruciati hanno sviluppato un'infezione sistemica 24 ore dopo l'inoculazione di P.aeruginosa e 48 ore dopo l'inoculazione di S.aureus. Rimuovere completamente i peli sul dorso del ratto e mantenere la temperatura e il tempo di induzione della bruciatura come indicato nel protocollo.I capelli rimanenti e la diversa temperatura delle barre di rame possono influire sulla qualità della bruciatura. Il modello di ustione del ratto può essere esplorato per valutare nuove terapie topiche per il trattamento delle infezioni da ustioni e per valutare diverse medicazioni per ferite.

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