Name: detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry
Uploaded: 2023-05-05T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Denne artikel blev finansieret af projektet POCI-01-0145-FEDER-029947 "Chronic wasting disease risk assessment in Portugal" støttet af FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Også forfatterne af forskningsenheden CECAV modtog finansiering fra FCT under projektet UIDB / CVT / 0772/2020.Vi takker Bruce C. Campbell, forskningsdirektør (pensioneret), Western Regional Research Center, USDA, for hans hjælp.

IHC-proceduren, der er beskrevet heri, er en del af forskningsprojektet FAIRJ-CT98-7021, "Etablering af et europæisk netværk til overvågning af TSE hos drøvtyggere og standardisering og harmonisering af processen og kriterierne for identifikation af mistænkte tilfælde". Det følger de diagnosekriterier, der er fastlagt af Verdensorganisationen for Dyresundhed, WOAH (tidligere benævnt Det Internationale Kontor for Epizootier, OIE)1 og Det Europæiske Referencelaboratorium for TSE hos Dyr<sup...

<ol>
	<li>. WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022) Available from: <a target="_blank" href="https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/">https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/</a> (2022)</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M., Oliver, C., Jamur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-Induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.+Immunocytochemical+Methods+and+Protocols.">Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 103-119 (2010).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry).">Applications of immunohistochemistry).</a> Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology+of+Animal+Prion+Diseases.">Neuropathology of Animal Prion Diseases.</a> Biomolecules. 11 (3), 466 (2021).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf">https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf</a> (2022)</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+tissue+processing,+histology+and+immunohistochemistry+procedures+for+diagnosis+of+animal+TSE+(BSE,+scrapie,+atypical+scrapie,+CWD).+Histo+&amp;+IHC+protocols+for+TSE+diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.">Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo &amp; IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2022).</li><li>Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>Machado, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSE+Monitoring+in+Wildlife+Epidemiology,+Transmission,+Diagnosis,+Genetics+and+Control.">TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control.</a> Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology:+Confirmatory+diagnosis+of+transmissible+spongiform+encephalopathies+(TSEs)+in+cattle+and+small+ruminants.+Confirmatory+(Histo+&amp;+IHC)+diagnostic+criteria+Rev_Jan2019.pdf.">Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo &amp; IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2019).</li><li>Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+PrP+in+the+medulla+oblongata+of+sheep:+The+spectrum+of+staining+in+normal+and+scrapie-affected+sheep.">Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep.</a> The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).</li><li>Simmons, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+classical+bovine+spongiform+encephalopathy:+definition+and+progression+of+neural+PrP+immunolabeling+in+relation+to+diagnosis+and+disease+controls.">Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls.</a> Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H-type+BSE+in+Portugal.">Identification of H-type BSE in Portugal.</a> Prion. 9 (1), 22-28 (2015).</li><li>Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+lesion+profile+of+BSE+in+Portuguese+cattle+to+that+described+in+British+cattle.">Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle.</a> Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).</li><li>Pires, M. A., Travassos, F. S., G&#228;rtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+veterinary+pathology.">Atlas of veterinary pathology.</a> Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).</li><li>Pires, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+protocols,+didactic+series.">Immunology protocols, didactic series.</a> Applied Sciences. , 357 (2010).</li></ol>

TSE er potentielle zoonotiske sygdomme. Efter fremkomsten af BSE i 1986 i Det Forenede Kongerige blev Portugal en af de EU-medlemsstater, der havde en højere forekomst af denne sygdom14,15. For at bekæmpe denne sygdom er der udviklet andre TSE'er (klassisk og atypisk scrapie, BSE-varianter og i øjeblikket overvågning af chronic wasting disease hos hjortedyr), overvågningsmekanismer af Generaldirektoratet for Fødevarer og Veterinær (DGAV) og National Instit...

Ifølge prionhypotesen er den abnorme isoform (PrPSc) den primære eller eneste komponent i det infektiøse agens i transmissible spongiforme encephalopatier (TSE'er). Bekræftelse til diagnosticering af TSE afhænger af immunpåvisning af PrPSc ved anvendelse af immunhistokemiske (IHC) protokoller og/eller vestlige immunblotmetoder (WB) af encefalonvæv1.
IHC er en metode, der anvender monoklonale eller i nogle tilfælde polyklonale antistoffer (som primære antistoffer) som et første trin i immunfarvning af specifikt målrettede antigener af interesse placeret i celler i en vævssektion. Enhver effektiv primær antistof-antigenbinding visualiseres derefter ved hjælp af sekundære antistoffer, der er specifikke for de primære antistoffer. Disse sekundære antistoffer konjugeres til enzymer, såsom peberrodsperoxidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP). Visualisering opnås derefter ved at tilføje et substrat til disse enzymer, der producerer uopløselige farveprodukter lokaliseret i områder, hvor de primære antistoffer er bundet til de målrettede antigener. Forbedret visualisering kan opnås ved modfarvning, hvor et farvestof bruges til at skabe en kontrast mellem immunmærket og ikke-immunmærket væv2.
Ved IHC ved anvendelse af formalinfikseret paraffinindlejret væv (FFPE) kan formalinfiksering ophæve effektiviteten af primære antistoffer på grund af tværbinding med formaldehyd og opvarmning og dehydrering under paraffinindlejring. Disse ændrer konformationen af proteiner, ødelægger, denaturerer eller maskerer epitoperne og mindsker eller ophæver dermed deres påvisning3. Som sådan kræver dette antigenhentning (AR). AR-teknikkerne forstyrrer formaldehydrelateret kemisk gruppetværbinding i de antigene molekyler og genopretter eller afslører således den oprindelige antigen-proteinkonformation. Dette resulterer i at genvinde antistof-antigen (epitop) affinitet til immunmærkning. Den endelige effekt af AR afhænger af kvaliteten af det målrettede antigen og / eller det primære antistof2.
Varmeinduceret antigen (epitop) hentning (HIER) er en procedure i AR3 og anvendes rutinemæssigt til PrPSc IHC-detektion, som beskrevet heri. IHC er afgørende for diagnose og anvendes i forskningslaboratorier til at bestemme vævsfordelingen af et patologiassocieret antigen. Det bruges i vid udstrækning til diagnosticering og forskning i kræft, neurovidenskab og infektionssygdomme4, blandt andre. For TSE spiller IHC en vigtig rolle i diagnosticering og forskning til bekræftelse og undersøgelse af PrPSc-fordeling i naturlige værter og eksperimentelle modeller. IHC bidrager til prionpatogeneseundersøgelser og analyse af PrP Sc-aflejringstyper og -mønstre, nemlig i neurale væv5, for at påvise afvigelser fra rutinemæssigt beskrevne infektioner og identificere formodede nye prionstammer.
Da prioner af bovin spongiform encephalopati (BSE) kan inficere mennesker, kan visse laboratorieprotokoller, der er involveret i arbejdet med BSE, kræve anvendelse af BSL-3-faciliteter og -praksis6. Disse omfatter anvendelse af en forseglet sekundær beholder til transport af potentielle BSE-inficerede vævsprøver inden for instituttet og laboratoriet. Det omfatter også udpegelse af indeslutningsområder og prionsærligt udstyr til BSE-forskning og -analyse, når det er muligt. Dette gøres for at forhindre kontaminering uden for arbejdsområdet og give et begrænset rum, da dekontamineringsprocedurer bliver nødvendige.
I overensstemmelse hermed følger laboratoriet for patologi i INIAV anbefalede faciliteter og praksis for biosikkerhedsniveau-3 (BSL-3)6 for at håndtere potentielle prioninficerede prøver af væv fra kvæg, små drøvtyggere og hjortedyr, der er forbundet med TSE-overvågningen.
Formalinfikseret og paraffinindlejret væv, der indgår i TSE-diagnosticerings- eller forskningsprocedurer, især i centralnervesystemet, kan være potentielt smitsomt. Derfor skal disse faste væv behandles med myresyre for at reducere smitsomheden af prioner, hvis de er til stede, før vævsbehandling. Dette udføres ved at placere faste, trimmede væv (ca. 2-4 mm tykkelse) i en behandlingskassette. Kassetten nedsænkes derefter i 98% myresyre (i 1 time). Efter nedsænkning vaskes kassetterne med væv i rindende ledningsvand i 30 minutter og returneres til fikseringsmidlet inden videre behandling. Hvis vævssektioner ikke behandles før behandling, skal postmikrotomiske vævssektioner nedsænkes i ufortyndet myresyre i mindst 5 minutter før histologisk farvning7. IHC-protokollen for PrPSc inkluderer et rutinemæssigt myresyreepitop-demmaskeringstrin, der også tjener til at inaktivere prioner7. Efter disse prioninaktiveringstrin kan det resulterende faste væv derefter behandles ved BSL-2 ved hjælp af standard BSL-2-praksis.
Minimumskravet til vævsprøvetagning til TSE-diagnosticering hos alle dyr, der er omfattet af TSE-overvågningen, er indsamling af hjernestammen (på obex-niveau). For at påvise atypisk BSE og scrapie anbefales det desuden, at en del af lillehjernen også indsamles 1,8. Til CWD-diagnose bør både hjernestamme (obex) og retropharyngeale lymfeknuder testes, da PrP Sc kunne påvises i lymfoide væv uden påviselig PrPSc i obex9, gennemgået af Machado et al.10.
Den obex-del af hjernestammen omfatter diagnostiske TSE-målsteder, nemlig dorsal vagalkernen (DVN), ensomhedskanalkernen (STN) og rygmarvskernen i trigeminusnerven (V). Disse områder udviser konsekvent bilateral akkumulering af PrPSc , selv i de tidlige stadier af BSE og klassisk scrapie. I kliniske tilfælde af fremskreden TSE viser alle gråstofområder i hjernestammen udbredt PrPSc-fordeling 11.
Før sektionering og behandling evalueres hjerneprøverne (figur 1) for at fastslå autolyseniveauet og tilstedeværelsen af eventuelle vævsskader, der potentielt kan kompromittere prøvens egnethed til IHC-baseret bekræftende diagnose8. For at validere integriteten af de præparative protokoller og analyseresultaterne indgår TSE-positive og negative vævsprøver som kontroller i forbindelse med fremstilling af væv fra testtilfælde i hvert assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64560/64560fig01.jpg"> Figur 1: PrPSc IHC-proceduren. Repræsentation, der viser den trinvise sekvens af PrPSc IHC-proceduren fra deparaffinisering af vævssektioner til eventuel immunfarvning og detektion (FFPE - Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab - monoklonalt antistof; DAB - 3,3' diaminobenzidin). Denne figur blev oprettet i BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64560/64560fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td>Undituled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin-biotin complex and peroxidase 
			Vectastain Elite ABC kit Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2000-1.5</td>
			<td>Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Prepare before use according to kit instructions. 
			Use 400 &#181;L of solution per section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation Pascal pressure chamber</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ehrlich&#8217;s Hematoxylin:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>115938</td>
			<td>Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium alum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01047.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04091.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. 
			Prepare before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (30% w/w)</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00264.1000</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Entellan</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107960</td>
			<td>Ready- to- use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (20% ) block solution in TBS: 
			Horse normal serum</td>
			<td> 
			Gibco</td>
			<td> 
			16050-122&#160;</td>
			<td>Prepare final volume according to the number of sections in the assay 
			(200 &#181;L of solution per section).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>MCA2460</td>
			<td>PrP 146-R154R171182 
			Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. 
			According to the number of sections in the assay (200 &#181;L of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) 
			Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 &#956;L into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10&#160;</td>
			<td>Cayman&#160; Chemical Company&#160;</td>
			<td>189710</td>
			<td>PrP142-160 
			Bovine, not suitable for ovine 
			Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon CoverplateTM chamber</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>72110017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining center&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73300001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining slide rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate&#160; and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. 
			Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) 
			Prepare on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich&#160;</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar and basket</td>
			<td>Deltalab&#160;</td>
			<td>19360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): 
			TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5&#177; 3 &#176;C until 2 months) 
			Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA BASE</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Panreac Applied Chem ITW reagents</td>
			<td>251769</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry

Unormale prionproteiner (PrPSc) er den sygdomsassocierede isoform af cellulært prionprotein og diagnostiske markører for transmissible spongiforme encephalopatier (TSE'er). Disse neurodegenerative sygdomme påvirker mennesker og flere dyrearter og omfatter scrapie, zoonotisk bovin spongiform encephalopati (BSE), chronic wasting disease hos hjortedyr (CWD) og den nyligt identificerede kamelprionsygdom (CPD). Diagnosticering af TSE er afhængig af immunpåvisning af PrPSc ved anvendelse af både immunhistokemi (IHC) og vestlige immunoblotmetoder (WB) på encefalonvæv, nemlig hjernestammen (obex-niveau). IHC er en meget anvendt metode, der bruger primære antistoffer (monoklonale eller polyklonale) mod antigener af interesse i celler i en vævssektion. Antistof-antigenbindingen kan visualiseres ved en farvereaktion, der forbliver lokaliseret i det område af vævet eller cellen, hvor antistoffet var målrettet. Som sådan anvendes immunhistokemiske teknikker i prionsygdomme som inden for andre forskningsområder ikke kun til diagnostiske formål, men også i patogeneseundersøgelser. Sådanne undersøgelser involverer påvisning af PrPSc-mønstre og -typer fra dem, der tidligere er beskrevet, for at identificere de nye prionstammer. Da BSE kan inficere mennesker, anbefales det, at faciliteter og/eller praksis på biosikkerhedslaboratorieniveau 3 (BSL-3) anvendes til håndtering af kvæg, små drøvtyggere og hjortedyrprøver, der indgår i TSE-overvågningen. Derudover anbefales indeslutnings- og priondedikeret udstyr, når det er muligt, for at begrænse kontaminering. PrPSc IHC-proceduren består af et myresyreepitop-demmaskeringstrin, der også fungerer som en prioninaktiveringsforanstaltning, da formalinfikseret og paraffinindlejret væv, der anvendes i denne teknik, forbliver smitsomt. Ved fortolkning af resultaterne skal man sørge for at skelne ikke-specifik immunmærkning fra målmærkning. Til dette formål er det vigtigt at genkende artefakter af immunmærkning opnået i kendte TSE-negative kontroldyr for at skelne dem fra specifikke PrP Sc-immunmærkningstyper, som kan variere mellem TSE-stammer, værtsarter og prnp-genotype, yderligere beskrevet heri.

Da ikke-specifik målimmunmærkning er mulig, er det vigtigt at fastslå niveauet for ikke-specifik immunmærkning hos kendte TSE-negative kontroldyr. Dette er et vigtigt skridt til korrekt fortolkning af specifik PrPSc-immunmærkning 7 (figur 2). Ikke-målmærkning med anti-PrP-antistoffer er blevet bemærket at forekomme som diskret intraneuronal finpartikelfarvning (mere tydelig i hypoglossalkernen og tilbehørscuneatkernen), uregelmæssige fin...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Immunmærkning af unormalt prionprotein ved hjælp af immunhistokemiske protokoller kræver specifikke prøve- og anti-PrP-antistofpræparationsmetoder. Denne protokol beskriver de vigtigste trin i epitopmaskering for at sikre korrekt PrP-immunmærkning og for at minimere ikke-specifik baggrundsfarvning. Denne tilgang overvejer også biosikkerhedsforanstaltninger ved udførelse af immunhistokemiske undersøgelser med de prioninficerede væv.

Påvisning af unormalt prionprotein ved immunhistokemi

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Teknikken tillader bekræftende diagnose af prionsygdomme ved hjælp af teknikken PrP-scrapie i væv, analyse af PrP-scrapietyper og fordeling for at evaluere straffeafvigelse til den kendte PrP-scrapieaflejringsprofil. Teknikken er standardiseret og bruger specifikke antistoffer mod PrP-scrapie, hvilket muliggør visualisering af PrP-scrapieaflejring i væv. Teknikken giver også information om det neuroanatomiske område og typen af celler.Begynd med at placere diasene med vævssektionerne i en rustfri stålfarvekurv. Gå kurven ud i et xylenbad. Efter tre minutter fjernes kurven og nedsænkes igen.For at fjerne xylen og rehydrere sektionerne nedsænkes kurven i et absolut ethanolbad. Efter tre minutter fjernes kurven og nedsænkes igen. Lufttør sektionerne, før du lægger dem i et 90% ethanolbad i et minut.Overfør derefter sektionen til et 70% ethanolbad i endnu et minut. For hver ethanolbadbehandling omrøres glidekurven forsigtigt to gange og tømmes kurven inden næste overførsel. Overfør kurven til et 50% ethanolbad i et minut.Nedsænk forsigtigt vævssektionerne i 98% myresyre ved stuetemperatur i 30 minutter. Skyl sektionerne i ledningsvand i fem minutter efterfulgt af skylning to gange i destilleret vand. Brug en farvningsbeholder i rustfrit stål i trykkammeret fyldt med 500 ml destilleret vand til at forbehandle 10 millimolær citratbuffer ved 98 grader Celsius i 20 minutter.Til kvalitetskontrolformål skal du placere et afsnit af klæbende autoklaveindikatortape på kurven for at overvåge temperatur og tryk. Når alarmen angiver, at udstyret har nået programtid og temperatur, skal du nedsænke kurven med dias. Start derefter programmet på trykkammeret til sætpunkt 2 og registrer det indledende og endelige tryk i dette program.Til inaktivering af endogen peroxidase nedsænkes diaskurven med prøvesektionerne i et bad med 3% hydrogenperoxid i methanol i 30 minutter. Bro sektionerne under rindende vand i fem minutter Efter dræning nedsænkes sektionerne i Tris-bufret saltvand i yderligere fem minutter. Til immundetektion anbringes hvert objektglas på en kommercielt tilgængelig dækpladeholder, der er fugtet med Tris-bufret saltvand, hvor vævssiden vender mod holderen og glidekanterne falder sammen med holderens to nederste punkter.Sørg for at undgå luftbobler. Hold lysbilledholderenheden mellem tommel- og pegefinger. Hold den ene finger oven på prøveglasset og den anden i bunden af holderen, og placer derefter enheden i systemets galleri.For at sikre, at sættet er godt samlet, skal du fylde brønden mellem prøveglasset og holderen med Tris-bufret saltvand uden at flyde over det. Fra dette punkt skal du sikre dig, at ca. 80 mikroliter Tris-bufret saltvand skal bevares mellem holderen og objektglasset. Lad ikke sektionerne tørre.Reducer baggrundsfarvningen før behandlingen med det primære antistof ved at præinkubere diasprøverne i 30 minutter med 20% normalt serum fra samme art som den sekundære antistofvært i Tris-bufret saltvand. Uden at vaske sektionerne påføres 200 mikroliter af den primære antistofopløsning direkte i hvert hul i diasholdersættet og inkuberes i 60 minutter ved stuetemperatur. For at vaske sektionerne skal du fylde brøndene med Tris-bufret saltvand og vente i fem minutter.Gentag vasken to gange. Fortynd derefter det biotinylerede sekundære antistof ved 1 til 200 koncentration i Tris-bufret saltvand med 10% hesteserum. Reparer det krævede volumen afhængigt af antallet af sektioner, der skal behandles.Påfør 200 mikroliter sekundær antistofopløsning på hver brønd i diasholdersættet. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur gentages Tris-bufret saltvandsvask. Til inkubation med avidin-biotinkompleks peroxidase fremstilles reagenset 30 minutter før brug og påføres 200 mikroliter af opløsningen i hvert hul i glidepladeholderen.Når det er gjort, inkuberes pladeholderen i 30 minutter ved stuetemperatur. Niveauet af ikke-specifik immunmærkning hos kendte transmissible spongiforme encephalopatier-negative kontroldyr blev bestemt til at fortolke immunmærkningen af de specifikke abnorme prionproteiner korrekt. Ikke-målmærkning ved anti-PrP-antistoffer blev bemærket at forekomme som diskret intraneuronal finpartikelfarvning, uregelmæssige fine lineære tråde af plet i neuropilen, diffus ikke-partikelmærkning i nogle grå og hvide stofområder og diffus cytoplasmatisk mærkning af neuroner.Tabellen opsummerer beskrivelsen af immunmærkede abnorme prionproteintyper observeret i bovin spongiform encephalopati, klassisk og atypisk scrapie og en chronic wasting disease hos hjortedyr til en positiv diagnose og etablerede kriterier for negative, inkonklusive og uegnede resultater. Alle trin er meget vigtige. Opløsningernes pH og stuetemperaturen er vigtige træk for succesen med denne teknik.Udvikling af immunhistokemi til påvisning af både PrP-scrapie og celletype kan give information om hver celle, der er involveret i primepatogenese.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning af Microregional Hypoxia i mus hjernebarken ved to-foton Imaging af endogent NADH Fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Wholemount Immunhistokemi for at afsløre Complex Brain Topografi

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissektion og Immunhistokemi af Larvernes, Pupal og Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Nethinder

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Påvisning af protein palmitoylering i dyrkede hippocampale neuroner ved immunopræcipitation og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Påvisning af<em&gt; In Situ</em&gt; Protein-protein-komplekser på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction Brug Proximity ligeringsassayet

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescens Billeddannelse af Neuroinflammation i transgene mus efter perifer Inokulering af alfa-synuclein Fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Overvågning celle til celle Transmission af Prion-lignende Protein aggregater i Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kvantificere mikroglia morfologi fra mikrofotografier af Immunhistokemi forberedt væv ved hjælp af ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ Autoradiografisk metode til bestemmelse af de regionale rater for cerebral protein syntese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...