Name: assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (R37CA266344, 1K99CA273304), Министерством обороны (CA201127), Клиникой Мэйо K2R (S.S.K.), Центром индивидуализированной медицины клиники Майо (S.S.K.) и Фондом Преддолин (R.L.S.). Кроме того, мы хотели бы поблагодарить персонал основного центра ЯМР клиники Майо. Рисунок 1 был создан в BioRender.com

Этот протокол соответствует рекомендациям Институционального наблюдательного совета (IRB) клиники Майо, Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC A00001767) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC, Bios00000006.04).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все матери?...

В настоящем отчете описана методология оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели ALL PDX. В частности, эта модель стремится имитировать две опасные для жизни токсичности, CRS и NI, которые пациенты часто испытывают после инфузии клеток CART. Он повторяет многие...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) произвела революцию в области иммунотерапии рака. Он доказал свою эффективность в лечении рецидивирующего/рефрактерного острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), крупноклеточной В-клеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы и множественной миеломы 1,2,3,4,5,6,7, что привело к недавним одобрениям FDA. Несмотря на первоначальный успех в клинических испытаниях, лечение клеточной терапией CART приводит к токсичности, которая часто бывает тяжелой, а иногда и летальной. Наиболее распространенные токсичные явления после клеточной терапии CART включают развитие CRS и NI, также называемого синдромом нейротоксичности, ассоциированным с иммунными эффекторными клетками (ICANS)8,9. CRS вызывается гиперактивацией и массивной экспансией клеток CART in vivo, что приводит к последующей секреции нескольких воспалительных цитокинов, включая интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-6 (IL-6). Это приводит к гипотонии, высокой температуре, синдрому капиллярной утечки, дыхательной недостаточности, полиорганной недостаточности, а в некоторых случаях и к смерти10,11. СВК развивается в 50-100% случаев после клеточной терапии CART1911,12,13. ICANS является еще одним уникальным нежелательным явлением, связанным с клеточной терапией CART, и характеризуется генерализованным отеком головного мозга, спутанностью сознания, обтукцией, афазией, двигательной слабостью, а иногда и судорогами 9,14. Любая степень ICANS встречается у 70% пациентов, а степени 3-4 отмечаются у 20-30% пациентов 5,10,15,16. В целом, CRS и ICANS являются распространенными и могут привести к летальному исходу.
Ведение ICANS после клеточной терапии CART является сложной задачей. У большинства пациентов с ICANS также наблюдается СВК17, который часто можно лечить антагонистом рецепторов IL-6 тоцилизумабом или стероидами18. Предыдущее сообщение показало, что раннее вмешательство с применением тоцилизумаба снижает частоту тяжелого СВК, но не влияет на частоту или тяжесть ICANS19. В настоящее время не существует эффективного лечения или профилактического средства для ИКАНС, и крайне важно исследовать профилактические стратегии20.
Считается, что миелоидные клетки и связанные с ними цитокины/хемокины являются основными драйверами развития CRS и ICANS21. В то время как CRS напрямую связан с экстремальным повышением цитокинов и экспансией Т-клеток, патофизиология ICANS в значительной степени неизвестна22,23. Таким образом, крайне важно создать мышиную модель, которая повторяет эти токсичности после клеточной терапии CART, чтобы изучить механизмы и разработать профилактические стратегии.
В настоящее время существует множество доклинических моделей на животных, используемых для изучения, оптимизации и проверки эффективности клеток CART, а также для мониторинга связанной с ними токсичности. К ним относятся сингенные, ксенотрансплантатные, иммунокомпетентные трансгенные, гуманизированные трансгенные и полученные от пациентов ксенотрансплантаты мышей, а также модели приматов. Тем не менее, каждая из этих моделей имеет недостатки, и некоторые из них не отражают истинную эффективность или безопасность клеток CART24,25. Поэтому крайне важно тщательно выбирать оптимальную модель для предполагаемых целей исследования.
В данной статье предпринята попытка описать методологию, используемую для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, CRS и NI, с использованием модели ксенотрансплантата in vivo, полученного от пациента (PDX) in vivo (рис. 1). В частности, в описанных здесь методах используются клетки CART19, полученные в лаборатории авторов, по ранее описанным протоколам. Вкратце, Т-клетки человека выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови здорового донора (PBMC) с помощью метода градиента плотности, стимулируют шариками CD3/CD28 на 0-й день и лентививически трансдуцируют на 1-й день с помощью CAR, состоящего из одноцепочечного вариабельного фрагмента, нацеленного на CD19, слитого с сигнальными доменами 4-1BB и CD3ζ. Затем эти клетки CART расширяют, очищают от шариков на 6-й день и криоконсервируют на 8-й день 26,27,28,29,30. Как указывалось ранее, мышей подвергают лимфодеплетирующему лечению, за которым следует введение лейкозных бластов (ОЛЛ)28. Во-первых, приживление опухоли проверяется с помощью подчелюстного забора крови. После установления соответствующей опухолевой нагрузки мышам вводят клетки CART19. Затем мышей ежедневно взвешивают, чтобы оценить их самочувствие. Магнитно-резонансная томография (МРТ) мелких животных проводится для оценки NI, а также хвостового кровотечения для оценки роста Т-клеток и продукции цитокинов/хемокинов. Методы, описанные ниже, настоятельно рекомендуется использовать в качестве модели для изучения токсичности, ассоциированной с клетками CART, в модели PDX.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;APC Anti-Human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>Wecol</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze 14.0 software</td>
			<td>AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td>Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>Red blood cells lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fin IV insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance II 7 Tesla&#160;</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MRI machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Busulfan (NSC-750)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERT Control/Gating Module&#160;</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1030</td>
			<td>Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Bright-Line</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Liquid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 Lithium heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>Blood collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HCYTMAG-60K-PX38</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscan</td>
			<td>Ge Healthcare Inc.</td>
			<td>0407-0690-10</td>
			<td>Gadolinium-based constrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pd Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polysterene Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Surgical Blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) стала мощным инструментом для лечения нескольких типов злокачественных опухолей CD19+ , что привело к недавнему одобрению FDA нескольких методов клеточной терапии CD19-таргетной CART (CART19). Тем не менее, клеточная терапия CART связана с уникальным набором токсичных веществ, которые несут в себе свою заболеваемость и смертность. К ним относятся синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейровоспаление (NI). Использование доклинических мышиных моделей имеет решающее значение в исследованиях и разработках технологии CART для оценки как эффективности CART, так и токсичности CART. Доступные доклинические модели для тестирования этой адоптивной клеточной иммунотерапии включают сингенные, ксенотрансплантатные, трансгенные и гуманизированные мышиные модели. Не существует единой модели, которая бы органично отражала иммунную систему человека, и у каждой модели есть сильные и слабые стороны. Целью данной работы по методам является описание модели ксенотрансплантата пациента с использованием лейкозных бластов пациентов с острым лимфобластным лейкозом в качестве стратегии оценки токсичности, ассоциированной с CART19, CRS и NI. Было показано, что эта модель повторяет токсичность, связанную с CART19, а также терапевтическую эффективность, наблюдаемую в клинике.

Целью данного протокола является оценка токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели мышей PDX из опухолевых клеток пациентов с ОЛЛ (рис. 1). Во-первых, мышам NSG вводили внутривенно бусульфан (30 мг/кг) с целью иммуносупрессии и облегчения приживления ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

В данной статье мы опишем протокол, в котором модель ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом используется в качестве стратегии для оценки и мониторинга токсичности, ассоциированной с Т-клетками рецептора химерного антигена CD19.

Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

В этом протоколе используются человеческие CAR-T и опухолевые клетки, что позволяет точно продемонстрировать токсичность, связанную с введением CART19. Поэтому подытоживаем то, что наблюдалось в клинике. Основное преимущество использования этой платформы заключается в том, что она предоставляет переводимую и клинически значимую модель, в которой используются Т-клетки человека и опухолевые клетки.Эта модель не только позволяет эффективно оценивать токсичность, ассоциированную с CART19, но и позволяет нам лучше понять, как мы можем преодолеть эту токсичность с помощью улучшенных стратегий лечения. Для начала наблюдайте за мышами, вводимыми CART19, два раза в день, чтобы оценить любые изменения в их самочувствии, такие как двигательная слабость, сгорбленная фигура и потеря массы тела. Как только у мышей разовьется двигательная слабость и снижение веса, соберите их периферическую кровь для анализа опухолевой нагрузки.И провести выделение сыворотки крови на цитокины, как описано в рукописи. После выделения храните пробирки с сывороточными микроцентрифугами при температуре 80 градусов Цельсия и используйте cera для анализа хемокинов и цитокинов с помощью мультиплексного анализа. Для МРТ-визуализации смешайте 120 микролитров гадолиния с 880 микролитрами физиологического раствора и загрузите в инсулиновый шприц объемом один миллилитр.Ввести по 100 микролитров приготовленного раствора внутрибрюшинно каждой мышке. Обезболивайте мышь и поместите ее на щуп подставки, совместимый с грызунами. Затем зацепите его зубчиками за прикусную планку.Втяните головку мыши в катушку объемом 25 миллиметров и отрегулируйте носовой конус, привязанный к системе анестезии изофлураном. Затяните ручку прикусной планки, чтобы сохранить положение на протяжении всего сканирования. Для оценки дыхания приложите зонд устройства для мониторинга дыхания близко к диафрагме и закрепите его хирургической лентой.Поддерживайте частоту дыхания от 20 до 60 вдохов в минуту, чтобы состояние мышей оставалось стабильным. Вставьте зонд животного в маленькое отверстие в системе МРТ для мелких животных с вертикальным отверстием и отрегулируйте голову животного в центре катушки. С помощью замка закрепите аппарат в вертикальном положении и подключите прибор к компьютеру.Затем откройте программное обеспечение ParaVision, чтобы настроить позиции сканирования и типы сканирования. Определите оптимальные сагиттальные и осевые положения, сохраняя их одинаковыми для всех экспериментальных групп. Для сбора Т1-взвешенных данных МРТ используйте Т1-взвешенную многосрезовую последовательность с несколькими эхо-сигналами с временем повторения 300 миллисекунд, временем эхо-сигнала 9,5 миллисекунды, полем зрения 4,00 X 2,00 X 2,00 см и матрицей 192 X 96 X 96.Для Т2-взвешенных МРТ-изображений используйте многосрезовую последовательность с несколькими эхо-сигналами с аналогичными параметрами. После завершения сканирования извлеките зонд из отверстия и осторожно извлеките мышь, удалив зубы с прикусной планки. После извлечения данных из программного обеспечения используйте аналитическое программное обеспечение для количественной оценки и объемной 3D-визуализации гиперинтенсивных областей CD19+ популяций опухолевых клеток между мышами, получавшими CART19, и мышами, не получавшими лечение с помощью проточной цитометрии.Значительное снижение массы тела наблюдалось у мышей, получавших клетки CART19. Потеря веса рассматривается как симптом появления СВК, который связан с CART-клеточной токсичностью. Мультиплексный анализ выявил экспрессию цитокинов и хемокинов в сыворотке крови мышей NSG до и после введения CART19.Т2-взвешенные изображения выявили признаки отека и возможного воспалительного инфильтрата во время нейровоспаления у мышей, получавших CART19. В то время как Т1-взвешенная МРТ показала контрастное усиление в паренхиме головного мозга, что указывает на увеличение проницаемости сосудов. Трехмерные реконструкции мозга грызунов были собраны на основе областей гиперинтенсивности Т1, соответствующих сосудистой проницаемости, которая визуализирует объем утечки гадолиния в мозге.Важно помнить, что ежедневный физический мониторинг мышей после введения CART19, наряду с периферическим кровотечением, будет лучшим индикатором для проведения МРТ для полной оценки любых изменений в мозге, указывающих на CRS или нейротоксичность. Эта технология широко применима для дополнительной терапии CAR-T-клетками и позволит ученым эффективно тестировать потенциальную токсичность, возникающую от новых CAR-T-клеток. Эта предлагаемая модель является отправной точкой в понимании того, как токсичность, связанная с CAR-T-клетками, может контролироваться, лечиться и использоваться для валидации новых моделей CAR-T-клеток.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Разработка и ведение доклинической пациента Derived Опухоль модели ксенотрансплантата для исследования принципиально новых видов лечения рака

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Меланома пациента-производные Ксенотрансплантат Модель

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...