Name: atomic force microscopy cantilever-based nanoindentation: mechanical property measurements at the nanoscale in air and fluid
Uploaded: 2022-12-02T13:10:00
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Todos os experimentos de AFM foram realizados no Laboratório de Ciência de Superfícies (SSL) da Universidade Estadual de Boise. A caracterização por MEV foi realizada no Centro Estadual de Caracterização de Materiais de Boise (BSCMC). A pesquisa relatada nesta publicação sobre matérias-primas para biocombustíveis foi apoiada em parte pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Eficiência Energética e Energia Renovável, Escritório de Tecnologias de Bioenergia como parte do Consórcio de Interface de Conversão de Matéria-Prima (FCIC) e sob o Contrato DE-AC07-051ID14517 do DOE Idaho Operations Office. Estudos de mecânica celular foram apoiados pelos Institutos Nacionais de Saúde (EUA) sob subsídios AG059923, AR075803 e P20GM109095, e por subsídios da National Science Foundation (EUA) 1929188 e 2025505. O trabalho do modelo de sistemas bicamada lipídica foi apoiado pelo National Institutes of Health (EUA) sob o processo R01 EY030067. Os autores agradecem ao Dr. Elton Graugnard pela produção da imagem composta mostrada na Figura 11.

NOTA: Devido à grande variedade de AFMs disponíveis comercialmente e à diversidade de tipos de amostra e aplicações que existem para nanoindentação baseada em cantilever, o protocolo a seguir é intencionalmente projetado para ser relativamente geral por natureza, concentrando-se nas etapas compartilhadas necessárias para todos os experimentos de nanoindentação baseados em cantilever, independentemente do instrumento ou fabricante. Por causa disso, os autores supõem que o leitor possua pelo menos familiaridade...

Preparo da amostra Para nanoindentação no ar, os métodos de preparação comuns incluem criossecção (por exemplo, amostras de tecido), moagem e/ou polimento seguido de ultramicrotomografia (por exemplo, amostras biológicas embutidas em resina), moagem de íons ou preparação de feixe de íons focalizado (por exemplo, amostras de dureza semicondutora, porosa ou mista não passíveis de polimento), polimento mecânico ou eletroquímico (por exemplo, ligas metálicas) ou deposição de filme fino ...

Compreender as propriedades mecânicas dos materiais é uma das tarefas mais fundamentais e essenciais na engenharia. Para a análise das propriedades de materiais a granel, existem inúmeros métodos disponíveis para caracterizar as propriedades mecânicas de sistemas de materiais, incluindo ensaios de tração1, ensaios de compressão2 e ensaios de flexão de três ou quatro pontos3. Embora esses testes em microescala possam fornecer informações inestimáveis sobre as propriedades do material a granel, eles geralmente são conduzidos até a falha e, portanto, são destrutivos. Além disso, eles não têm a resolução espacial necessária para investigar com precisão as propriedades em micro e nanoescala de muitos sistemas materiais que são de interesse hoje, como filmes finos, materiais biológicos e nanocompósitos. Para começar a resolver alguns dos problemas dos ensaios mecânicos em larga escala, principalmente sua natureza destrutiva, foram adotados ensaios de microdureza a partir da mineralogia. A dureza é uma medida da resistência de um material à deformação plástica em condições específicas. Em geral, os testes de microdureza usam uma sonda rígida, geralmente feita de aço temperado ou diamante, para recuar em um material. A profundidade e/ou área de indentação resultante pode então ser usada para determinar a dureza. Vários métodos foram desenvolvidos, incluindo dureza Vickers4, Knoop5 e Brinell6 ; Cada um fornece uma medida de dureza do material em microescala, mas sob condições e definições diferentes, e como tal só produz dados que podem ser comparados com ensaios realizados sob as mesmas condições.
A nanoindentação instrumentada foi desenvolvida para melhorar os valores relativos obtidos através dos vários métodos de ensaio de microdureza, melhorar a resolução espacial possível para a análise de propriedades mecânicas e permitir a análise de filmes finos. É importante ressaltar que, utilizando o método desenvolvido pela primeira vez por Oliver e Pharr7, o módulo elástico ou módulo de Young, E, de um material de amostra pode ser determinado via nanoindentação instrumentada. Além disso, empregando uma sonda piramidal nanoindenter de três lados de Berkovich (cuja função ideal da área da ponta coincide com a da sonda piramidal de quatro lados Vickers)8, a comparação direta entre medidas de dureza em nanoescala e em microescala mais tradicionais pode ser feita. Com o crescimento da popularidade do AFM, a nanoindentação baseada em balil AFM começou a receber atenção também, particularmente para medir as propriedades mecânicas de materiais mais macios. Como resultado, como descrito esquematicamente na Figura 1, as duas técnicas mais comumente empregadas atualmente para interrogar e quantificar propriedades mecânicas em nanoescala são a nanoindentação instrumentada (Figura 1A) e a nanoindentação baseada em balil AFM (Figura 1B)9, esta última o foco deste trabalho.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64497/64497fig01.jpg"> Figura 1: Comparação de sistemas de nanoindentação instrumentados e baseados em balanço. Diagramas esquemáticos descrevendo sistemas típicos para condução de (A) nanoindentação instrumentada e (B) nanoindentação baseada em balil AFM. Esse valor foi modificado de Qian et al.51. Abreviação: AFM = microscopia de força atômica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64497/64497fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tanto a nanoindentação instrumentada quanto a nanoindentação baseada em balil AFM empregam uma sonda rígida para deformar uma superfície de amostra de interesse e monitorar a força e o deslocamento resultantes em função do tempo. Normalmente, o perfil de deslocamento de carga (ou seja, força) ou (Z-piezo) desejado é especificado pelo usuário através da interface do software e controlado diretamente pelo instrumento, enquanto o outro parâmetro é medido. A propriedade mecânica mais frequentemente obtida a partir de experimentos de nanoindentação é o módulo de elasticidade (E), também conhecido como módulo de Young, que possui unidades de pressão. O módulo de elasticidade de um material é uma propriedade fundamental relacionada à rigidez de aderência e é definido como a razão entre a tensão de tração ou compressão (σ, a força aplicada por unidade de área) e a deformação axial (ε, a deformação proporcional ao longo do eixo de indentação) durante a deformação elástica (isto é, reversível ou temporária) antes do início da deformação plástica (equação [1]):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq01.jpg" style="margin: auto;">(1º)
Deve-se notar que, como muitos materiais (especialmente tecidos biológicos) são de fato viscoelásticos, na realidade, o módulo (dinâmico ou complexo) consiste em componentes elásticos (armazenamento, em fase) e viscosos (perda, fora de fase). Na prática real, o que é medido em um experimento de nanoindentação é o módulo reduzido, E *, que está relacionado ao verdadeiro módulo de interesse da amostra, E, como mostrado na equação (2):
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq02.jpg" style="margin: auto;">(2º)
Onde Eponta e ν são o módulo elástico e a razão de Poisson, respectivamente, da ponta nanoindenter, e ν é a razão de Poisson estimada da amostra. A razão de Poisson é a razão negativa da deformação transversal para axial e, portanto, indica o grau de alongamento transversal de uma amostra ao ser submetida à deformação axial (por exemplo, durante o carregamento de nanoindentação), como mostrado na equação (3):
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq03.jpg" style="margin: auto;">(3º)
A conversão do módulo reduzido para o módulo real é necessária porque a) parte da deformação axial transmitida pela ponta do indenter pode ser convertida em deformação transversal (isto é, a amostra pode deformar via expansão ou contração perpendicular à direção do carregamento), e b) a ponta do indenter não é infinitamente dura e, portanto, o ato de recuar a amostra resulta em alguma (pequena) quantidade de deformação da ponta. Note que no caso em que a ponta E >> E (ou seja, a ponta indenter é muito mais dura do que a amostra, o que geralmente é verdade quando se usa uma sonda de diamante), a relação entre o módulo de amostra reduzido e real simplifica muito para E ≈ E*(1 - v2). Enquanto a nanoindentação instrumentada é superior em termos de caracterização precisa da força e faixa dinâmica, a nanoindentação baseada em balil AFM é mais rápida, fornece ordens de magnitude maior sensibilidade à força e ao deslocamento, permite imagens de maior resolução e melhor localização de recuo, e pode sondar simultaneamente propriedades magnéticas e elétricas em nanoescala9. Em particular, a nanoindentação baseada em balanço AFM é superior para a quantificação de propriedades mecânicas na escala nanométrica de materiais moles (por exemplo, polímeros, géis, bicamadas lipídicas e células ou outros materiais biológicos), filmes extremamente finos (sub-μm) (onde os efeitos do substrato podem entrar em jogo dependendo da profundidade de indentação)10,11 e materiais bidimensionais (2D) suspensos12,13,14, como o grafeno15,16, mica17, nitreto de boro hexagonal (h-BN)18 ou dicalcogênios de metais de transição (TMDCs; por exemplo, MoS2)19. Isso se deve à sua requintada sensibilidade à força (sub-nN) e ao deslocamento (sub-nm), que é importante para determinar com precisão o ponto de contato inicial e permanecer dentro da região de deformação elástica.
Na nanoindentação baseada em balil AFM, o deslocamento de uma sonda AFM em direção à superfície da amostra é acionado por um elemento piezoelétrico calibrado (Figura 1B), com o cantilever flexível eventualmente dobrando devido à força resistiva experimentada ao entrar em contato com a superfície da amostra. Esta flexão ou deflexão do cantilever é tipicamente monitorada refletindo um laser na parte de trás do cantilever e em um fotodetector (detector sensível à posição [PSD]). Aliado ao conhecimento da rigidez do cantilever (em nN/nm) e da sensibilidade à deflexão (em nm/V), é possível converter essa deflexão medida do cantilever (em V) na força (em nN) aplicada à amostra. Após o contato, a diferença entre o movimento Z-piezo e a deflexão do cantilever produz a profundidade de indentação da amostra. Combinado com o conhecimento da função de área de ponta, isso permite o cálculo da área de contato ponta-amostra. A inclinação das porções em contato das curvas de força-distância ou força-deslocamento (F-D) resultantes pode então ser ajustada usando um modelo de mecânica de contato apropriado (veja a seção Análise de Dados da discussão) para determinar as propriedades nanomecânicas da amostra. Embora a nanoindentação baseada em baltilever AFM possua algumas vantagens distintas sobre a nanoindentação instrumentada, como descrito acima, ela também apresenta vários desafios práticos de implementação, como calibração, desgaste da ponta e análise de dados, que serão discutidos aqui. Outra desvantagem potencial da nanoindentação baseada em balil AFM é a suposição de elasticidade linear, já que o raio de contato e as profundidades de indentação precisam ser muito menores do que o raio de indenter, o que pode ser difícil de alcançar quando se trabalha com sondas AFM em nanoescala e/ou amostras exibindo rugosidade superficial significativa.
Tradicionalmente, a nanoindentação tem sido limitada a locais individuais ou pequenos experimentos de recuo de grade, em que um local desejado (ou seja, região de interesse [ROI]) é selecionado e um único recuo controlado, vários recuos em um único local separados por algum tempo de espera e/ou uma grade grosseira de recuos são realizados a uma taxa da ordem de Hz. No entanto, avanços recentes no AFM permitem a aquisição simultânea de propriedades mecânicas e topografia através da utilização de modos de imagem baseados em curvas de força de alta velocidade (referidos por vários nomes comerciais dependendo do fabricante do sistema), em que as curvas de força são conduzidas a uma taxa de kHz sob controle de carga, com a força máxima da ponta-amostra utilizada como o setpoint da imagem. Métodos point-and-shoot também foram desenvolvidos, permitindo a aquisição de uma imagem de topografia AFM seguida de subsequente nanoindentação seletiva em pontos de interesse dentro da imagem, proporcionando controle espacial em nanoescala sobre a localização da nanoindentação. Embora não seja o foco principal deste trabalho, exemplos específicos de aplicação selecionados de imagens baseadas em curva de força e nanoindentação baseada em cantilever point-and-shoot são apresentados nos resultados representativos e podem ser usados em conjunto com o protocolo descrito abaixo, se disponíveis na plataforma AFM específica empregada. Especificamente, este trabalho descreve um protocolo generalizado para a implementação prática de nanoindentação baseada em baltil AFM em qualquer sistema AFM capaz e fornece quatro exemplos de casos de uso (dois no ar, dois no fluido) da técnica, incluindo resultados representativos e uma discussão aprofundada das nuances, desafios e considerações importantes para empregar a técnica com sucesso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Dimension Icon</td>
			<td>Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AtomicJ</td>
			<td>American Institute of Physics</td>
			<td>https://doi.org/10.1063/1.4881683</td>
			<td>Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64497/64497eq05.jpg" style="margin: auto;" />, &#8220;AtomicJ: An open source software for analysis of force curves&#8221; Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)</td>
			<td>S271 (&#62;99% purity NaCl), P9541 (&#62;99% purity KCl), BP332(&#62;99% purity Na2HPO4), BP362 (&#62;99% purity KH2PO4)</td>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond tip AFM probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PDNISP</td>
			<td>Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond ultramicrotome blade</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 35&#176;</td>
			<td>2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Gorilla Glue</td>
			<td>26853-31-6</td>
			<td>Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR white resin, medium grade (catalyzed)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14381</td>
			<td>500 mL bottle, Lot #150629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cells (MSCs)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. &#34;Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis&#34; Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. &#34;Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential&#34; Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulus standards</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-SMPKIT-12M</td>
			<td>Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite mica</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>50-12</td>
			<td>12 mm diameter, V1 grade muscovite mica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanscope Analysis</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Version 2.0</td>
			<td>Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5</td>
			<td>POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe holder (fluid, lipid bilayers)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe holder (fluid, MSCs)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>FastScan Bio Z-scanner</td>
			<td>Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe holder (standard, ambient)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>DAFMCH</td>
			<td>Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Puck</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16218</td>
			<td>Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire substrate</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-SMPKIT-12M</td>
			<td>Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>S-3400N-II</td>
			<td>Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon AFM probes (standard)</td>
			<td>NuNano</td>
			<td>Scout 350</td>
			<td>Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon AFM probes (stiff)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>RTESPA-525, RTESPA-525-30&#160;</td>
			<td>Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide grit paper (abrasive discs)</td>
			<td>Allied</td>
			<td>50-10005</td>
			<td>120 grit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC</td>
			<td>Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>DNP</td>
			<td>4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ScanAsyst-Air</td>
			<td>Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 495</td>
			<td>Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000US</td>
			<td>One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip characterization standard</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PFQNM-SMPKIT-12M</td>
			<td>Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%</td>
			<td>Norco</td>
			<td>SPG TUHPNI - T</td>
			<td>T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC6</td>
			<td>Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Barnstead Nanopure Model 7146</td>
			<td>Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces &#8805;18.2 M&#937;*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 &#181;m particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Grinder</td>
			<td>Buehler</td>
			<td>EcoMet 3000</td>
			<td>Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table (active)</td>
			<td>Herzan</td>
			<td>TS-140</td>
			<td>Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table (passive)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>65-531</td>
			<td>35&#34; x 30&#34; vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 &#34;Table Stable&#34; active vibration control table is located on top.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy cantilever-based nanoindentation: mechanical property measurements at the nanoscale in air and fluid

Um microscópio de força atômica (AFM) mede fundamentalmente a interação entre uma ponta de sonda AFM em nanoescala e a superfície da amostra. Se a força aplicada pela ponta da sonda e sua área de contato com a amostra puderem ser quantificadas, é possível determinar as propriedades mecânicas em nanoescala (por exemplo, elástico ou módulo de Young) da superfície a ser sondada. Um procedimento detalhado para a realização de experimentos quantitativos de nanoindentação baseados em balil AFM é fornecido aqui, com exemplos representativos de como a técnica pode ser aplicada para determinar os módulos elásticos de uma ampla variedade de tipos de amostras, variando de kPa a GPa. Estes incluem células-tronco mesenquimais vivas (CTMs) e núcleos em tampão fisiológico, seções transversais de pinheiro loblolly desidratadas embebidas em resina e xistos de Bakken de composição variável.
Além disso, a nanoindentação baseada em balil AFM é usada para sondar a força de ruptura (ou seja, força de ruptura) de bicamadas fosfolipídicas. Considerações práticas importantes, como escolha e desenvolvimento do método, seleção e calibração da sonda, identificação da região de interesse, heterogeneidade da amostra, tamanho e proporção das características, desgaste da ponta, rugosidade da superfície e análise de dados e estatísticas de medição são discutidas para auxiliar na implementação adequada da técnica. Finalmente, a co-localização de mapas nanomecânicos derivados de AFM com técnicas de microscopia eletrônica que fornecem informações adicionais sobre a composição elementar é demonstrada.

Curvas força-deslocamento A Figura 7 mostra curvas F-D representativas e quase ideais obtidas de experimentos de nanoindentação realizados no ar em amostras de pinheiro loblolly emblocadas em resina (Figura 7A) e em fluido (solução salina tamponada com fosfato [PBS]) em núcleos de células-tronco mesenquimais (CTM) (Figura 7B). O uso de qualquer modelo de mecânica de contato depende da determinação preci...

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Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

A quantificação da área de contato e da força aplicadas por uma ponta de sonda de microscópio de força atômica (AFM) à superfície de uma amostra permite a determinação de propriedades mecânicas em nanoescala. As melhores práticas para implementar nanoindentação baseada em balil AFM em ar ou fluido em amostras moles e duras para medir módulo elástico ou outras propriedades nanomecânicas são discutidas.

Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

A microscopia de força atômica, ou nanoindentação baseada em balanços AFM, pode ser usada para determinar as propriedades mecânicas em nanoescala de materiais que variam de módulos, de quilopascais a gigapascals no ar e no fluido. A nanoindentação baseada em balil AFM permite imagens topográficas colocalizadas e medições de propriedades mecânicas quantitativas in situ com precisão e resolução em nanoescala em uma ampla gama de materiais e ambientes relevantes. A nanoindentação baseada em cantilever AFM pode ser usada para diferenciar entre estruturas saudáveis e doentes, tecidos ou células que exibem propriedades mecânicas divergentes.Determinar com precisão a área de contato da amostra da ponta e a força aplicada durante a nanoindentação baseada em cantilever requer uma calibração cuidadosa da sonda AFM, o que é desafiador, mas essencial para medições quantitativas de propriedades mecânicas em nanoescala. Para começar, selecione uma microscopia de força atômica ou sonda AFM apropriada para nanoindentação da amostra pretendida com base no meio, módulo esperado, topografia da amostra e tamanhos de características relevantes. Coloque a sonda no suporte da sonda e conecte-o à cabeça de varredura do AFM.Selecione um modo de nanoindentação apropriado no software AFM que permita o controle do usuário de rampas individuais. Alinhe o laser na parte de trás do cantilever da sonda oposto à localização da ponta da sonda e no detector sensível à posição, ou PSD. Centralize o ponto do feixe de laser na parte de trás do cantiléver, maximizando a tensão da soma.Em seguida, centralize o ponto de feixe de laser refletido no PSD ajustando os sinais de deflexão vertical e horizontal para que sejam o mais próximo possível de zero, fornecendo assim a faixa de deflexão máxima detectável para produzir uma tensão de saída proporcional à deflexão do cantilever. Calibrar a sensibilidade à deflexão, ou DS, do sistema AFM da sonda. Para fazer isso, configure e execute recuos de calibração DS em Safira para obter aproximadamente a mesma deflexão da sonda que os recuos de amostra planejados, uma vez que o deslocamento medido é uma função do ângulo de deflexão da ponta e se torna não linear para grandes deflexões.Repita a rampa cinco vezes. Determine o DS em nanômetros por volt ou a sensibilidade inversa da alavanca óptica e volts por nanômetro a partir da inclinação da porção linear do regime de contato após o ponto de contato inicial na curva de deslocamento de força resultante, ou FD. Use a média dos valores para máxima precisão.Se o desvio padrão relativo exceder 1%, remeça o DS, pois às vezes as primeiras curvas de DF não são ideais devido à introdução inicial de forças adesivas. Se a constante K da mola do cantilever da sonda não estiver calibrada de fábrica, calibre a constante da mola. Se a sonda não tiver uma medição de raio de ponta calibrada de fábrica, meça o raio efetivo da ponta R.Se empregar o método de reconstrução de ponta cega, imagine a caracterização da ponta ou amostra de rugosidade usando uma taxa de varredura lenta e altos ganhos de feedback para ajudar a otimizar o rastreamento das características muito nítidas.Escolha um tamanho de imagem e densidade de pixels com base no raio de ponta esperado. Em seguida, use o software de análise de imagem AFM para modelar a ponta da sonda e estimar seu raio final e diâmetro efetivo da ponta na profundidade de recuo da amostra esperada. Ao concluir a calibração da sonda, insira os valores DS, K e R no software.Finalmente, insira uma estimativa da razão de Poisson da amostra para converter o módulo reduzido medido para o módulo real da amostra. Se empregar um modelo de mecânica de contato cônico ou conosférico baseado na forma da ponta e na profundidade de recuo, é necessário inserir o meio-ângulo da ponta. Navegue pela amostra sob o cabeçalho AFM e envolva-se na região de interesse desejada.Monitore o sinal de deflexão vertical ou execute uma pequena rampa inicial para verificar se a ponta e a amostra estão em contato. Ajuste a posição da cabeça do AFM ligeiramente para cima e rampa novamente. Repita até que a ponta e a amostra estejam fora de contato, como evidenciado por uma rampa quase plana e mínima deflexão vertical do cantilever.Uma vez que nenhuma interação óbvia da amostra da ponta esteja presente, diminua a cabeça do AFM em uma quantidade correspondente a aproximadamente 50% do tamanho da rampa para garantir que a ponta da sonda não colida com a amostra enquanto move manualmente a cabeça do AFM. Rampa novamente, repetindo até que uma boa curva seja observada. Ajuste os parâmetros da rampa.Selecione um tamanho de rampa apropriado dependendo da amostra e da profundidade de recuo desejada. Em seguida, selecione uma taxa de rampa apropriada. Um hertz é um bom ponto de partida para a maioria das amostras.Defina o número de amostras por rampa para alcançar a resolução desejada da medição. Ajuste o X Girar para reduzir as forças de cisalhamento na amostra e na ponta, movendo simultaneamente a sonda ligeiramente na direção X enquanto recua na direção Z. Use um valor para o X Girar igual ao ângulo de deslocamento do suporte da sonda em relação à superfície normal.Em seguida, escolha se deseja empregar uma rampa acionada ou não acionada. Se uma rampa acionada for escolhida, defina o limite de gatilho para resultar no recuo desejado na amostra. Execute um recuo no local escolhido.Selecione e carregue os dados a serem analisados no software. Valores calibrados de entrada para a constante de mola, DS ou sensibilidade inversa da alavanca óptica e raio da ponta da sonda, juntamente com uma estimativa para a razão de Poisson da amostra. Escolha um modelo de mecânica de contato de nanoindentação apropriado para a ponta e a amostra.Execute o algoritmo de ajuste. Verifique se há ajuste adequado das curvas FD. Um baixo erro residual correspondente a um R-quadrado médio próximo à unidade indica um bom ajuste ao modelo escolhido.Se desejar, verifique pontualmente as curvas individuais para inspecionar visualmente a curva, o ajuste do modelo e os pontos de contato calculados. Curvas de FD próximas do ideal obtidas no ar em uma amostra de pinheiro loblolly embebida em resina e em solução salina tamponada com fosfato em um núcleo de células-tronco mesenquimais são mostradas. Com a sonda de silicone, a ponta sofreu um desgaste significativo em relação ao seu estado inicial puro durante a imagem.A cada imagem subsequente, a ponta torna-se progressivamente mais arredondada. Em contraste com a sonda de diamante, o raio da ponta não se alterou dentro dos limites do método de reconstrução da ponta cega, destacando a extrema resistência ao desgaste do diamante. Uma imagem de topografia AFM cobrindo várias células com uma representação pseudo 3D e um mapa de módulo correspondente de uma amostra de pinheiro loblolly é mostrada aqui.O mapa de módulo derivado do AFM gerado durante a obtenção de uma imagem AFM mostra que a inclusão mineral no centro das imagens é significativamente mais difícil do que a matriz orgânica circundante. O efeito do raio e da forma da ponta da sonda na aparência de características de alta proporção de uma amostra de xisto Bakken é mostrado. A nanoindentação baseada em cantilever em células-tronco mesenquimais e núcleos isolados não exibiu diferença estatística no módulo de elasticidade.A morfologia e as propriedades mecânicas das bicamadas lipídicas de colesterol estudadas por AFM são demonstradas aqui. A calibração adequada da sonda e a seleção de parâmetros apropriados em rampa em modelos de mecânica de contato são essenciais para medições nanomecânicas precisas. Além de permitir medições modulares elásticas, a nanoindentação baseada em balanços AFM pode ser usada para sondar a força de ruptura ou força de ruptura das bicamadas fosfolipídicas sob condições fisiológicas relevantes.A nanoindentação baseada em balil AFM permitiu a investigação dos efeitos de knockouts estruturais, tratamentos farmacêuticos e vibrações de baixa intensidade para simular o exercício sobre as propriedades mecânicas de núcleos de células-tronco mesenquimais.

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