Name: atomic force microscopy cantilever-based nanoindentation: mechanical property measurements at the nanoscale in air and fluid
Uploaded: 2022-12-02T13:10:00
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Alle AFM-Experimente wurden im Surface Science Laboratory (SSL) der Boise State University durchgeführt. Die REM-Charakterisierung wurde im Boise State Center for Materials Characterization (BSCMC) durchgeführt. Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsarbeiten zu Biokraftstoffrohstoffen wurden teilweise vom US-Energieministerium, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Bioenergy Technologies Office im Rahmen des Feedstock Conversion Interface Consortium (FCIC) und im Rahmen des DOE Idaho Operations Office-Vertrags DE-AC07-051ID14517 unterstützt. Die Studien zur Zellmechanik wurden von den National Institutes of Health (USA) im Rahmen von Zuschüssen AG059923, AR075803 und P20GM109095 sowie von Zuschüssen der National Science Foundation (USA) 1929188 und 2025505 unterstützt. Die Arbeit an Modelllipid-Doppelschichtsystemen wurde von den National Institutes of Health (USA) im Rahmen des Stipendiums R01 EY030067 unterstützt. Die Autoren danken Dr. Elton Graugnard für die Erstellung des in Abbildung 11 gezeigten zusammengesetzten Bildes.

HINWEIS: Aufgrund der großen Vielfalt an kommerziell erhältlichen AFMs und der Vielfalt der Probentypen und Anwendungen, die es für die Cantilever-basierte Nanoindentation gibt, ist das folgende Protokoll absichtlich relativ allgemein gehalten und konzentriert sich auf die gemeinsamen Schritte, die für alle Cantilever-basierten Nanoindentationsexperimente unabhängig von Gerät oder Hersteller erforderlich sind. Aus diesem Grund gehen die Autoren davon aus, dass der Leser zumindest über eine grundlegende Vertrauthei...

Probenvorbereitung Zu den gängigen Präparationsmethoden für die Nanoindentation in Luft gehören Kryoschnitt (z. B. Gewebeproben), Schleifen und/oder Polieren mit anschließendem Ultramikrotomieren (z. B. in Harz eingebettete biologische Proben), Ionenmahlen oder fokussierte Ionenstrahlpräparation (z. B. Halbleiter-, poröse oder gemischte Härteproben, die nicht poliert werden können), mechanisches oder elektrochemisches Polieren (z. B. Metalllegierungen) oder Dünnschichtabscheidung (z. B. Atom...

Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Werkstoffen ist eine der grundlegendsten und wesentlichsten Aufgaben im Ingenieurwesen. Für die Analyse von Schüttguteigenschaften stehen zahlreiche Methoden zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Werkstoffsystemen zur Verfügung, darunter Zugversuche1, Druckversuche2 und Drei- oder Vierpunkt-Biegeversuche (Biegeversuche)3. Während diese mikroskaligen Tests unschätzbare Informationen über die Eigenschaften des Schüttguts liefern können, werden sie in der Regel bis zum Versagen durchgeführt und sind daher zerstörerisch. Darüber hinaus fehlt ihnen die räumliche Auflösung, die erforderlich ist, um die mikro- und nanoskaligen Eigenschaften vieler heute interessanter Materialsysteme wie dünner Schichten, biologischer Materialien und Nanokomposite genau zu untersuchen. Um einige der Probleme bei groß angelegten mechanischen Prüfungen, vor allem deren zerstörerische Natur, anzugehen, wurden Mikrohärteprüfungen aus der Mineralogie übernommen. Die Härte ist ein Maß für die Widerstandsfähigkeit eines Materials gegen plastische Verformung unter bestimmten Bedingungen. Im Allgemeinen wird bei Mikrohärteprüfungen eine steife Sonde, die normalerweise aus gehärtetem Stahl oder Diamant besteht, verwendet, um in ein Material einzudrücken. Die resultierende Eindringtiefe und/oder -fläche kann dann zur Bestimmung der Härte verwendet werden. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, darunter die Härte Vickers4, Knoop5 und Brinell6 ; Jedes liefert ein Maß für die mikroskalige Materialhärte, jedoch unter unterschiedlichen Bedingungen und Definitionen, und liefert daher nur Daten, die mit Tests verglichen werden können, die unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden.
Die instrumentierte Nanoindentation wurde entwickelt, um die relativen Werte zu verbessern, die mit den verschiedenen Mikrohärteprüfmethoden erhalten wurden, die räumliche Auflösung für die Analyse mechanischer Eigenschaften zu verbessern und die Analyse dünner Schichten zu ermöglichen. Wichtig ist, dass durch die Verwendung der zuerst von Oliver und Pharr7 entwickelten Methode der Elastizitäts- oder Elastizitätsmodul E eines Probenmaterials durch instrumentierte Nanoindentation bestimmt werden kann. Darüber hinaus kann durch den Einsatz einer dreiseitigen pyramidenförmigen Nanoeindringkörpersonde von Berkovich (deren ideale Spitzenflächenfunktion mit der der vierseitigen Pyramidensonde von Vickers übereinstimmt)8 ein direkter Vergleich zwischen nanoskaligen und traditionelleren mikroskaligen Härtemessungen durchgeführt werden. Mit der zunehmenden Popularität des AFM gewann auch die Cantilever-basierte Nanoindentation von AFM an Aufmerksamkeit, insbesondere für die Messung der mechanischen Eigenschaften weicherer Materialien. Wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt, sind die beiden heute am häufigsten verwendeten Techniken zur Untersuchung und Quantifizierung nanoskaliger mechanischer Eigenschaften die instrumentierte Nanoindentation (Abbildung 1A) und die AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation (Abbildung 1B)9, wobei letztere im Mittelpunkt dieser Arbeit steht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64497/64497fig01.jpg"> Abbildung 1: Vergleich von instrumentierten und AFM-Cantilever-basierten Nanoindentationssystemen. Schematische Diagramme, die typische Systeme für die Durchführung von (A) instrumentierter Nanoindentation und (B) AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation darstellen. Diese Abbildung wurde von Qian et al.51 modifiziert. Abkürzung: AFM = Rasterkraftmikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64497/64497fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Sowohl instrumentierte als auch AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation verwenden eine steife Sonde, um eine zu untersuchende Probenoberfläche zu verformen und die resultierende Kraft und Verschiebung in Abhängigkeit von der Zeit zu überwachen. Typischerweise wird entweder die gewünschte Last (d. h. Kraft) oder das (Z-Piezo-) Wegprofil vom Benutzer über die Softwareschnittstelle vorgegeben und direkt vom Gerät gesteuert, während der andere Parameter gemessen wird. Die mechanische Eigenschaft, die am häufigsten aus Nanoindentationsexperimenten gewonnen wird, ist der Elastizitätsmodul (E), auch als Elastizitätsmodul bezeichnet, der Druckeinheiten hat. Der Elastizitätsmodul eines Materials ist eine grundlegende Eigenschaft, die sich auf die Verbundsteifigkeit bezieht, und ist definiert als das Verhältnis von Zug- oder Druckspannung (σ, die aufgebrachte Kraft pro Flächeneinheit) zur axialen Dehnung (ε, die proportionale Verformung entlang der Eindringachse) während der elastischen (d. h. reversiblen oder vorübergehenden) Verformung vor dem Einsetzen der plastischen Verformung (Gleichung [1]):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
Es ist zu beachten, dass, da viele Materialien (insbesondere biologische Gewebe) tatsächlich viskoelastisch sind, der (dynamische oder komplexe) Modul in Wirklichkeit sowohl aus elastischen (Lagerung, in Phase) als auch aus viskosen (Verlust, phasenverschoben) Komponenten besteht. In der Praxis wird in einem Nanoindentationsexperiment der reduzierte Modul E * gemessen, der sich auf den wahren Probenmodul E bezieht, wie in Gleichung (2) gezeigt:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)
Dabei stehen E-Spitze und ν-Spitze für den Elastizitätsmodul bzw. das Poisson-Verhältnis der Nanoeindringkörperspitze und ν für das geschätzte Poisson-Verhältnis der Probe. Das Poisson-Verhältnis ist das negative Verhältnis der Quer- zur Axialdehnung und gibt somit den Grad der Querdehnung einer Probe an, wenn sie einer axialen Dehnung ausgesetzt wird (z. B. bei einer Nanoindentationsbelastung), wie in Gleichung (3) gezeigt:
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq03.jpg" style="margin: auto;">(3)
Die Umrechnung vom reduzierten in den tatsächlichen Modul ist notwendig, weil a) ein Teil der axialen Dehnung, die von der Eindringkörperspitze übertragen wird, in Querdehnung umgewandelt werden kann (d. h. die Probe kann sich durch Ausdehnung oder Kontraktion senkrecht zur Belastungsrichtung verformen) und b) die Eindringkörperspitze nicht unendlich hart ist und daher das Eindrücken der Probe zu einer (kleinen) Verformung der Spitze führt. Beachten Sie, dass in dem Fall, in dem die E-Spitze >> E ist (d. h. die Eindringkörperspitze viel härter ist als die Probe, was bei der Verwendung einer Diamantsonde oft der Fall ist), die Beziehung zwischen dem reduzierten und dem tatsächlichen Probenmodul stark zu E ≈ E*(1 - v2) vereinfacht wird. Während die instrumentierte Nanoindentation in Bezug auf die genaue Kraftcharakterisierung und den Dynamikbereich überlegen ist, ist die Cantilever-basierte Nanoindentation auf AFM-Basis schneller, bietet eine um Größenordnungen höhere Kraft- und Wegempfindlichkeit, ermöglicht eine Bildgebung mit höherer Auflösung und eine verbesserte Lokalisierung von Eindrücken und kann gleichzeitig magnetische und elektrische Eigenschaften im Nanomaßstab untersuchen9. Insbesondere die freitragende Nanoindentation auf AFM-Basis eignet sich hervorragend für die Quantifizierung mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala von weichen Materialien (z. B. Polymere, Gele, Lipiddoppelschichten und Zellen oder andere biologische Materialien), extrem dünnen (Sub-μm) Filmen (bei denen Substrateffekte je nach Eindringtiefe ins Spiel kommen können)10,11 und suspendierten zweidimensionalen (2D) Materialien12,13,14 wie Graphen 15,16, Glimmer17, hexagonales Bornitrid (h-BN)18 oder Übergangsmetalldichalkogenide (TMDCs; z. B. MoS2)19. Dies ist auf seine hervorragende Kraft- (sub-nN) und Verschiebungsempfindlichkeit (sub-nm) zurückzuführen, die wichtig ist, um den anfänglichen Kontaktpunkt genau zu bestimmen und innerhalb des elastischen Verformungsbereichs zu bleiben.
Bei der Cantilever-basierten AFM-Nanoindentation wird die Verschiebung einer AFM-Sonde in Richtung der Probenoberfläche durch ein kalibriertes piezoelektrisches Element (Abbildung 1B) betätigt, wobei sich der flexible Cantilever aufgrund der Widerstandskraft, die beim Kontakt mit der Probenoberfläche auftritt, schließlich biegt. Diese Biegung oder Auslenkung des Auslegers wird in der Regel überwacht, indem ein Laser von der Rückseite des Auslegers in einen Photodetektor (positionsempfindlicher Detektor [PSD]) reflektiert wird. Gepaart mit der Kenntnis der Cantilever-Steifigkeit (in nN/nm) und der Durchbiegungsempfindlichkeit (in nm/V) ist es möglich, diese gemessene Cantilever-Auslenkung (in V) in die auf die Probe ausgeübte Kraft (in nN) umzurechnen. Nach dem Kontakt ergibt die Differenz zwischen der Z-Piezobewegung und der Cantilever-Auslenkung die Eindringtiefe der Probe. In Kombination mit der Kenntnis der Spitzenflächenfunktion ermöglicht dies die Berechnung der Spitzen-Probe-Kontaktfläche. Die Steigung der in Kontakt befindlichen Teile der resultierenden Kraft-Weg- oder Kraft-Weg-Kurven (F-D) kann dann mit einem geeigneten Kontaktmechanikmodell (siehe Abschnitt " Datenanalyse" der Diskussion) angepasst werden, um die nanomechanischen Eigenschaften der Probe zu bestimmen. Während die freitragende Nanoindentation auf AFM-Basis einige deutliche Vorteile gegenüber der oben beschriebenen instrumentierten Nanoindentation aufweist, bringt sie auch einige praktische Herausforderungen bei der Implementierung mit sich, wie z. B. Kalibrierung, Spitzenverschleiß und Datenanalyse, die hier diskutiert werden. Ein weiterer potenzieller Nachteil der freitragenden Nanoindentation auf AFM-Basis ist die Annahme einer linearen Elastizität, da der Kontaktradius und die Eindringtiefe viel kleiner sein müssen als der Eindringkörperradius, was bei der Arbeit mit nanoskaligen AFM-Sonden und/oder Proben mit signifikanter Oberflächenrauheit schwierig zu erreichen sein kann.
Traditionell wurde die Nanoindentation auf einzelne Stellen oder kleine Gittereindruckexperimente beschränkt, bei denen eine gewünschte Position (d. h. Region of Interest [ROI]) ausgewählt wird und ein einzelner kontrollierter Eindruck, mehrere Eindrücke an einer einzigen Stelle, die durch eine gewisse Wartezeit getrennt sind, und/oder ein grobes Raster von Einrückungen mit einer Rate in der Größenordnung von Hz durchgeführt werden. Jüngste Fortschritte im AFM ermöglichen jedoch die gleichzeitige Erfassung mechanischer Eigenschaften und Topografie durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Kraftkurven-basierten Bildgebungsmodi (je nach Systemhersteller unter verschiedenen Handelsnamen bezeichnet), bei denen Kraftkurven mit einer kHz-Rate unter Lastkontrolle durchgeführt werden, wobei die maximale Kraft zwischen Spitze und Probe als Bildgebungssollwert verwendet wird. Es wurden auch Point-and-Shoot-Methoden entwickelt, die die Aufnahme eines AFM-Topographiebildes mit anschließender selektiver Nanoindentation an interessanten Punkten innerhalb des Bildes ermöglichen, was eine nanoskalige räumliche Kontrolle über die Position der Nanoindentation ermöglicht. Obwohl dies nicht der Hauptfokus dieser Arbeit ist, werden in den repräsentativen Ergebnissen spezifische ausgewählte Anwendungsbeispiele sowohl der kraftkurvenbasierten Bildgebung als auch der Point-and-Shoot-Cantilever-basierten Nanoindentation vorgestellt, die in Verbindung mit dem unten beschriebenen Protokoll verwendet werden können, sofern dies auf der jeweils verwendeten AFM-Plattform verfügbar ist. Konkret skizziert diese Arbeit ein verallgemeinertes Protokoll für die praktische Implementierung der AFM-Cantilever-basierten Nanoindentation auf jedem leistungsfähigen AFM-System und bietet vier Anwendungsfallbeispiele (zwei in Luft, zwei in Flüssigkeit) der Technik, einschließlich repräsentativer Ergebnisse und einer eingehenden Diskussion der Nuancen, Herausforderungen und wichtigen Überlegungen für den erfolgreichen Einsatz der Technik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Dimension Icon</td>
			<td>Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AtomicJ</td>
			<td>American Institute of Physics</td>
			<td>https://doi.org/10.1063/1.4881683</td>
			<td>Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq05.jpg" style="margin: auto;" />, &#8220;AtomicJ: An open source software for analysis of force curves&#8221; Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)</td>
			<td>S271 (&#62;99% purity NaCl), P9541 (&#62;99% purity KCl), BP332(&#62;99% purity Na2HPO4), BP362 (&#62;99% purity KH2PO4)</td>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip AFM probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PDNISP</td>
			<td>Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond ultramicrotome blade</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 35&#176;</td>
			<td>2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla Glue</td>
			<td>26853-31-6</td>
			<td>Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR white resin, medium grade (catalyzed)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14381</td>
			<td>500 mL bottle, Lot #150629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cells (MSCs)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. &#34;Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis&#34; Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. &#34;Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential&#34; Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulus standards</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-SMPKIT-12M</td>
			<td>Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>50-12</td>
			<td>12 mm diameter, V1 grade muscovite mica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanscope Analysis</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Version 2.0</td>
			<td>Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5</td>
			<td>POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe holder (fluid, lipid bilayers)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe holder (fluid, MSCs)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>FastScan Bio Z-scanner</td>
			<td>Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe holder (standard, ambient)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>DAFMCH</td>
			<td>Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Puck</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16218</td>
			<td>Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire substrate</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-SMPKIT-12M</td>
			<td>Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>S-3400N-II</td>
			<td>Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon AFM probes (standard)</td>
			<td>NuNano</td>
			<td>Scout 350</td>
			<td>Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon AFM probes (stiff)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>RTESPA-525, RTESPA-525-30&#160;</td>
			<td>Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide grit paper (abrasive discs)</td>
			<td>Allied</td>
			<td>50-10005</td>
			<td>120 grit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC</td>
			<td>Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>DNP</td>
			<td>4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ScanAsyst-Air</td>
			<td>Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 495</td>
			<td>Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000US</td>
			<td>One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip characterization standard</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-SMPKIT-12M</td>
			<td>Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%</td>
			<td>Norco</td>
			<td>SPG TUHPNI - T</td>
			<td>T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC6</td>
			<td>Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Barnstead Nanopure Model 7146</td>
			<td>Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces &#8805;18.2 M&#937;*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 &#181;m particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Grinder</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>EcoMet 3000</td>
			<td>Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table (active)</td>
			<td>Herzan</td>
			<td>TS-140</td>
			<td>Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table (passive)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>65-531</td>
			<td>35&#34; x 30&#34; vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 &#34;Table Stable&#34; active vibration control table is located on top.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy cantilever-based nanoindentation: mechanical property measurements at the nanoscale in air and fluid

Ein Rasterkraftmikroskop (AFM) misst grundlegend die Wechselwirkung zwischen einer nanoskaligen AFM-Sondenspitze und der Probenoberfläche. Wenn die von der Sondenspitze ausgeübte Kraft und ihre Kontaktfläche mit der Probe quantifiziert werden können, ist es möglich, die nanoskaligen mechanischen Eigenschaften (z. B. Elastizität oder Elastizitätsmodul) der zu untersuchenden Oberfläche zu bestimmen. Ein detailliertes Verfahren zur Durchführung quantitativer AFM-Cantilever-basierter Nanoindentationsexperimente wird hier mit repräsentativen Beispielen vorgestellt, wie die Technik zur Bestimmung der Elastizitätsmodule einer Vielzahl von Probentypen, die von kPa bis GPa reichen, angewendet werden kann. Dazu gehören lebende mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Zellkerne in physiologischem Puffer, in Harz eingebettete dehydrierte Loblolly-Kiefernquerschnitte und Bakken-Schiefer unterschiedlicher Zusammensetzung.
Darüber hinaus wird die AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation verwendet, um die Bruchfestigkeit (d.h. Durchbruchkraft) von Phospholipid-Doppelschichten zu untersuchen. Wichtige praktische Überlegungen wie Methodenwahl und -entwicklung, Sondenauswahl und -kalibrierung, Identifizierung von Regionen von Interesse, Probenheterogenität, Strukturgröße und Aspektverhältnis, Spitzenverschleiß, Oberflächenrauheit sowie Datenanalyse und Messstatistik werden erörtert, um die ordnungsgemäße Implementierung der Technik zu unterstützen. Schließlich wird die Kolokalisierung von AFM-abgeleiteten nanomechanischen Karten mit elektronenmikroskopischen Techniken demonstriert, die zusätzliche Informationen über die Elementzusammensetzung liefern.

Kraft-Weg-Kurven Abbildung 7 zeigt repräsentative, nahezu ideale F-D-Kurven, die aus Nanoindentationsexperimenten gewonnen wurden, die in Luft an in Harz eingebetteten Loblolly-Kiefernproben (Abbildung 7A) und in Flüssigkeit (phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS]) an mesenchymalen Stammzellkernen (MSC) (Abbildung 7B) durchgeführt wurden. Die Verwendung eines beliebigen kontaktmechanischen Modells beruht auf...

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Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

Die Quantifizierung der Kontaktfläche und der Kraft, die von einer Rasterkraftmikroskop-Sondenspitze (AFM) auf eine Probenoberfläche ausgeübt wird, ermöglicht die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich. Best Practices zur Implementierung von AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation in Luft oder Flüssigkeit an weichen und harten Proben zur Messung des Elastizitätsmoduls oder anderer nanomechanischer Eigenschaften werden diskutiert.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Die Rasterkraftmikroskopie oder AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation kann verwendet werden, um die nanoskaligen mechanischen Eigenschaften von Materialien mit einem Modulbereich von Kilopascal bis Gigapascal sowohl in Luft als auch in Flüssigkeit zu bestimmen. Die Freikörper-basierte Nanoindentation ermöglicht eine kolokalisierte topographische Bildgebung und quantitative In-situ-Messungen mechanischer Eigenschaften mit nanoskaliger Präzision und Auflösung auf einer Vielzahl von Materialien und relevanten Umgebungen. Mit Hilfe der freitragenden Nanoindentation auf AFM-Basis kann zwischen gesunden und kranken Strukturen, Geweben oder Zellen unterschieden werden, die unterschiedliche mechanische Eigenschaften aufweisen.Die genaue Bestimmung der Kontaktfläche und der Kraft, die während der Cantilever-basierten Nanoindentation ausgeübt wird, erfordert eine sorgfältige Kalibrierung der AFM-Sonde, die eine Herausforderung darstellt, aber für quantitative Messungen der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich unerlässlich ist. Wählen Sie zunächst eine geeignete Rasterkraftmikroskopie- oder AFM-Sonde für die Nanoindentation der gewünschten Probe basierend auf dem Medium, dem erwarteten Modul, der Probentopographie und den relevanten Strukturgrößen aus. Setzen Sie die Sonde auf die Sondenhalterung und befestigen Sie die Sondenhalterung am AFM-Scankopf.Wählen Sie in der AFM-Software einen geeigneten Nanoindentationsmodus aus, der dem Benutzer die Kontrolle über einzelne Rampen ermöglicht. Richten Sie den Laser auf der Rückseite des Sonden-Cantilevers gegenüber der Position der Sondenspitze und in den positionsempfindlichen Detektor (PSD) aus. Zentrieren Sie den Laserstrahlpunkt auf der Rückseite des Cantilevers, indem Sie die Summenspannung maximieren.Zentrieren Sie als Nächstes den reflektierten Laserstrahlpunkt auf dem PSD, indem Sie die vertikalen und horizontalen Ablenksignale so einstellen, dass sie so nahe wie möglich an Null liegen, wodurch der maximal erfassbare Ablenkbereich für die Erzeugung einer Ausgangsspannung bereitgestellt wird, die proportional zur Cantilever-Ablenkung ist. Kalibrieren Sie die Durchbiegungsempfindlichkeit (Deflection Sensitivität, DS) des Sonden-AFM-Systems. Richten Sie dazu DS-Kalibrierungseindrücke auf Saphir ein und führen Sie sie durch, um ungefähr die gleiche Sondenauslenkung wie die geplanten Probeneindrücke zu erreichen, da die gemessene Verschiebung eine Funktion des Ablenkwinkels der Spitze ist und bei großen Auslenkungen nichtlinear wird.Wiederholen Sie die Rampe fünfmal. Bestimmen Sie die DS in Nanometern pro Volt oder die inverse Empfindlichkeit des optischen Hebels und die Volt pro Nanometer aus der Steigung des linearen Teils des Kontaktbereichs nach dem ersten Kontaktpunkt in der resultierenden Kraftverschiebungskurve (FD). Verwenden Sie den Mittelwert der Werte, um eine maximale Genauigkeit zu erzielen.Wenn die relative Standardabweichung 1 % überschreitet, messen Sie den DS erneut, da die ersten FD-Kurven aufgrund der anfänglichen Einführung von Haftkräften manchmal nicht ideal sind. Wenn die Federkonstante K des Sondenauslegers werkseitig nicht kalibriert ist, kalibrieren Sie die Federkonstante. Wenn die Sonde nicht über eine werkseitig kalibrierte Spitzenradiusmessung verfügt, messen Sie den effektiven Spitzenradius R.Wenn Sie die Blindspitzenrekonstruktionsmethode verwenden, bilden Sie die Spitzencharakterisierung oder die Rauheitsprobe mit einer langsamen Abtastrate und hohen Rückkopplungsgewinnen ab, um die Verfolgung der sehr scharfen Merkmale zu optimieren.Wählen Sie eine Bildgröße und Pixeldichte basierend auf dem erwarteten Spitzenradius. Verwenden Sie als Nächstes die AFM-Bildanalysesoftware, um die Sondenspitze zu modellieren und ihren Endradius und effektiven Spitzendurchmesser bei der erwarteten Probeneindrucktiefe abzuschätzen. Geben Sie nach Abschluss der Sondenkalibrierung die DS-, K- und R-Werte in die Software ein.Geben Sie abschließend eine Schätzung des Poisson-Verhältnisses der Probe ein, um den gemessenen reduzierten Modul in den tatsächlichen Probenmodul umzurechnen. Bei Verwendung eines konischen oder konosphärischen Kontaktmechanikmodells, das auf der Spitzenform und der Eindrucktiefe basiert, ist die Eingabe des Spitzenhalbwinkels erforderlich. Navigieren Sie durch die Probe unter dem AFM-Kopf und greifen Sie auf den gewünschten Bereich von Interesse ein.Überwachen Sie das vertikale Ablenksignal oder führen Sie eine kleine erste Rampe durch, um zu überprüfen, ob sich Spitze und Probe berühren. Passen Sie die Position des AFM-Kopfes leicht nach oben an und fahren Sie erneut. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Spitze und die Probe keinen Kontakt mehr haben, was durch eine nahezu flache Rampe und eine minimale vertikale Auslenkung des Cantilevers belegt wird.Sobald keine offensichtliche Wechselwirkung zwischen der Spitze der Probe vorhanden ist, senken Sie den AFM-Kopf um einen Betrag ab, der etwa 50 % der Rampengröße entspricht, um sicherzustellen, dass die Sondenspitze beim manuellen Bewegen des AFM-Kopfes nicht gegen die Probe stößt. Wiederholen Sie die Rampe erneut, bis eine gute Kurve beobachtet wird. Passen Sie die Rampenparameter an.Wählen Sie je nach Probe und gewünschter Eindringtiefe eine geeignete Rampengröße. Wählen Sie dann eine geeignete Rampenrate aus. Ein Hertz ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Proben.Stellen Sie die Anzahl der Samples pro Rampe ein, um die gewünschte Auflösung der Messung zu erreichen. Stellen Sie die X-Drehung ein, um die Scherkräfte auf die Probe und die Spitze zu reduzieren, indem Sie die Sonde gleichzeitig leicht in X-Richtung bewegen, während sie in Z-Richtung einrückt. Verwenden Sie für die X-Drehung einen Wert, der dem Versatzwinkel des Sondenhalters relativ zur Oberflächennormalen entspricht.Wählen Sie als Nächstes aus, ob eine ausgelöste oder nicht ausgelöste Rampe verwendet werden soll. Wenn eine getriggerte Rampe ausgewählt wird, legen Sie den Trigger-Schwellenwert so fest, dass die gewünschte Einkerbung in das Sample erzielt wird. Führen Sie einen Einzug an der ausgewählten Stelle durch.Wählen Sie die zu analysierenden Daten aus und laden Sie sie in die Software. Geben Sie kalibrierte Werte für die Federkonstante, DS oder inverse optische Hebelempfindlichkeit und den Radius der Sondenspitze ein, zusammen mit einer Schätzung für das Poisson-Verhältnis der Probe. Wählen Sie ein Modell mit Nanoindentationskontaktmechanik, das für die Spitze und die Probe geeignet ist.Führen Sie den Anpassungsalgorithmus aus. Prüfen Sie, ob die FD-Kurven richtig passen. Ein kleiner Restfehler, der einem durchschnittlichen R-Quadrat nahe Eins entspricht, weist auf eine gute Anpassung an das gewählte Modell hin.Falls gewünscht, können Sie einzelne Kurven stichprobenartig überprüfen, um die Kurve, die Modellanpassung und die berechneten Kontaktpunkte visuell zu überprüfen. Es werden nahezu ideale FD-Kurven gezeigt, die in der Luft an einer in Harz eingebetteten Loblolly-Kiefernprobe und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung an einem mesenchymalen Stammzellkern erhalten wurden. Bei der Siliziumsonde erfuhr die Spitze während der gesamten Bildgebung einen erheblichen Verschleiß im Vergleich zu ihrem ursprünglichen makellosen Zustand.Mit jedem weiteren Bild wird die Spitze immer runder. Im Gegensatz zur Diamantsonde veränderte sich der Spitzenradius nicht innerhalb der Grenzen der Blindspitzenrekonstruktionsmethode, was die extreme Verschleißfestigkeit des Diamanten unterstreicht. Ein AFM-Topographiebild, das mehrere Zellen abdeckt, mit einer Pseudo-3D-Darstellung und einer entsprechenden Modulkarte einer Loblolly-Kiefernprobe ist hier dargestellt.Die AFM-abgeleitete Modulkarte, die während der Aufnahme eines AFM-Bildes erstellt wurde, zeigt, dass der Mineraleinschluss in der Bildmitte deutlich härter ist als die umgebende organische Matrix. Der Einfluss des Radius und der Form der Sondenspitze auf das Erscheinungsbild von Merkmalen mit hohem Aspektverhältnis einer Bakken-Schieferprobe wird gezeigt. Cantilever-basierte Nanoindentation auf mesenchymalen Stammzellen und isolierten Zellkernen zeigte keinen statistischen Unterschied im Elastizitätsmodul.Die Morphologie und die mechanischen Eigenschaften von cholesterinhaltigen Lipiddoppelschichten, die von AFM untersucht wurden, werden hier demonstriert. Die richtige Sondenkalibrierung und die Auswahl geeigneter Rampenparameter in Modellen der Kontaktmechanik sind für genaue nanomechanische Messungen unerlässlich. Neben elastischen modularen Messungen kann die AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation verwendet werden, um die Bruchfestigkeit oder Durchbruchkraft von Phospholipid-Doppelschichten unter physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen.Die auf AFM basierende Cantilever-basierte Nanoindentation hat es ermöglicht, die Auswirkungen von strukturellen Knockouts, pharmazeutischen Behandlungen und Vibrationen geringer Intensität zu untersuchen, um das Training auf die mechanischen Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellkernen zu simulieren.

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Deflection of Beams

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