Name: assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

这项工作得到了美国国立卫生研究院（R37CA266344,1K99CA273304）、国防部（CA201127）、妙佑医疗国际K2R管道（S.S.K.）、妙佑医疗国际个体化医学中心（S.S.K.）和Predolin基金会（R.L.S.）的部分支持。此外，我们要感谢妙佑医疗国际核磁共振核心设施的工作人员。 图 1 是在 BioRender.com 中创建的

本协议遵循妙佑医疗国际机构审查委员会 （IRB）、机构动物护理和使用委员会 （IACUC A00001767） 和机构生物安全委员会 （IBC， Bios00000006.04） 的指南。
注意：用于小鼠的所有材料必须是无菌的。
1.向NSG小鼠注射白消安
<ol><li>获得雄性，8-12周龄，免疫功能低下，NOD-SCID IL2rγnull（NSG）小鼠，并在注射前称重。 注意：为了统计显着性，建议每...

在本报告中，描述了一种使用 ALL PDX 模型评估 CART 细胞相关毒性的方法。更具体地说，该模型试图模仿两种危及生命的毒性，CRS和NI，患者在输注CART细胞后经常经历。它概括了在临床上观察到的CART毒性的许多特征：体重减轻，运动功能障碍，神经炎症，炎性细胞因子和趋化因子产生，以及不同效应细胞浸润到中枢神经系统8,20,28。<...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法彻底改变了癌症免疫治疗领域。它已被证明可成功治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病 （ALL）、大 B 细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和多发性骨髓瘤 1,2,3,4,5,6,7，最近获得了 FDA 的批准。尽管在临床试验中取得了初步成功，但CART细胞疗法的毒性通常很严重，偶尔会致命。CART细胞治疗后最常见的毒性包括CRS和NI的发展，也称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）8,9。CRS是由于CART细胞在体内的过度活化和大量扩增引起的，导致随后分泌多种炎性细胞因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-6（IL-6）。这会导致低血压、高烧、毛细血管渗漏综合征、呼吸衰竭、多器官衰竭，在某些情况下会导致死亡10,11。CRS在CART19细胞疗法后50-100%的病例中发展11,12,13。ICANS是与CART细胞治疗相关的另一种独特的不良事件，其特征是全身性脑水肿，意识模糊，反应迟钝，失语，运动无力，偶尔癫痫发作9,14。任何级别的ICANS发生在多达70%的患者中，据报道3-4级发生在20-30%的患者中5,10,15,16。总体而言，CRS和ICANS很常见，可能是致命的。
CART细胞治疗后ICANS的管理具有挑战性。大多数ICANS患者也会出现CRS17，通常可以用IL-6受体拮抗剂托珠单抗或类固醇18治疗。之前的一份报告显示，托珠单抗的早期干预降低了严重CRS的发生率，但不影响ICANS19的发病率或严重程度。目前，ICANS没有有效的治疗方法或预防剂，研究预防策略至关重要20。
骨髓细胞和相关细胞因子/趋化因子被认为是CRS和ICANS21发展的主要驱动力。虽然CRS与细胞因子的极端升高和T细胞扩增直接相关，但ICANS的病理生理学在很大程度上是未知的22,23。因此，当务之急是建立一个小鼠模型，概括CART细胞治疗后的这些毒性，以研究其机制并制定预防策略。
目前有多种临床前动物模型用于研究、优化和验证 CART 细胞的功效，以及监测其相关毒性。这些包括同系、异种移植、免疫功能正常的转基因、人源化转基因和患者来源的异种移植小鼠，以及灵长类动物模型。然而，这些模型中的每一个都有缺点，有些不能反映CART细胞24,25的真正功效或安全问题。因此，必须仔细选择适合研究预期目标的最佳模型。
本文旨在描述用于评估CART细胞相关毒性，CRS和NI的方法，使用ALL患者来源的异种移植（PDX）体内模型（图1）。具体来说，在这里描述的方法中，按照先前描述的方案使用作者实验室中产生的CART19细胞。简而言之，通过密度梯度技术从健康供体外周血单核细胞（PBMC）中分离人T细胞，在第0天用CD3 / CD28磁珠刺激，并在第1天用由CD19靶向单链可变片段组成的CARs等地转入4-1BB和CD3ζ信号结构域。然后将这些 CART 细胞扩增，在第 6 天去珠，并在第 8 天冷冻保存 26,27,28,29,30。如前所述，小鼠接受淋巴细胞消耗治疗，然后施用患者来源的白血病原始细胞（ALL）28。首先，通过下颌下采血验证肿瘤植入。在建立适当的肿瘤负荷后，将CART19细胞施用于小鼠。然后，每天对小鼠称重以评估健康状况。进行小动物磁共振成像（MRI）以评估NI，同时进行尾部出血以评估T细胞扩增和细胞因子/趋化因子的产生。强烈建议将下面描述的技术用作在PDX模型中研究CART细胞相关毒性的模型。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;APC Anti-Human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>Wecol</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze 14.0 software</td>
			<td>AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td>Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>Red blood cells lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fin IV insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance II 7 Tesla&#160;</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MRI machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Busulfan (NSC-750)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERT Control/Gating Module&#160;</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1030</td>
			<td>Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Bright-Line</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Liquid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 Lithium heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>Blood collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HCYTMAG-60K-PX38</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscan</td>
			<td>Ge Healthcare Inc.</td>
			<td>0407-0690-10</td>
			<td>Gadolinium-based constrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pd Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polysterene Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Surgical Blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法已成为治疗多种CD19+ 恶性肿瘤的有力工具，这导致FDA最近批准了几种CD19靶向CART（CART19）细胞疗法。然而，CART细胞疗法与一组独特的毒性有关，这些毒性具有自己的发病率和死亡率。这包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经炎症（NI）。临床前小鼠模型的使用在CART技术的研究和开发中至关重要，用于评估CART功效和CART毒性。测试这种过继细胞免疫疗法的可用临床前模型包括同系、异种移植、转基因和人源化小鼠模型。没有单一的模型可以无缝地反映人体免疫系统，每个模型都有优点和缺点。本文旨在描述一种患者来源的异种移植模型，该模型使用急性淋巴细胞白血病患者的白血病原始细胞作为评估CART19相关毒性，CRS和NI的策略。该模型已被证明可以概括CART19相关的毒性以及临床上看到的治疗效果。

该协议的目的是使用来自ALL患者肿瘤细胞的PDX小鼠模型评估CART细胞相关毒性（图1）。首先，NSG小鼠接受腹膜注射白消安（30mg / kg），目的是免疫抑制它们并促进CART细胞植入28。第二天，他们收到了来自所有患者的~5×106 个PBMC（IV）。通过尾部出血测定 监测 小鼠的植入~13周。收集并裂解红细胞，然后进行流式细胞术制备以评估CD19 + ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

在这里，我们描述了一种方案，其中使用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植模型作为评估和监测CD19靶向嵌合抗原受体T细胞相关毒性的策略。

使用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植小鼠模型评估嵌合抗原受体T细胞相关毒性

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

该协议利用人CAR-T和肿瘤细胞，并准确证明与CART19给药相关的毒性。因此，概括一下在临床上观察到的情况。使用该平台的主要优点是它提供了一个可翻译的和临床相关的模型，其中利用了人类T细胞和肿瘤细胞。该模型不仅可以有效评估CART19相关毒性，还可以让我们更好地了解如何通过改进治疗策略来克服这些毒性。首先，每天两次监测CART19小鼠，以评估其健康状况的任何变化，例如运动无力，驼背和体重减轻。一旦小鼠出现运动无力和体重减轻，收集外周血以分析肿瘤负荷。并进行细胞因子的血清分离，如手稿中所述。分离后，将血清微量离心管储存在80摄氏度，并使用CERA使用多重测定法分析趋化因子和细胞因子。对于MRI成像，将120微升钆与880微升盐水溶液混合，然后装入一毫升胰岛素注射器中。将100微升制备的溶液腹膜内注射到每只小鼠中。麻醉鼠标并将其放在与啮齿动物兼容的摇篮探针上。然后用牙齿钩在咬杆上。将鼠标头拉入25毫米体积线圈中，并调整拴在异氟烷麻醉系统上的鼻锥。拧紧咬杆的旋钮，以在扫描期间保持该位置。对于呼吸评估，将呼吸监测装置的探头靠近横膈膜，并用手术胶带固定。将呼吸频率保持在每分钟20至60次呼吸之间，以使小鼠状况保持稳定。将动物探头插入垂直孔小动物MRI系统内的小孔中，并在线圈中心调整动物的头部。使用锁将设备固定在直立位置并将仪器连接到计算机。接下来，打开ParaVision软件以设置扫描位置和扫描类型。确定最佳矢状位和轴向位置，同时保持所有实验组的一致性。要收集 T1 加权 MRI 数据，请使用 T1 加权多层、多回波序列，重复时间为 300 毫秒，回波时间为 9.5 毫秒，视野为 4.00 X 2.00 X 2.00 厘米，矩阵为 192 X 96 X 96。对于 T2 加权 MRI 图像，请使用具有相似参数的多层、多回波序列。扫描完成后，从孔中取出探头，然后通过从咬杆上取下牙齿来轻轻拔出鼠标。从软件中提取数据后，使用分析软件对用CART19处理的小鼠和使用流式细胞术的未处理小鼠进行比较，对高信号区域的CD19 +肿瘤细胞群进行定量和3D体积渲染。在用CART19细胞处理的小鼠中观察到显着的体重减轻。体重减轻被认为是CRS外观的症状，这与CART细胞相关的毒性有关。多重测定揭示了CART19给药前后NSG小鼠血清中细胞因子和趋化因子的表达。T2加权图像显示CART19治疗小鼠在神经炎症期间水肿和可能的炎症浸润的证据。而T1加权MRI显示脑实质内的对比增强，表明血管通透性增加。基于与血管通透性相对应的T1高信号区域组装啮齿动物大脑的三维重建，该区域呈现大脑中钆渗漏的体积。重要的是要记住，CART19给药后对小鼠的日常身体监测以及外周出血将是进行MRI以全面评估大脑中指示CRS或神经毒性的任何变化的最佳指标。该技术广泛适用于其他CAR-T细胞疗法，并将使科学家能够有效地测试新型CAR-T细胞产生的潜在毒性。该模型是了解如何监测，治疗和用于验证新的CAR-T细胞模型的垫脚石。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

开发和维护的临床前患者来源的肿瘤异种移植模型为新的抗癌疗法的调查

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

科研

癌症研究

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

离心淘洗制备不同细胞周期的原发性急性淋巴细胞白血病细胞

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

流式细胞仪估测原发性急性髓系白血病和患者源性移植中白血病干细胞的诊断和随访

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

应用 Fraumeni 综合征诱导多潜能干细胞建模骨肉瘤

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

原发性白血病细胞代谢谱的评价

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

体外肿瘤细胞恢复对 chimeric 抗原受体 t 细胞抗肿瘤功能的预测评价

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

患者衍生的胰腺癌异质异种移植模型,使用斑马鱼幼虫作为比较药物评估的宿主

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

黑色素瘤患者衍生异种移植模型

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

制造用于采用免疫疗法的奇美抗原受体（CAR）T细胞

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...