Name: detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry
Uploaded: 2023-05-05T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

تم تمويل هذه المقالة من قبل مشروع POCI-01-0145-FEDER-029947 "تقييم مخاطر مرض الهزال المزمن في البرتغال" بدعم من FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. أيضا ، تلقى مؤلفو وحدة الأبحاث CECAV تمويلا من FCT ، في إطار مشروع UIDB / CVT / 0772/2020 ، ونشكر بروس سي كامبل ، مدير الأبحاث (متقاعد) ، مركز البحوث الإقليمي الغربي ، وزارة الزراعة الأمريكية ، على مساعدته.

إن إجراء المدينة العالمية للخدمات الإنسانية الموصوف هنا هو أحد مكونات المشروع البحثي FAIRJ-CT98-7021 ، "إنشاء شبكة أوروبية لمراقبة TSE المجترات وتوحيد وتنسيق عملية ومعايير تحديد الحالات المشتبه فيها". وهو يتبع معايير التشخيص التي حددتها المنظمة العالمية لصحة الحيوان ، WOAH (المسمى سابقا المكتب الد...

<ol>
	<li>. WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022) Available from: <a target="_blank" href="https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/">https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/</a> (2022)</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M., Oliver, C., Jamur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-Induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.+Immunocytochemical+Methods+and+Protocols.">Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 103-119 (2010).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry).">Applications of immunohistochemistry).</a> Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology+of+Animal+Prion+Diseases.">Neuropathology of Animal Prion Diseases.</a> Biomolecules. 11 (3), 466 (2021).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf">https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf</a> (2022)</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+tissue+processing,+histology+and+immunohistochemistry+procedures+for+diagnosis+of+animal+TSE+(BSE,+scrapie,+atypical+scrapie,+CWD).+Histo+&amp;+IHC+protocols+for+TSE+diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.">Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo &amp; IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2022).</li><li>Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>Machado, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSE+Monitoring+in+Wildlife+Epidemiology,+Transmission,+Diagnosis,+Genetics+and+Control.">TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control.</a> Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology:+Confirmatory+diagnosis+of+transmissible+spongiform+encephalopathies+(TSEs)+in+cattle+and+small+ruminants.+Confirmatory+(Histo+&amp;+IHC)+diagnostic+criteria+Rev_Jan2019.pdf.">Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo &amp; IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2019).</li><li>Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+PrP+in+the+medulla+oblongata+of+sheep:+The+spectrum+of+staining+in+normal+and+scrapie-affected+sheep.">Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep.</a> The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).</li><li>Simmons, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+classical+bovine+spongiform+encephalopathy:+definition+and+progression+of+neural+PrP+immunolabeling+in+relation+to+diagnosis+and+disease+controls.">Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls.</a> Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H-type+BSE+in+Portugal.">Identification of H-type BSE in Portugal.</a> Prion. 9 (1), 22-28 (2015).</li><li>Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+lesion+profile+of+BSE+in+Portuguese+cattle+to+that+described+in+British+cattle.">Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle.</a> Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).</li><li>Pires, M. A., Travassos, F. S., G&#228;rtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+veterinary+pathology.">Atlas of veterinary pathology.</a> Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).</li><li>Pires, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+protocols,+didactic+series.">Immunology protocols, didactic series.</a> Applied Sciences. , 357 (2010).</li></ol>

TSEs هي أمراض حيوانية المنشأ محتملة. بعد ظهور مرض جنون البقر في عام 1986 في المملكة المتحدة ، أصبحت البرتغال واحدة من الدول الأعضاء في الاتحاد الأوروبي مع ارتفاع معدل الإصابة بهذا المرض14,15. من أجل السيطرة على هذا المرض ، تم تطوير آليات المراقبة الأخرى التي ظهرت (...

وفقا لفرضية البريون ، فإن الشكل المتماثل غير الطبيعي (PrPSc) هو المكون الأساسي أو الوحيد للعامل المعدي في اعتلالات الدماغ الإسفنجية القابلة للانتقال (TSEs). يعتمد تأكيد تشخيص TSE على الكشف المناعي عن PrPSc عن طريق تطبيق بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) و / أو طرق اللطخة المناعية الغربية (WB) لأنسجة الدماغ1.
IHC هي طريقة تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو ، في بعض الحالات ، الأجسام المضادة متعددة النسيلة (كأجسام مضادة أولية) كخطوة أولى في التلوين المناعي للمستضدات المستهدفة على وجه التحديد ذات الأهمية الموجودة في خلايا قسم الأنسجة. ثم يتم تصور أي ارتباط فعال بين الأجسام المضادة ومولد الضد الأولي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية. يتم اقتران هذه الأجسام المضادة الثانوية بالإنزيمات ، مثل بيروكسيديز الفجل (HRP) أو الفوسفاتيز القلوي (AP). ثم يتم تحقيق التصور عن طريق إضافة ركيزة إلى هذه الإنزيمات ، مما ينتج عنه منتجات ملونة غير قابلة للذوبان موضعية في المناطق التي ترتبط فيها الأجسام المضادة الأولية بالمستضدات المستهدفة. يمكن تحقيق التصور المحسن عن طريق التلوين المضاد ، حيث يتم استخدام صبغة لخلق تباين بين الأنسجة المناعية وغير المناعية2.
مع استخدام IHC للأنسجة المدمجة في البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) ، يمكن أن يؤدي تثبيت الفورمالين إلى إبطال فعالية الأجسام المضادة الأولية بسبب الارتباط المتقاطع بواسطة الفورمالديهايد والتسخين والجفاف أثناء تضمين البارافين. هذه تغير شكل البروتينات ، وتدمير ، أو تغيير طبيعة ، أو إخفاء الحواتم ، وبالتالي تقليل أو إلغاء اكتشافها3. على هذا النحو ، يتطلب هذا استرجاع المستضد (AR). تعمل تقنيات AR على تعطيل الربط المتقاطع للمجموعة الكيميائية المرتبطة بالفورمالديهايد في جزيئات المستضد ، وبالتالي استعادة أو كشف التشكل الأصلي لبروتين المستضد. ينتج عن هذا استعادة تقارب الأجسام المضادة للمستضد (epitope) لوضع العلامات المناعية. تعتمد الفعالية النهائية للواقع المعزز على صفات المستضد المستهدف و / أو الجسم المضاد الأساسي2.
استرجاع المستضد المستحث بالحرارة (HIER) هو أحد إجراءات AR3 ويستخدم بشكل روتيني للكشف عن PrPSc IHC ، كما هو موضح هنا. IHC ضروري للتشخيص ويستخدم في مختبرات الأبحاث لتحديد توزيع الأنسجة للمستضد المرتبط بالأمراض. يستخدم على نطاق واسع في تشخيص وبحث السرطان وعلم الأعصاب والأمراض المعدية4 ، من بين أمور أخرى. بالنسبة ل TSEs ، تلعب IHC دورا مهما في التشخيص والبحث لتأكيد والتحقيق في توزيع PrPSc في المضيفات الطبيعية والنماذج التجريبية. يساهم IHC في دراسات التسبب في البريون وتحليل أنواع وأنماط ترسب PrPSc ، وتحديدا في الأنسجة العصبية5 ، للكشف عن الانحرافات عن العدوى الموصوفة بشكل روتيني وتحديد سلالات البريون الجديدة المفترضة.
نظرا لأن بريونات الاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري (BSE) يمكن أن تصيب البشر ، فقد تتطلب بعض البروتوكولات المختبرية المشاركة في العمل مع مرض جنون البقر استخدام مرافق وممارسات BSL-36. ويشمل ذلك استخدام حاوية ثانوية محكمة الغلق لنقل عينات الأنسجة المصابة بمرض جنون البقر المحتملة داخل المعهد والمختبر. ويشمل أيضا تخصيص مناطق احتواء ومعدات مخصصة للبريون لأبحاث وتحليل مرض جنون البقر كلما أمكن ذلك. يتم ذلك لمنع التلوث خارج منطقة العمل وتوفير مساحة ضيقة حيث تصبح إجراءات إزالة التلوث ضرورية.
وبناء على ذلك، يتبع مختبر علم الأمراض التابع للمعهد الدولي لبحوث الأحياء مرافق وممارسات السلامة الأحيائية-3 (BSL-3) الموصى بها6 لإدارة عينات الأنسجة المحتملة المصابة بالبريون من الماشية والمجترات الصغيرة وعنق الرحم المرتبطة بمراقبة مرض التهاب الدماغ المؤقت.
يمكن أن تكون الأنسجة المثبتة بالفورمالين والأنسجة المضمنة في البارافين المدرجة في إجراءات التشخيص أو البحث في TSE ، خاصة في الجهاز العصبي المركزي ، معدية. وبالتالي ، يجب معالجة هذه الأنسجة الثابتة بحمض الفورميك لتقليل عدوى البريونات ، إن وجدت ، قبل معالجة الأنسجة. يتم تنفيذ ذلك عن طريق وضع أنسجة ثابتة ومشذبة (سمك 2-4 مم تقريبا) في شريط معالجة. ثم يتم غمر الكاسيت في 98٪ حمض الفورميك (لمدة 1 ساعة). بعد الغمر ، يتم غسل الكاسيتات بالأنسجة في ماء الصنبور الجاري لمدة 30 دقيقة ، وإعادتها إلى المثبت قبل المعالجة الإضافية. إذا لم تتم معالجة أقسام الأنسجة قبل المعالجة ، فيجب غمر أقسام الأنسجة بعد المجهرية في حمض الفورميك غير المخفف لمدة 5 دقائق على الأقل قبل تلطيخ الأنسجة7. يتضمن بروتوكول IHC ل PrPSc خطوة روتينية لإزالة حامض الفورميك ، تعمل أيضا على تعطيل البريونات7. بعد خطوات تعطيل البريون هذه ، يمكن بعد ذلك معالجة الأنسجة الثابتة الناتجة في BSL-2 باستخدام ممارسات BSL-2 القياسية.
الحد الأدنى من متطلبات أخذ عينات الأنسجة لتشخيص TSE في أي مدرج في مراقبة TSE هو جمع جذع الدماغ (على مستوى obex). بالإضافة إلى ذلك ، للكشف عن مرض جنون البقر غير النمطي والسكرابي ، ينصح أيضا بجمع جزء من المخيخ 1,8. لتشخيص CWD ، يجب اختبار كل من جذع الدماغ (obex) والغدد الليمفاوية البلعومية حيث يمكن اكتشاف PrP Sc في الأنسجة اللمفاوية مع عدم وجود PrPSc يمكن اكتشافه في obex9 ، الذي استعرضه Machado et al.10.
يتضمن الجزء obex من جذع الدماغ مواقع مستهدفة TSE تشخيصية ، وهي النواة المبهمية الظهرية (DVN) ونواة القناة الانفرادية (STN) ونواة المسالك الشوكية للعصب الثلاثي التوائم (V). تقدم هذه المناطق باستمرار تراكم PrPSc الثنائي ، حتى في المراحل المبكرة من مرض جنون البقر والسكرابي الكلاسيكي. في الحالات السريرية ل TSE المتقدم ، تظهر جميع مناطق المادة الرمادية داخل جذع الدماغ توزيع PrPSc على نطاق واسع11.
قبل التقسيم والمعالجة ، يتم تقييم عينات الدماغ (الشكل 1) للتأكد من مستوى التحلل الذاتي ووجود أي تلف في الأنسجة يحتمل أن يضر بملاءمة العينة للتشخيص التتأكيدي القائم على IHC8. للتحقق من سلامة البروتوكولات التحضيرية والنتائج التحليلية ، يتم تضمين عينات الأنسجة الإيجابية والسلبية TSE كضوابط بالتزامن مع تحضير الأنسجة من حالات الاختبار في كل فحص.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64560/64560fig01.jpg"> الشكل 1: إجراء PrPSc IHC. تمثيل يوضح التسلسل التدريجي لإجراء PrPSc IHC من إزالة البارافين من أقسام الأنسجة إلى التلوين المناعي والكشف في نهاية المطاف (FFPE - البارافين الثابت بالفورمالين ؛ ماب - الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. DAB - 3،3 'ديامينوبنزيدين ). تم إنشاء هذا الرقم في عام BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64560/64560fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td>Undituled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin-biotin complex and peroxidase 
			Vectastain Elite ABC kit Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2000-1.5</td>
			<td>Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Prepare before use according to kit instructions. 
			Use 400 &#181;L of solution per section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation Pascal pressure chamber</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ehrlich&#8217;s Hematoxylin:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>115938</td>
			<td>Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium alum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01047.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04091.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. 
			Prepare before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (30% w/w)</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00264.1000</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Entellan</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107960</td>
			<td>Ready- to- use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (20% ) block solution in TBS: 
			Horse normal serum</td>
			<td> 
			Gibco</td>
			<td> 
			16050-122&#160;</td>
			<td>Prepare final volume according to the number of sections in the assay 
			(200 &#181;L of solution per section).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>MCA2460</td>
			<td>PrP 146-R154R171182 
			Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. 
			According to the number of sections in the assay (200 &#181;L of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) 
			Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 &#956;L into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10&#160;</td>
			<td>Cayman&#160; Chemical Company&#160;</td>
			<td>189710</td>
			<td>PrP142-160 
			Bovine, not suitable for ovine 
			Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon CoverplateTM chamber</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>72110017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining center&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73300001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining slide rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate&#160; and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. 
			Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) 
			Prepare on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich&#160;</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar and basket</td>
			<td>Deltalab&#160;</td>
			<td>19360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): 
			TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5&#177; 3 &#176;C until 2 months) 
			Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA BASE</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Panreac Applied Chem ITW reagents</td>
			<td>251769</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry

بروتينات البريون غير الطبيعية (PrPSc) هي الشكل المتماثل المرتبط بالمرض لبروتين البريون الخلوي والعلامات التشخيصية لاعتلال الدماغ الإسفنجي القابل للانتقال (TSEs). تؤثر هذه الأمراض التنكسية العصبية على البشر والعديد من الأنواع الحيوانية وتشمل السكراب ، والاعتلال الدماغي الإسفنجي البقري الحيواني المنشأ (BSE) ، ومرض الهزال المزمن لعنق الرحم (CWD) ، ومرض بريون الإبل (CPD) الذي تم تحديده حديثا. يعتمد تشخيص TSEs على الكشف المناعي عن PrPSc عن طريق تطبيق كل من الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) وطرق اللطخة المناعية الغربية (WB) على أنسجة الدماغ ، أي جذع الدماغ (مستوى obex). IHC هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع تستخدم الأجسام المضادة الأولية (وحيدة النسيلة أو متعددة النسيلة) ضد المستضدات ذات الأهمية في خلايا قسم الأنسجة. يمكن تصور ارتباط الجسم المضاد ومولد الضد من خلال تفاعل اللون الذي يظل موضعيا في منطقة النسيج أو الخلية حيث تم استهداف الجسم المضاد. على هذا النحو ، في أمراض البريون ، كما هو الحال في مجالات البحث الأخرى ، لا تستخدم تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية فقط لأغراض التشخيص ولكن أيضا في دراسات الإمراض. تتضمن هذه الدراسات الكشف عن أنماط وأنواع PrPSc من تلك الموصوفة سابقا لتحديد سلالات البريون الجديدة. نظرا لأن مرض جنون البقر يمكن أن يصيب البشر ، يوصى باستخدام مرافق و / أو ممارسات مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 3 (BSL-3) للتعامل مع الماشية والمجترات الصغيرة وعينات عنق الرحم المدرجة في مراقبة TSE. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام معدات الاحتواء والمعدات المخصصة للبريون ، كلما أمكن ذلك ، للحد من التلوث. يتكون إجراء PrPSc IHC من خطوة إزالة حامض الفورميك التي تعمل أيضا كإجراء لتعطيل البريون ، حيث تظل الأنسجة المثبتة بالفورمالين والأنسجة المضمنة بالبارافين المستخدمة في هذه التقنية معدية. عند تفسير النتائج ، يجب توخي الحذر للتمييز بين العلامات المناعية غير المحددة ووضع العلامات المستهدفة. لهذا الغرض ، من المهم التعرف على القطع الأثرية الخاصة بوضع العلامات المناعية التي تم الحصول عليها في التحكم السلبية المعروفة في TSE للتمييز بين تلك الأنواع المحددة من الملصقات المناعية PrPSc ، والتي يمكن أن تختلف بين سلالات TSE والأنواع المضيفة والنمط الجيني prnp ، الموصوف بمزيد من التفصيل هنا.

بالنظر إلى أن وضع العلامات المناعية المستهدفة غير المحددة ممكن ، فمن المهم التأكد من مستوى وضع العلامات المناعية غير المحددة في التحكم السلبية المعروفة في TSE. هذه خطوة مهمة لتفسير العلامات المناعية المحددة ل PrPSc 7 بشكل صحيح (الشكل 2). لوحظ أن العلامات...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

يتطلب وضع العلامات المناعية لبروتين البريون غير الطبيعي باستخدام بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية عينة محددة ومنهجيات تحضير الأجسام المضادة المضادة ل PrP. يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية في إزالة الخاتمة لضمان وضع العلامات المناعية المناسبة ل PrP وتقليل تلطيخ الخلفية غير المحدد. أيضا ، يأخذ هذا النهج في الاعتبار تدابير السلامة الحيوية عند إجراء دراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع الأنسجة المصابة بالبريون.

الكشف عن بروتين البريون غير الطبيعي بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

تسمح هذه التقنية بالتشخيص التأكيدي لأمراض البريون بواسطة تقنية PrP scrapie في الأنسجة ، وتحليل أنواع PrP scrapie وتوزيعها لتقييم الانحراف العقابي إلى ملف ترسيب PrP المعروف للسكرابي. هذه التقنية موحدة وتستخدم أجساما مضادة محددة ل PrP scrapie ، مما يتيح تصور ترسب PrP scrapie في الأنسجة. تعطي هذه التقنية أيضا معلومات حول المنطقة التشريحية العصبية ونوع الخلايا.ابدأ بوضع الشرائح مع أقسام الأنسجة في سلة تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ. ضع السلة في حمام الزلين. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة السلة وغمرها مرة أخرى.لإزالة الزيلين وإعادة ترطيب الأقسام ، اغمر السلة في حمام إيثانول مطلق. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة السلة وغمرها مرة أخرى. جفف الأجزاء في الهواء قبل وضعها في حمام إيثانول بنسبة 90٪ لمدة دقيقة واحدة.بعد ذلك ، انقل القسم إلى حمام إيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقة أخرى. لكل علاج حمام إيثانول ، حرك سلة الشرائح برفق مرتين وصفي السلة قبل النقل التالي. انقل السلة إلى حمام إيثانول بنسبة 50٪ لمدة دقيقة واحدة.اغمر أقسام الأنسجة بعناية في 98٪ حمض الفورميك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. شطف الأجزاء في ماء الصنبور لمدة خمس دقائق تليها الشطف مرتين في الماء المقطر. استخدم حاوية تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ في حجرة الضغط المملوءة ب 500 ملليلتر من الماء المقطر لمعالجة محلول سترات 10 ملليمولار عند 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.لأغراض مراقبة الجودة ، ضع قسما من شريط مؤشر الأوتوكلاف اللاصق على السلة لمراقبة درجة الحرارة والضغط. بمجرد أن يشير الإنذار إلى أن الجهاز قد وصل إلى وقت البرنامج ودرجة الحرارة ، اغمر السلة بالشرائح. بعد ذلك ، ابدأ البرنامج على غرفة الضغط لتعيين النقطة 2 وتسجيل الضغط الأولي والنهائي لهذا البرنامج.لتعطيل البيروكسيديز الداخلي ، اغمر سلة الشرائح التي تحتوي على أقسام العينة في حمام من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ في الميثانول لمدة 30 دقيقة. قم بسد الأقسام تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق بعد التصريف ، اغمر الأقسام في محلول ملحي مخزن في Tris لمدة خمس دقائق إضافية. للكشف المناعي ، ضع كل شريحة على حامل لوحة غطاء متاح تجاريا مبلل مسبقا بمحلول ملحي مخزن من Tris مع جانب الأنسجة المواجه للحامل وحواف الشريحة التي تتزامن مع النقطتين السفليتين للحامل.تأكد من تجنب فقاعات الهواء. أمسك مجموعة حامل الشريحة بين الإبهام والسبابة. احتفظ بإصبع واحد أعلى شريحة العينة والآخر في الجزء السفلي من الحامل ، ثم ضع التجميع في معرض النظام.للتأكد من تجميع المجموعة جيدا ، املأ البئر بين شريحة العينة والحامل بمحلول ملحي مخزن من Tris دون أن يفيض عليه. من هذه النقطة ، تأكد من أنه يجب الاحتفاظ بحوالي 80 ميكرولترا من محلول ملحي مخزن Tris بين الحامل والشريحة. لا تدع الأقسام تجف.قلل من تلطيخ الخلفية قبل العلاج بالجسم المضاد الأساسي عن طريق احتضان عينات الشريحة مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام مصل طبيعي بنسبة 20٪ من نفس النوع مثل مضيف الجسم المضاد الثانوي في محلول ملحي مخزن من Tris. بدون غسل الأقسام ، ضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي مباشرة في كل بئر من مجموعة حامل الشريحة واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لغسل الأقسام ، املأ الآبار بمحلول ملحي مخزن من Tris ، وانتظر لمدة خمس دقائق.كرر الغسيل مرتين. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل بتركيز 1 إلى 200 في محلول ملحي مخزن من Tris مع مصل حصان 10٪. إصلاح الحجم المطلوب اعتمادا على عدد الأقسام المراد معالجتها.ضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل بئر من مجموعة حامل الشريحة. بعد 30 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، كرر غسول المحلول الملحي المخزن من Tris. للحضانة باستخدام بيروكسيديز مركب avidin-biotin ، قم بإعداد الكاشف قبل 30 دقيقة من الاستخدام وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من المحلول في كل بئر من حامل لوحة الانزلاق.بمجرد الانتهاء من ذلك ، احتضن حامل اللوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تحديد مستوى وضع العلامات المناعية غير المحددة في الحيوانات ذات الاعتلال الدماغي الإسفنجي القابل للانتقال المعروف - السيطرة السلبية لتفسير العلامات المناعية لبروتينات البريون غير الطبيعية المحددة بشكل صحيح. لوحظ أن العلامات غير المستهدفة بواسطة الأجسام المضادة ل PrP تحدث على شكل تلطيخ منفصل داخل الخلايا العصبية الدقيقة ، وخيوط خطية دقيقة غير منتظمة من البقع في neuropil ، ووضع العلامات غير الجسيمية المنتشرة في بعض مناطق المادة الرمادية والبيضاء ، ووضع العلامات السيتوبلازمية المنتشرة للخلايا العصبية.يلخص الجدول وصف أنواع بروتين البريون غير الطبيعي المسمى بالمناعة الذي لوحظ في اعتلال الدماغ الإسفنجي البقري ، والسكرابي الكلاسيكي وغير النمطي ، ومرض الهزال المزمن لعنق الرحم من أجل التشخيص الإيجابي والمعايير المحددة للنتائج السلبية وغير الحاسمة وغير المناسبة. جميع الخطوات مهمة جدا. يعد الرقم الهيدروجيني للمحاليل ودرجة حرارة الغرفة من الميزات المهمة لنجاح هذه التقنية.يمكن أن يؤدي تطوير الكيمياء الهيستولوجية المناعية للكشف عن كل من سكرابي PrP ونوع الخلايا إلى إعطاء معلومات حول كل خلية تشارك في التسبب في المرض الرئيسي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

الكشف عن بروتين Palmitoylation في الخلايا العصبية قرن آمون بواسطة مثقف مناعي والبورصات الأسيل، البيوتين (آبي)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

رصد خلية إلى انتقال بروتين بريون مثل المجاميع في Melanogaster المورفولوجية

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

التحديد الكمي مورفولوجية Microglia من Photomicrographs Immunohistochemistry استعداد النسيج باستخدام إيماجيج

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...