Name: assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00
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この作業の一部は、国立衛生研究所(R37CA266344、1K99CA273304)、国防総省(CA201127)、メイヨークリニックK2Rパイプライン(S.S.K.)、メイヨークリニック個別化医療センター(S.S.K.)、およびプレドリン財団(R.L.S.)を通じて支援されました。また、メイヨークリニックNMRコア施設のスタッフにも感謝申し上げます。 図 1 は BioRender.com で作成されたものです

このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB)、施設動物の管理および使用委員会(IACUC A00001767)、および施設バイオセーフティ委員会(IBC、Bios00000006.04)のガイドラインに従います。
注:マウスを扱うために使用されるすべての材料は無菌でなければなりません。
1. NSGマウスへのブスルファン注射
<ol><li>8〜12週齢の雄、免疫?...

本報告では、ALL PDXモデルを用いてCART細胞関連毒性を評価する方法論について述べる。より具体的には、このモデルは、患者がCART細胞の注入後にしばしば経験する2つの生命を脅かす毒性、CRSおよびNIを模倣しようとしています。これは、クリニックで観察されたCART毒性の多くの特徴を要約します:体重減少、運動機能障害、神経炎症、炎症性サイトカインおよびケモカイン産生、および中<sup ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました。再発/難治性の急性リンパ芽球性白血病(ALL)、大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および多発性骨髄腫の治療に成功することが証明されており、最近のFDA承認につながっています。臨床試験での最初の成功にもかかわらず、CART細胞療法による治療は、しばしば重篤で時には致命的な毒性をもたらします。CART細胞療法後の最も一般的な毒性には、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群(ICANS)とも呼ばれるCRSおよびNIの発症が含まれます8,9。CRSは、in vivoでのCART細胞の過剰活性化と大規模な増殖によって引き起こされ、その後、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子-α、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびインターロイキン-6(IL-6)を含む複数の炎症性サイトカインの分泌につながります。これは、低血圧、高熱、毛細血管漏出症候群、呼吸不全、多臓器不全、そして場合によっては死に至る10,11をもたらします。CRSは、CART19細胞療法後の症例の50〜100%で発症する11、12、13。ICANSは、CART細胞療法に関連する別のユニークな有害事象であり、全身性脳浮腫、混乱、鈍化、失語症、運動衰弱、そして時には発作を特徴としています9,14。ICANSのどのグレードも患者の最大70%で発生し、グレード3〜4は患者の20〜30%で報告されています5、10、15、16。全体として、CRSとICANSは一般的であり、致命的となる可能性があります。
CART細胞療法後のICANSの管理は困難です。ICANSのほとんどの患者はCRS17も経験し、IL-6受容体拮抗薬トシリズマブまたはステロイド18で治療できることがよくあります。以前の報告では、トシリズマブの早期介入は重症CRSの発生率を低下させたが、ICANS19の発生率または重症度には影響しなかったことが明らかになった。現在、ICANSに対する有効な治療法や予防薬は存在せず、予防戦略を検討することが重要です20。
骨髄系細胞および関連するサイトカイン/ケモカインは、CRSおよびICANS21の開発の主な推進力であると考えられています。CRSはサイトカインの極端な上昇とT細胞増殖に直接関係していますが、ICANSの病態生理はほとんど知られていません22,23。したがって、CART細胞療法後のこれらの毒性を再現するマウスモデルを確立し、メカニズムを研究し、予防戦略を開発することが不可欠です。
現在、CART細胞の有効性を研究、最適化、検証し、関連する毒性を監視するために使用されている複数の前臨床動物モデルがあります。これらには、霊長類モデルに加えて、同系、異種移植片、免疫適格トランスジェニック、ヒト化トランスジェニック、および患者由来の異種移植片マウスが含まれる。しかしながら、これらのモデルの各々は欠点を有し、そしていくつかはCART細胞の真の有効性または安全性の懸念を反映していない24、25。したがって、研究の意図された目的に最適なモデルを慎重に選択することが不可欠です。
この記事では、ALL患者由来の異種移植片(PDX)in vivoモデルを使用して、CART細胞関連毒性であるCRSおよびNIを評価するために使用される方法論について説明します(図1)。具体的には、ここに記載の方法では、著者らの研究室で作製したCART19細胞を、前述のプロトコールに従って使用する。簡単に説明すると、ヒトT細胞は、密度勾配法を介して健康なドナー末梢血単核細胞(PBMC)から単離され、0日目にCD3 / CD28ビーズで刺激され、1日目に4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインに融合したCD19標的一本鎖可変断片で構成されるCARでレンチウイルス形質導入されます。次に、これらのCART細胞を増殖させ、6日目にビーズを除去し、8日目に凍結保存します26、27、28、29、30日目。先に概説したように、マウスはリンパ球枯渇治療を受け、続いて患者由来の白血病芽球(ALL)を投与される28。まず、腫瘍の生着が顎下採血によって検証されます。適切な腫瘍量の確立に続いて、CART19細胞をマウスに投与する。次に、マウスの体重を毎日測定して、健康状態を評価します。小動物磁気共鳴画像法(MRI)は、T細胞の増殖とサイトカイン/ケモカイン産生を評価するために尾部出血とともにNIを評価するために実行されます。以下に説明する手法は、PDXモデルでCART細胞関連毒性を研究するためのモデルとして使用することを強くお勧めします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;APC Anti-Human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>Wecol</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze 14.0 software</td>
			<td>AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td>Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>Red blood cells lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fin IV insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance II 7 Tesla&#160;</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MRI machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Busulfan (NSC-750)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERT Control/Gating Module&#160;</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1030</td>
			<td>Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Bright-Line</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Liquid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 Lithium heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>Blood collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HCYTMAG-60K-PX38</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscan</td>
			<td>Ge Healthcare Inc.</td>
			<td>0407-0690-10</td>
			<td>Gadolinium-based constrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pd Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polysterene Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Surgical Blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model

キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、複数のタイプのCD19+ 悪性腫瘍を治療するための強力なツールとして登場し、最近、いくつかのCD19標的CART(CART19)細胞療法のFDA承認につながっています。ただし、CART細胞療法は、独自の罹患率と死亡率を伴う独自の毒性のセットに関連しています。これには、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経炎症(NI)が含まれます。前臨床マウスモデルの使用は、CARTの有効性とCART毒性の両方を評価するためのCART技術の研究開発において非常に重要です。この養子細胞免疫療法をテストするために利用可能な前臨床モデルには、同系、異種移植片、トランスジェニック、およびヒト化マウスモデルが含まれます。人間の免疫システムをシームレスに反映する単一のモデルはなく、各モデルには長所と短所があります。この論文は、CART19関連毒性、CRS、およびNIを評価するための戦略として、急性リンパ芽球性白血病患者からの白血病芽球を使用した患者由来の異種移植片モデルを説明することを目的としています。このモデルは、クリニックで見られるように、CART19関連の毒性と治療効果を再現することが示されています。

このプロトコルの目的は、ALL患者の腫瘍細胞からのPDXマウスモデルを使用してCART細胞関連毒性を評価することです(図1)。まず、NSGマウスにブスルファン(30 mg/kg)のi.p.注射を行い、免疫抑制とCART細胞の生着促進を目的として投与しました28。翌日、彼らはすべての患者に由来する106 PBMC (i.v.)×~5を受け取りました。マウスは、尾出血アッセイ ?...

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Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

ここでは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の異種移植片モデルを、CD19標的キメラ抗原受容体T細胞関連毒性を評価および監視するための戦略として使用するプロトコルについて説明します。

急性リンパ芽球性白血病患者由来異種移植マウスモデルを用いたキメラ抗原受容体T細胞関連毒性の評価

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

このプロトコルは、ヒトCAR-Tおよび腫瘍細胞を利用し、CART19投与に関連する毒性を正確に実証します。したがって、診療所で観察されたことを要約する。このプラットフォームを使用する主な利点は、ヒトT細胞と腫瘍細胞が利用される翻訳可能で臨床的に関連するモデルを提供することです。このモデルは、CART19に関連する毒性の効率的な評価を可能にするだけでなく、改善された治療戦略を通じてこれらの毒性を克服する方法をよりよく理解することを可能にします。まず、CART19を投与されたマウスを1日2回監視して、運動衰弱、猫背、体重減少などの健康の変化を評価します。マウスが運動衰弱と体重減少を発症したら、末梢血を収集して腫瘍量を分析します。サイトカインについて血清単離を行い、原稿に記載されているようにする。単離後、血清マイクロ遠心チューブを摂氏80度で保存し、CERAを使用してマルチプレックスアッセイを使用してケモカインとサイトカインを分析します。MRIイメージングでは、120マイクロリットルのガドリニウムと880マイクロリットルの生理食塩水を混合し、1ミリリットルのインスリンシリンジに装填します。調製した溶液100マイクロリットルを各マウスの腹腔内注射する。マウスを麻酔し、げっ歯類と互換性のあるクレードルプローブに置きます。次に、歯をバイトバーに引っ掛けます。マウスのヘッドを25ミリメートルの体積コイルに引き込み、イソフルラン麻酔システムにつながれたノーズコーンを調整します。バイトバーのノブを締めて、スキャン中は位置を維持します。呼吸評価は、呼吸監視装置のプローブを横隔膜の近くに取り付け、サージカルテープで固定します。呼吸数を毎分20〜60回の呼吸に保ち、マウスの状態が安定するようにします。動物プローブを垂直穴小動物MRIシステム内の小口径に挿入し、コイルの中央で動物の頭を調整します。ロックを使用して、装置を直立位置に固定し、機器をコンピューターに接続します。次に、ParaVisionソフトウェアを開いて、スキャンの位置とスキャンの種類を設定します。すべての実験グループで一貫性を保ちながら、最適な矢状位置と軸位置を決定します。T1 強調 MRI データを収集するには、繰り返し時間が 300 ミリ秒、エコー時間が 9.5 ミリ秒、視野が 4.00 X 2.00 X 2.00 センチメートル、マトリックスが 192 X 96 X 96 の T1 強調マルチスライス、マルチエコー シーケンスを使用します。T2強調MRI画像の場合は、同様のパラメータを持つマルチスライス、マルチエコーシーケンスを使用します。スキャンが完了したら、プローブをボアから取り外し、バイトバーから歯を外してマウスをそっと抽出します。ソフトウェアからデータを抽出した後、超高強度領域の定量化と3Dボリュームレンダリングのための分析ソフトウェアを使用して、CD19+腫瘍細胞集団を、フローサイトメトリーを使用してCART19で処理したマウスと未処理のマウスの間で比較しました。有意な体重減少は、CART19細胞で処置したマウスにおいて観察された。体重減少は、CART細胞関連毒性に関連するCRS出現の症状と見なされます。マルチプレックスアッセイにより、CART19投与前後のNSGマウス血清中のサイトカインおよびケモカインの発現が明らかになりました。T2強調画像は、CART19治療マウスにおける神経炎症中の浮腫および炎症性浸潤の可能性の証拠を明らかにした。一方、T1強調MRIでは脳実質内で造影が亢進し、血管透過性の増加が示されました。げっ歯類の脳の3次元再構成は、脳内のガドリニウム漏出の体積をレンダリングする血管透過性に対応するT1高信号領域に基づいて組み立てられました。CART19投与後のマウスの毎日の物理的モニタリングは、末梢出血とともに、CRSまたは神経毒性を示す脳の変化を完全に評価するためのMRIを進めるための最良の指標になることを覚えておくことが重要です。この技術は、追加のCAR-T細胞療法に広く適用可能であり、科学者は新しいCAR-T細胞から生じる潜在的な毒性を効率的にテストすることができます。この提案されたモデルは、CAR-T細胞に関連する毒性を監視、治療、および新しいCAR-T細胞モデルを検証するために使用する方法を理解するための足がかりです。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

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キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

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比較薬評価の宿主としてゼブラフィッシュ幼虫を用いた膵臓癌の患者由来異種異種移植片モデル

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

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黒色腫患者由来異種移植片モデル

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

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胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...