Name: assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis genom National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) och Predolin Foundation (RSS). Dessutom vill vi tacka Mayo Clinic NMR Core Facility personal. Figur 1 skapades BioRender.com

Detta protokoll följer riktlinjerna från Imsengco Clinics institutionella granskningsnämnd (IRB), institutionella djurvårds- och användningskommitté (IACUC A00001767) och institutionella biosäkerhetskommitté (IBC, Bios00000006.04).
OBS: Alla material som används för att arbeta med möss måste vara sterila.
1. Injektion av busulfan till NSG-möss
<ol><li>Skaffa hanmöss, 8-12 veckor gamla, med nedsatt immunförsvar, NOD-SCID IL2rγnull (...

I denna rapport har en metod för att bedöma CART-cellassocierade toxiciteter med hjälp av en ALL PDX-modell beskrivits. Mer specifikt syftar denna modell till att efterlikna två livshotande toxiciteter, CRS och NI, som patienter ofta upplever efter infusion av CART-celler. Det rekapitulerar många kännetecken för CART-toxiciteter som observerats i kliniken: viktminskning, motorisk dysfunktion, neuroinflammation, inflammatorisk cytokin- och kemokinproduktion och infiltration av olika effektorceller i centrala nervsy...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

Chimeric antigen receptor T (CART) cellterapi har revolutionerat området cancerimmunterapi. Det har visat sig vara framgångsrikt vid behandling av återfall / refraktär akut lymfoblastisk leukemi (ALL), stort B-celllymfom, mantelcellslymfom, follikulärt lymfom och multipelt myelom 1,2,3,4,5,6,7, vilket leder till nyligen FDA-godkännanden. Trots den initiala framgången i kliniska prövningar resulterar behandling med CART-cellterapi i toxiciteter som ofta är allvarliga och ibland dödliga. De vanligaste toxiciteterna efter CART-cellterapi inkluderar utveckling av CRS och NI, även kallat immuneffektorcellassocierat neurotoxicitetssyndrom (ICANS)8,9. CRS orsakas på grund av överaktivering och massiv expansion av CART-celler in vivo, vilket leder till efterföljande utsöndring av flera inflammatoriska cytokiner, inklusive interferon-γ, tumörnekrosfaktor-α, granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) och interleukin-6 (IL-6). Detta resulterar i hypotoni, hög feber, kapillärläckagesyndrom, andningssvikt, multiorgansvikt och i vissa fall död10,11. CRS utvecklas i 50-100% av fallen efter CART19 cellterapi11,12,13. ICANS är en annan unik biverkning associerad med CART-cellterapi och kännetecknas av generaliserat hjärnödem, förvirring, obtundation, afasi, motorisk svaghet och ibland anfall 9,14. Varje grad av ICANS förekommer hos upp till 70% av patienterna, och grad 3-4 rapporteras hos 20-30% av patienterna 5,10,15,16. Sammantaget är CRS och ICANS vanliga och kan vara dödliga.
Hanteringen av ICANS efter CART-cellterapi är utmanande. De flesta patienter med ICANS upplever också CRS17, som ofta kan behandlas med IL-6-receptorantagonisten tocilizumab eller steroider18. En tidigare rapport visade att tidig intervention med tocilizumab minskade frekvensen av svår CRS men påverkade inte incidensen eller svårighetsgraden av ICANS19. För närvarande finns det ingen effektiv behandling eller profylaktiskt medel för ICANS, och det är viktigt att undersöka förebyggande strategier20.
Myeloida celler och associerade cytokiner/kemokiner tros vara de främsta drivkrafterna för utvecklingen av CRS och ICANS21. Medan CRS är direkt relaterad till den extrema höjningen av cytokiner och T-cellexpansion, är patofysiologin för ICANS i stort sett okänd22,23. Därför är det absolut nödvändigt att etablera en musmodell som rekapitulerar dessa toxiciteter efter CART-cellterapi för att studera mekanismerna och utveckla förebyggande strategier.
Det finns flera prekliniska djurmodeller som för närvarande används för att studera, optimera och validera effekten av CART-celler, samt för att övervaka deras associerade toxiciteter. Dessa inkluderar syngena, xenograft, immunkompetenta transgena, humaniserade transgena och patienthärledda xenograftmöss, förutom primatmodeller. Var och en av dessa modeller har dock nackdelar, och vissa återspeglar inte de verkliga effektivitets- eller säkerhetsproblemen för CART-celler24,25. Därför är det absolut nödvändigt att noggrant välja den bästa modellen för de avsedda målen för studien.
Denna artikel syftar till att beskriva den metod som används för att bedöma CART-cellassocierade toxiciteter, CRS och NI, med hjälp av en ALL patient-derived xenograft (PDX) in vivo-modell (figur 1). Specifikt, i de metoder som beskrivs här, används CART19-celler genererade i författarnas laboratorium enligt tidigare beskrivna protokoll. Kortfattat isoleras humana T-celler från friska donatormononukleära celler i perifert blod (PBMC) via en densitetsgradientteknik, stimuleras med CD3 / CD28-pärlor på dag 0 och transduceras lentiviralt på dag 1 med CAR bestående av ett CD19-riktat variabelt fragment med en kedja smält till 4-1BB- och CD3ζ-signaldomäner. Dessa CART-celler expanderas sedan, pärlas bort på dag 6 och fryskonserveras på dag 8 26,27,28,29,30. Som tidigare beskrivits utsätts möss för lymfnedbrytande behandling, följt av administrering av patienthärledda leukemiska blaster (ALL)28. Först verifieras tumörgravering via submandibulär blodinsamling. Efter upprättandet av en lämplig tumörbörda administreras CART19-celler till mössen. Därefter vägs mössen dagligen för att bedöma välbefinnandet. Magnetisk resonanstomografi av små djur (MRT) utförs för att bedöma NI, tillsammans med svansblödning för att bedöma T-cellexpansion och cytokin / kemokinproduktion. De tekniker som beskrivs nedan rekommenderas starkt att användas som modell för att studera CART-cellassocierade toxiciteter i en PDX-modell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;APC Anti-Human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>Wecol</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze 14.0 software</td>
			<td>AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td>Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Lysing Solution&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>349202</td>
			<td>Red blood cells lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fin IV insulin syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Avance II 7 Tesla&#160;</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MRI machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Busulfan (NSC-750)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERT Control/Gating Module&#160;</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>Model 1030</td>
			<td>Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Bright-Line</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (Liquid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette 500 Lithium heparin</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>20.1345.100</td>
			<td>Blood collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>HCYTMAG-60K-PX38</td>
			<td>Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscan</td>
			<td>Ge Healthcare Inc.</td>
			<td>0407-0690-10</td>
			<td>Gadolinium-based constrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pd Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polysterene Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Surgical Blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of chimeric antigen receptor t cell-associated toxicities using an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft mouse model

Chimär antigenreceptor T (CART) cellterapi har framstått som ett kraftfullt verktyg för behandling av flera typer av CD19 + maligniteter, vilket har lett till det senaste FDA-godkännandet av flera CD19-riktade CART (CART19) cellterapier. CART-cellterapi är emellertid förknippad med en unik uppsättning toxiciteter som bär sin egen sjuklighet och dödlighet. Detta inkluderar cytokinfrisättningssyndrom (CRS) och neuroinflammation (NI). Användningen av prekliniska musmodeller har varit avgörande i forskningen och utvecklingen av CART-teknik för att bedöma både CART-effekt och CART-toxicitet. De tillgängliga prekliniska modellerna för att testa denna adoptiva cellulära immunterapi inkluderar syngena, xenograft, transgena och humaniserade musmodeller. Det finns ingen enskild modell som sömlöst speglar det mänskliga immunsystemet, och varje modell har styrkor och svagheter. Detta metodpapper syftar till att beskriva en patienthärledd xenograftmodell med hjälp av leukemiska blaster från patienter med akut lymfoblastisk leukemi som en strategi för att bedöma CART19-associerade toxiciteter, CRS och NI. Denna modell har visat sig rekapitulera CART19-associerade toxiciteter såväl som terapeutisk effekt som ses i kliniken.

Syftet med detta protokoll är att bedöma CART-cellassocierade toxiciteter med hjälp av en PDX-musmodell från tumörceller hos patienter med ALL (figur 1). Först fick NSG-möss intravenösa injektioner av busulfan (30 mg/kg) med målet att immunsupprimera dem och underlätta CART-cellgravering28. Följande dag fick de ~ 5 × 106 PBMC (i.v.) härrörande från ALLA patienter. Mössen övervakades för engraftment i ~ 13 veckor via svansblödning...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model at JoVE.com

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Här beskriver vi ett protokoll där en patientbaserad xenograftmodell för akut lymfatisk leukemi används som en strategi för att bedöma och övervaka CD19-riktade chimära antigenreceptor T-cellassocierade toxiciteter.

Bedömning av chimär antigenreceptor T-cellassocierad toxicitet med hjälp av en akut lymfoblastisk leukemi patient-härledd xenograftmusmodell

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Detta protokoll använder humana CAR-T- och tumörceller och visar exakt toxiciteten i samband med CART19-administrering. Därför rekapitulerar vad som har observerats i kliniken. Den största fördelen med att använda denna plattform är att den ger en översättningsbar och kliniskt relevant modell där humana T-celler och tumörceller används.Denna modell möjliggör inte bara effektiv bedömning av CART19-associerade toxiciteter, utan gör det också möjligt för oss att bättre förstå hur vi kan övervinna dessa toxiciteter genom förbättrade behandlingsstrategier. Börja med att övervaka de CART19-administrerade mössen två gånger om dagen för att bedöma eventuella förändringar i deras välbefinnande, såsom motorisk svaghet, böjd kropp och förlust av kroppsvikt. När mössen utvecklar motorisk svaghet och viktminskning, samla deras perifera blod för att analysera tumörbördan.Och utför serumisolering för cytokiner, som beskrivs i manuskriptet. Efter isolering, förvara serummikrocentrifugrören vid 80 grader Celsius och använd cera för att analysera kemokiner och cytokiner med hjälp av multiplexanalysen. För MR-avbildning, blanda 120 mikroliter gadolinium med 880 mikroliter saltlösning och ladda i en milliliter insulinspruta.Injicera 100 mikroliter av den beredda lösningen intraperitonealt i varje mus. Bedöva musen och placera den på den gnagarkompatibla vagganssonden. Haka sedan tänderna på bettstången.Dra in musens huvud i 25-millimetersspolen och justera noskon som är bunden till isoflurananestesisystemet. Dra åt ratten på bettstången för att bibehålla positionen under hela skanningen. För andningsbedömning, fäst sonden på en andningsövervakningsanordning nära membranet och säkra den med kirurgisk tejp.Håll andningsfrekvensen mellan 20 och 60 andetag per minut så att musens tillstånd förblir stabilt. Sätt in djursonden i det lilla hålet i MR-systemet Vertical Bore Small Animal och justera djurets huvud i mitten av spolen. Använd låset, säkra apparaten i upprätt läge och anslut instrumentet till datorn.Öppna sedan ParaVision-programvaran för att ställa in skanningspositioner och typer av skanningar. Bestäm de optimala sagittala och axiella positionerna samtidigt som de är konsekventa för alla experimentgrupper. För att samla in T1-viktade MR-data, använd T1-viktad multi-slice, multi-echo-sekvens med en repetitionstid på 300 millisekunder, en ekotid på 9,5 millisekunder, ett synfält på 4,00 X 2,00 X 2,00 centimeter och en matris på 192 X 96 X 96.För T2-viktade MR-bilder använder du en sekvens med flera segment och flera eko med liknande parametrar. När skanningarna är klara, ta bort sonden från hålet och dra försiktigt ut musen genom att ta bort tänderna från bettstången. Efter att ha extraherat data från programvaran, använd analysprogramvara för kvantifiering och 3D-volymåtergivning av hyperintensitetsregionerna CD19 + tumörcellpopulationer jämfördes mellan möss behandlade med CART19 och obehandlade möss med flödescytometri.Signifikant viktminskning observerades hos möss behandlade med CART19-celler. Viktminskning betraktas som ett symptom på CRS-utseende, vilket är relaterat till CART-cellassocierade toxiciteter. En multiplexanalys avslöjade uttrycket av cytokiner och kemokiner i NSG-mössserum före och efter administrering av CART19.T2-viktade bilder avslöjade tecken på ödem och eventuellt inflammatoriskt infiltrat under neuroinflammation hos CART19-behandlade möss. Medan den T1-viktade MR visade kontrastförbättring inom hjärnparenkymen, vilket indikerar ökad vaskulär permeabilitet. Tredimensionella rekonstruktioner av gnagarhjärnan samlades baserat på T1-hyperintensitetsregioner motsvarande vaskulär permeabilitet, vilket gör volymen av gadoliniumläckage i hjärnan.Det är viktigt att komma ihåg att den dagliga fysiska övervakningen av mössen efter CART19-administrering, tillsammans med perifer blödning, kommer att vara den bästa indikatorn för att fortsätta med MR för att fullständigt bedöma eventuella förändringar i hjärnan som indikerar CRS eller neurotoxicitet. Denna teknik är allmänt tillämplig på ytterligare CAR-T-cellterapier och kommer att göra det möjligt för forskare att effektivt testa potentiella toxiciteter som härrör från nya CAR-T-celler. Denna föreslagna modell är en språngbräda för att förstå hur CAR-T-cellassocierade toxiciteter kan övervakas, behandlas och användas för att validera nya CAR-T-cellmodeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utveckling och underhåll av en preklinisk patient Derived Tumör xenograft modell för undersökning av nya anti-cancerterapier

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Beredning av primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser av Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

En melanom patient-derived xenograft modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...