Name: assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

Este trabalho foi parcialmente apoiado através do National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (S.S.K.), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) e Predolin Foundation (R.L.S.). Além disso, gostaríamos de agradecer à equipe do Mayo Clinic NMR Core Facility. A Figura 1 foi criada em BioRender.com

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Mayo Clinic, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC A00001767) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBC, Bios00000006.04).
NOTA: Todos os materiais utilizados para trabalhar com ratos devem ser estéreis.
1. Injeção de bussulfano em camundongos NSG
<ol><li>Obter camundongos machos, 8-12 semanas de idade, imunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (...

Neste relatório, uma metodologia para avaliar a toxicidade associada a células CART usando um modelo ALL PDX foi descrita. Mais especificamente, este modelo procura mimetizar duas toxicidades potencialmente fatais, RSC e NI, que os pacientes frequentemente experimentam após a infusão de células CART. Ela recapitula muitas características das toxicidades da CART observadas na clínica: perda de peso, disfunção motora, neuroinflamação, produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas e infiltração de difere...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) revolucionou o campo da imunoterapia contra o câncer. Provou ser bem-sucedida no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refratária, linfoma de grandes células B, linfoma de células do manto, linfoma folicular e mieloma múltiplo1,2,3,4,5,6,7, levando a recentes aprovações do FDA. Apesar do sucesso inicial nos ensaios clínicos, o tratamento com terapia celular CART resulta em toxicidades muitas vezes graves e ocasionalmente letais. As toxicidades mais comuns após a terapia celular com CART incluem o desenvolvimento de RN e RN, também conhecida como síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS)8,9. A RSC é causada devido à superativação e expansão maciça das células CART in vivo, levando à secreção subsequente de múltiplas citocinas inflamatórias, incluindo interferon-γ, fator de necrose tumoral-α, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Isso resulta em hipotensão, febre alta, síndrome de extravasamento capilar, insuficiência respiratória, falência de múltiplos órgãos e, em alguns casos, morte10,11. A RSC desenvolve-se em 50-100% dos casos após terapia celular com CART1911,12,13. A ICANS é outro evento adverso único associado à terapia celular com CART e é caracterizada por edema cerebral generalizado, confusão, obnubilação, afasia, fraqueza motora e, ocasionalmente, convulsões 9,14. Qualquer grau de ICANS ocorre em até 70% dos pacientes, e os graus 3-4 são relatados em 20-30% dos pacientes 5,10,15,16. Em geral, a SRC e a ICANS são comuns e podem ser fatais.
O manejo da ICANS após a terapia celular com CART é desafiador. A maioria dos pacientes com ICANS também apresenta RSC17, que muitas vezes pode ser tratada com o antagonista do receptor de IL-6 tocilizumabe ou esteroides18. Um relato anterior revelou que a intervenção precoce com tocilizumabe diminuiu a taxa de RSC grave, mas não afetou a incidência ou a gravidade da ICANS19. Atualmente, não há tratamento efetivo ou agente profilático para o ICANS, sendo crucial investigar estratégiaspreventivas 20.
Acredita-se que as células mieloides e as citocinas/quimiocinas associadas sejam os principais impulsionadores do desenvolvimento da RSC e ICANS21. Enquanto a RSC está diretamente relacionada à elevação extrema de citocinas e expansão de células T, a fisiopatologia da ICANS é amplamente desconhecida22,23. Portanto, é imperativo estabelecer um modelo de camundongo que recapitule essas toxicidades após a terapia celular com CART para estudar os mecanismos e desenvolver estratégias preventivas.
Existem vários modelos animais pré-clínicos atualmente usados para estudar, otimizar e validar a eficácia de células CART, bem como para monitorar suas toxicidades associadas. Estes incluem camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos imunocompetentes, transgênicos humanizados e xenoenxertos derivados de pacientes, além de modelos de primatas. No entanto, cada um desses modelos apresenta desvantagens, e alguns não refletem as verdadeiras preocupações de eficácia ou segurança das células CART24,25. Portanto, é imperativo a escolha criteriosa do melhor modelo para os objetivos pretendidos do estudo.
Este artigo procura descrever a metodologia utilizada para avaliar a toxicidade associada às células CART, RNC e NI, utilizando um modelo in vivo de xenoenxerto derivado de ALL (PDX) (Figura 1). Especificamente, nos métodos aqui descritos, as células CART19 geradas em nosso laboratório são utilizadas seguindo protocolos previamente descritos. Resumidamente, as células T humanas são isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis por meio de uma técnica de gradiente de densidade, estimuladas com esferas CD3/CD28 no dia 0 e transduzidas lentiviricamente no dia 1 com CARs compostas por um fragmento variável de cadeia única direcionado para CD19 fundido aos domínios de sinalização 4-1BB e CD3ζ. Essas células CART são então expandidas, desfrisadas no 6º dia e criopreservadas no 8º dia 26,27,28,29,30. Como descrito anteriormente, camundongos são submetidos a tratamento linfodepletante, seguido pela administração de blastos leucêmicos derivados do paciente (LLA)28. Primeiro, verifica-se a enxertia tumoral por meio da coleta de sangue submandibular. Após o estabelecimento de uma carga tumoral apropriada, as células CART19 são administradas aos camundongos. Em seguida, os ratos são pesados diariamente para avaliar o bem-estar. A ressonância magnética (RM) de pequenos animais é realizada para avaliar a infecção hospitalar, juntamente com o sangramento da cauda para avaliar a expansão de células T e a produção de citocinas/quimiocinas. As técnicas descritas abaixo são altamente recomendadas para serem usadas como modelo para estudar toxicidades associadas a células CART em um modelo PDX.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;APC Anti-Human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>Wecol</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze 14.0 software</td>
			<td>AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td>Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>Red blood cells lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fin IV insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance II 7 Tesla&#160;</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MRI machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Busulfan (NSC-750)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERT Control/Gating Module&#160;</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1030</td>
			<td>Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Bright-Line</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Liquid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 Lithium heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>Blood collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HCYTMAG-60K-PX38</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscan</td>
			<td>Ge Healthcare Inc.</td>
			<td>0407-0690-10</td>
			<td>Gadolinium-based constrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pd Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polysterene Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Surgical Blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) emergiu como uma ferramenta poderosa para o tratamento de vários tipos de malignidades CD19+ , o que levou à recente aprovação pelo FDA de várias terapias celulares CART direcionadas para CD19 (CART19). No entanto, a terapia celular CART está associada a um conjunto único de toxicidades que carregam sua própria morbidade e mortalidade. Isso inclui a síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a neuroinflamação (NI). O uso de modelos pré-clínicos em camundongos tem sido crucial na pesquisa e desenvolvimento da tecnologia CART para avaliar tanto a eficácia quanto a toxicidade da CART. Os modelos pré-clínicos disponíveis para testar essa imunoterapia celular adotiva incluem modelos de camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos e humanizados. Não há um modelo único que espelhe perfeitamente o sistema imunológico humano, e cada modelo tem pontos fortes e fracos. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes usando blastos leucêmicos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda como estratégia para avaliar toxicidades associadas à CART19, RSC e NI. Demonstrou-se que esse modelo recapitula as toxicidades associadas à CART19, bem como a eficácia terapêutica observada na clínica.

O objetivo deste protocolo é avaliar a toxicidade associada às células CART usando um modelo PDX de células tumorais de pacientes com LLA (Figura 1). Primeiro, camundongos NSG receberam injeções i.p. de bussulfano (30 mg/kg) com o objetivo de imunossuprimi-los e facilitar o enxerto de células CART28. No dia seguinte, receberam ~5 × 106 PBMCs (i.v.) derivados de TODOS os pacientes. Os camundongos foram monitorados para enxerto por ~13 semanas atr...

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Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Este protocolo utiliza CAR-T humano e células tumorais e demonstra com precisão as toxicidades associadas à administração de CART19. Portanto, recapitulando o que foi observado na clínica. A principal vantagem do uso dessa plataforma é que ela fornece um modelo traduzível e clinicamente relevante onde células T humanas e células tumorais são utilizadas.Este modelo não só permite uma avaliação eficiente das toxicidades associadas à CART19, mas também nos permite entender melhor como podemos superar essas toxicidades por meio de estratégias de tratamento aprimoradas. Para começar, monitore os camundongos administrados pelo CART19 duas vezes ao dia para avaliar quaisquer alterações em seu bem-estar, como fraqueza motora, corpo curvado e perda de peso corporal. Uma vez que os ratos desenvolvem fraqueza motora e redução de peso, colete seu sangue periférico para analisar a carga tumoral.E realizar isolamento sérico para citocinas, conforme descrito no manuscrito. Após o isolamento, armazenar os tubos de microcentrífuga de soro a 80 graus Celsius e usar a cera para analisar as quimiocinas e citocinas usando o ensaio multiplex. Para imagens de ressonância magnética, misture 120 microlitros de gadolínio com 880 microlitros de solução salina e carregue em uma seringa de insulina de um mililitro.Injetar 100 microlitros da solução preparada por via intraperitoneal em cada rato. Anestesiar o mouse e colocá-lo na sonda de berço compatível com roedor. Em seguida, prenda os dentes na barra de mordida.Puxe a cabeça do rato para dentro da bobina de volume de 25 milímetros e ajuste o cone nasal preso ao sistema de anestesia com isoflurano. Aperte o botão da barra de mordida para manter a posição durante a varredura. Para avaliação da respiração, conecte a sonda de um dispositivo de monitoramento respiratório próximo ao diafragma e fixe-a com fita cirúrgica.Mantenha a taxa de respiração entre 20 a 60 respirações por minuto para que a condição dos ratos permaneça estável. Insira a sonda do animal no pequeno furo dentro do sistema de ressonância magnética de pequenos animais de furo vertical e ajuste a cabeça do animal no centro da bobina. Usando a trava, prenda o aparelho na posição vertical e conecte o instrumento ao computador.Em seguida, abra o software ParaVision para configurar as posições de varredura e os tipos de varreduras. Determinar as posições sagitais e axiais ideais, mantendo-as consistentes para todos os grupos experimentais. Para a coleta dos dados ponderados em T1 na RM, utilizou-se a sequência multi-slice, multieco ponderada em T1, com tempo de repetição de 300 milissegundos, tempo de eco de 9,5 milissegundos, campo de visão de 4,00 X 2,00 X 2,00 centímetros e matriz de 192 X 96 X 96.Para imagens de RM ponderadas em T2, use uma sequência multi-slice, multi-eco com parâmetros semelhantes. Quando as varreduras estiverem concluídas, remova a sonda do furo e extraia suavemente o mouse removendo os dentes da barra de mordida. Após a extração dos dados do software, utilizou-se um software de análise para a quantificação e renderização do volume 3D das regiões de hiperintensidade, as populações de células tumorais CD19+ foram comparadas entre camundongos tratados com CART19 e camundongos não tratados por citometria de fluxo.Redução significativa de peso foi observada em camundongos tratados com células CART19. A perda de peso é considerada como um sintoma do aparecimento da RSC, que está relacionada às toxicidades associadas às células CART. Um ensaio multiplex revelou a expressão de citocinas e quimiocinas no soro de camundongos NSG antes e após a administração de CART19.Imagens ponderadas em T2 revelaram evidências de edema e possível infiltrado inflamatório durante neuroinflamação em camundongos tratados com CART19. Já a RM ponderada em T1 mostrou realce pelo meio de contraste no parênquima cerebral, indicando aumento da permeabilidade vascular. Reconstruções tridimensionais do cérebro de roedores foram montadas com base em regiões de hiperintensidade T1 correspondentes à permeabilidade vascular, o que torna o volume de extravasamento de gadolínio no cérebro.É importante lembrar que o monitoramento físico diário dos camundongos após a administração de CART19, juntamente com o sangramento periférico, será o melhor indicador para prosseguir com a ressonância magnética para avaliar completamente quaisquer alterações no cérebro indicativas de SRC ou neurotoxicidade. Esta tecnologia é amplamente aplicável a terapias adicionais de células CAR-T e permitirá que os cientistas testem eficientemente potenciais toxicidades decorrentes de novas células CAR-T. Este modelo proposto é um trampolim na compreensão de como as toxicidades associadas às células CAR-T podem ser monitoradas, tratadas e usadas para validar novos modelos de células CAR-T.

Research

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The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

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