Name: detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry
Uploaded: 2023-05-05T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Dit artikel werd gefinancierd door het project POCI-01-0145-FEDER-029947 "Chronic wasting disease risk assessment in Portugal" ondersteund door FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Ook ontvingen de auteurs van de onderzoekseenheid CECAV financiering van de FCT, in het kader van het project UIDB / CVT / 0772 / 2020.We bedanken Bruce C. Campbell, Research Director (gepensioneerd), Western Regional Research Center, USDA, voor zijn hulp.

De hierin beschreven IHC-procedure is een onderdeel van het onderzoeksproject FAIRJ-CT98-7021, "De oprichting van een Europees netwerk voor de surveillance van TSE's van herkauwers en de standaardisatie en harmonisatie van het proces en de criteria voor de identificatie van verdachte gevallen". Het volgt de diagnostische criteria die zijn gedefinieerd door de Wereldorganisatie voor diergezondheid, WOAH (voorheen het Office International des Épizooties, OIE)1 en het Europees referentielaboratorium...

<ol>
	<li>. WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022) Available from: <a target="_blank" href="https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/">https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/</a> (2022)</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M., Oliver, C., Jamur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-Induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.+Immunocytochemical+Methods+and+Protocols.">Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 103-119 (2010).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry).">Applications of immunohistochemistry).</a> Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology+of+Animal+Prion+Diseases.">Neuropathology of Animal Prion Diseases.</a> Biomolecules. 11 (3), 466 (2021).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf">https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf</a> (2022)</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+tissue+processing,+histology+and+immunohistochemistry+procedures+for+diagnosis+of+animal+TSE+(BSE,+scrapie,+atypical+scrapie,+CWD).+Histo+&amp;+IHC+protocols+for+TSE+diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.">Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo &amp; IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2022).</li><li>Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>Machado, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSE+Monitoring+in+Wildlife+Epidemiology,+Transmission,+Diagnosis,+Genetics+and+Control.">TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control.</a> Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology:+Confirmatory+diagnosis+of+transmissible+spongiform+encephalopathies+(TSEs)+in+cattle+and+small+ruminants.+Confirmatory+(Histo+&amp;+IHC)+diagnostic+criteria+Rev_Jan2019.pdf.">Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo &amp; IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2019).</li><li>Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+PrP+in+the+medulla+oblongata+of+sheep:+The+spectrum+of+staining+in+normal+and+scrapie-affected+sheep.">Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep.</a> The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).</li><li>Simmons, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+classical+bovine+spongiform+encephalopathy:+definition+and+progression+of+neural+PrP+immunolabeling+in+relation+to+diagnosis+and+disease+controls.">Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls.</a> Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H-type+BSE+in+Portugal.">Identification of H-type BSE in Portugal.</a> Prion. 9 (1), 22-28 (2015).</li><li>Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+lesion+profile+of+BSE+in+Portuguese+cattle+to+that+described+in+British+cattle.">Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle.</a> Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).</li><li>Pires, M. A., Travassos, F. S., G&#228;rtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+veterinary+pathology.">Atlas of veterinary pathology.</a> Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).</li><li>Pires, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+protocols,+didactic+series.">Immunology protocols, didactic series.</a> Applied Sciences. , 357 (2010).</li></ol>

TSE's zijn potentiële zoönotische ziekten. Na het opduiken van BSE in 1986 in het Verenigd Koninkrijk werd Portugal een van de lidstaten van de Europese Unie met een hogere incidentie van deze ziekte14,15. Om deze ziekte onder controle te houden, zijn andere TSE's die zijn opgedoken (klassieke en atypische scrapie, BSE-varianten en momenteel de bewaking van chronische verspillingsziekte bij hertachtigen), bewakingsmechanismen ontwikkeld door het directoraat-gen...

Volgens de prionhypothese is de abnormale isovorm (PrPSc) de primaire of enige component van het infectieuze agens in overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). Bevestiging voor de diagnose van TSE is gebaseerd op immunodetectie van PrPSc door toepassing van immunohistochemie (IHC) protocollen en/of westerse immunoblotmethoden (WB) van encefalonweefsels1.
IHC is een methode waarbij monoklonale of, in sommige gevallen, polyklonale antilichamen (als primaire antilichamen) worden gebruikt als eerste stap in immunostaining van specifiek gerichte antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. Elke effectieve primaire antilichaam-antigeenbinding wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichamen. Deze secundaire antilichamen worden geconjugeerd aan enzymen, zoals mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP). Visualisatie wordt vervolgens bereikt door een substraat aan deze enzymen toe te voegen, waardoor onoplosbare kleurproducten worden geproduceerd die zijn gelokaliseerd in gebieden waar de primaire antilichamen zijn gebonden aan de beoogde antigenen. Verbeterde visualisatie kan worden bereikt door counterstaining, waarbij een kleurstof wordt gebruikt om een contrast te creëren tussen immunogelabeld en niet-immunogelabeld weefsel2.
Met IHC met behulp van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefsels (FFPE), kan formalinefixatie de effectiviteit van primaire antilichamen tenietdoen als gevolg van cross-linking door formaldehyde en verwarming en uitdroging tijdens paraffine-inbedding. Deze veranderen de conformatie van eiwitten, vernietigen, denatureren of maskeren de epitopen, waardoor hun detectie wordt verminderd of ingetrokken3. Als zodanig vereist dit antigeen retrieval (AR). De AR-technieken verstoren formaldehyde-gerelateerde chemische groep cross-linking in de antigene moleculen, waardoor de oorspronkelijke antigeen-eiwitconformatie wordt hersteld of ontmaskerd. Dit resulteert in het herstellen van de antilichaam-antigeen (epitoop) affiniteit voor immunolabeling. De uiteindelijke werkzaamheid van AR hangt af van de kwaliteiten van het beoogde antigeen en/of het primaire antilichaam2.
Heat-induced antigen (epitope) retrieval (HIER) is een procedure van AR3 en wordt routinematig gebruikt voor PrPSc IHC-detectie, zoals hierin beschreven. IHC is essentieel voor de diagnose en wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria om de weefselverdeling van een pathologie-geassocieerd antigeen te bepalen. Het wordt veel gebruikt bij het diagnosticeren en onderzoeken van kanker, neurowetenschappen en infectieziekten4, onder anderen. Voor TSE's speelt IHC een belangrijke rol in diagnose en onderzoek voor het bevestigen en onderzoeken van PrPSc-distributie in natuurlijke gastheren en experimentele modellen. IHC draagt bij aan prionpathogenesestudies en de analyse van PrP Sc-depositietypen en -patronen, namelijk in neurale weefsels5, om afwijkingen van routinematig beschreven infecties te detecteren en vermeende nieuwe prionstammen te identificeren.
Omdat prionen van boviene spongiforme encefalopathie (BSE) de mens kunnen infecteren, kunnen bepaalde laboratoriumprotocollen die betrokken zijn bij het werk met BSE het gebruik van BSL-3-faciliteiten en -praktijken vereisen6. Deze omvatten het gebruik van een verzegelde secundaire container om potentiële met BSE geïnfecteerde weefselmonsters binnen het instituut en het laboratorium te vervoeren. Het omvat ook het aanwijzen van inperkingsgebieden en prionspecifieke apparatuur voor BSE-onderzoek en -analyse, waar mogelijk. Dit wordt gedaan om besmetting buiten het werkgebied te voorkomen en een besloten ruimte te bieden, omdat decontaminatieprocedures noodzakelijk worden.
Dienovereenkomstig volgt het Laboratorium voor Pathologie van INIAV de aanbevolen bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) faciliteiten en praktijken6 om potentiële prion-geïnfecteerde monsters van weefsels van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen in verband met de TSE-surveillance te beheren.
Formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels opgenomen in TSE diagnostische of onderzoeksprocedures, vooral in het centrale zenuwstelsel, kunnen potentieel besmettelijk zijn. Daarom moeten deze vaste weefsels worden behandeld met mierenzuur om de infectiviteit van prionen, indien aanwezig, voorafgaand aan weefselverwerking te verminderen. Dit wordt uitgevoerd door vaste, bijgesneden weefsels (ongeveer 2-4 mm dikte) in een verwerkingscassette te plaatsen. De cassette wordt vervolgens ondergedompeld in 98% mierenzuur (gedurende 1 uur). Na onderdompeling worden de cassettes met weefsels gedurende 30 minuten in stromend leidingwater gewassen en teruggebracht naar het fixatief voor verdere verwerking. Als weefselsecties niet vóór de verwerking worden behandeld, moeten postmicrotomische weefselsecties gedurende ten minste 5 minuten vóór histologische kleuring in onverdund mierenzuur worden ondergedompeld7. Het IHC-protocol voor PrPSc bevat een routinematige mierenzuur-epitoop-ontmaskeringsstap, die ook dient om prionen7 te inactiveren. Na deze prioninactiveringsstappen kunnen de resulterende vaste weefsels vervolgens worden verwerkt bij BSL-2 met behulp van standaard BSL-2-praktijken.
De minimale weefselbemonsteringsvereiste voor TSE-diagnose bij elk dier dat onder TSE-surveillance valt, is het verzamelen van de hersenstam (op obex-niveau). Bovendien wordt voor het opsporen van atypische BSE en scrapie geadviseerd om ook een deel van het cerebellum te verzamelen 1,8. Voor CWD-diagnose moeten zowel hersenstam (obex) als retrofaryngeale lymfeklieren worden getest, omdat PrP Sc kan worden gedetecteerd in lymfoïde weefsels zonder detecteerbare PrPSc in obex9, beoordeeld door Machado et al.10.
Het obex-gedeelte van de hersenstam omvat diagnostische TSE-doellocaties, namelijk de dorsale vagale kern (DVN), solitaire tractuskern (STN) en spinale tractuskern van de trigeminuszenuw (V). Deze gebieden vertonen consequent bilaterale PrP Sc-accumulatie, zelfs in de vroege stadia van BSE en klassieke scrapie. In klinische gevallen van gevorderde TSE vertonen alle grijze stofgebieden in de hersenstam een wijdverspreide PrPSc-distributie 11.
Voordat de hersenmonsters worden gesegmenteerd en verwerkt, worden ze geëvalueerd (figuur 1) om het niveau van autolyse en de aanwezigheid van weefselschade vast te stellen die mogelijk de geschiktheid van het monster voor IHC-gebaseerde bevestigende diagnose8 in gevaar brengt. Om de integriteit van de voorbereidende protocollen en de analyseresultaten te valideren, worden de positieve en negatieve weefselmonsters van TSE opgenomen als controles in combinatie met de bereiding van weefsels uit testgevallen in elke test.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64560/64560fig01.jpg"> Figuur 1: De PrPSc IHC procedure. Representatie van de stapsgewijze volgorde van de PrPSc IHC-procedure van deparaffinisatie van weefselsecties tot uiteindelijke immunostaining en detectie (FFPE - Formaline-fixed paraffine-embedded; Mab - monoklonaal antilichaam; DAB - 3,3' diaminobenzidine). Deze figuur is gemaakt in BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64560/64560fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td>Undituled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin-biotin complex and peroxidase 
			Vectastain Elite ABC kit Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2000-1.5</td>
			<td>Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Prepare before use according to kit instructions. 
			Use 400 &#181;L of solution per section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation Pascal pressure chamber</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ehrlich&#8217;s Hematoxylin:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>115938</td>
			<td>Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium alum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01047.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04091.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. 
			Prepare before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (30% w/w)</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00264.1000</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Entellan</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107960</td>
			<td>Ready- to- use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (20% ) block solution in TBS: 
			Horse normal serum</td>
			<td> 
			Gibco</td>
			<td> 
			16050-122&#160;</td>
			<td>Prepare final volume according to the number of sections in the assay 
			(200 &#181;L of solution per section).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>MCA2460</td>
			<td>PrP 146-R154R171182 
			Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. 
			According to the number of sections in the assay (200 &#181;L of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) 
			Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 &#956;L into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10&#160;</td>
			<td>Cayman&#160; Chemical Company&#160;</td>
			<td>189710</td>
			<td>PrP142-160 
			Bovine, not suitable for ovine 
			Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon CoverplateTM chamber</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>72110017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining center&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73300001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining slide rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate&#160; and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. 
			Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) 
			Prepare on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich&#160;</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar and basket</td>
			<td>Deltalab&#160;</td>
			<td>19360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): 
			TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5&#177; 3 &#176;C until 2 months) 
			Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA BASE</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Panreac Applied Chem ITW reagents</td>
			<td>251769</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry

Abnormale prioneiwitten (PrPSc) zijn de ziekte-geassocieerde isovorm van cellulair prioneiwit en diagnostische markers van overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). Deze neurodegeneratieve ziekten treffen mensen en verschillende diersoorten en omvatten scrapie, zoönotische boviene spongiforme encefalopathie (BSE), chronische verspillingsziekte van hertachtigen (CWD) en de nieuw geïdentificeerde kameel prionziekte (CPD). De diagnose van TSE's is gebaseerd op immunodetectie van PrPSc door toepassing van zowel immunohistochemie (IHC) als westerse immunoblotmethoden (WB) op encefalonweefsels, namelijk de hersenstam (obex-niveau). IHC is een veelgebruikte methode die primaire antilichamen (monoklonaal of polyklonaal) gebruikt tegen antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. De antilichaam-antigeenbinding kan worden gevisualiseerd door een kleurreactie die gelokaliseerd blijft in het gebied van het weefsel of de cel waar het antilichaam op gericht was. Als zodanig worden bij prionziekten, net als in andere onderzoeksgebieden, de immunohistochemische technieken niet alleen gebruikt voor diagnostische doeleinden, maar ook in pathogenesestudies. Dergelijke studies omvatten het detecteren van de PrPSc-patronen en -typen van de eerder beschreven patronen om de nieuwe prionstammen te identificeren. Aangezien BSE mensen kan infecteren, wordt aanbevolen dat faciliteiten en/of praktijken van bioveiligheidslaboratoria niveau 3 (BSL-3) worden gebruikt voor het hanteren van monsters van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen die in de TSE-bewaking zijn opgenomen. Daarnaast worden containment en prion-dedicated apparatuur aanbevolen, waar mogelijk, om verontreiniging te beperken. De PrPSc IHC-procedure bestaat uit een mierenzuur epitoop-deasking stap die ook fungeert als een prion-inactivatiemaatregel, omdat formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels die in deze techniek worden gebruikt, besmettelijk blijven. Bij het interpreteren van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat niet-specifieke immunolabeling wordt onderscheiden van doeletikettering. Voor dit doel is het belangrijk om artefacten van immunolabeling te herkennen die zijn verkregen in bekende TSE-negatieve controledieren om die te onderscheiden van specifieke PrP Sc-immunolabelingtypen, die kunnen variëren tussen TSE-stammen, gastheersoorten en prnp-genotype, verder hierin beschreven.

Aangezien niet-specifieke doelimmunolabeling mogelijk is, is het belangrijk om het niveau van niet-specifieke immunolabeling bij bekende TSE-negatieve controledieren vast te stellen. Dit is een belangrijke stap om specifieke PrPSc immunolabeling7 goed te interpreteren (figuur 2). Non-target labeling door anti-PrP-antilichamen is waargenomen als discrete intraneuronale fijnstofkleuring (duidelijker in de hypoglossale kern en accessoire cuneaatkern)...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Immunolabeling van abnormaal prioneiwit met behulp van immunohistochemieprotocollen vereist specifieke monster- en anti-PrP-antilichaamvoorbereidingsmethoden. Het huidige protocol beschrijft de belangrijkste stappen in epitoopontmaskering om te zorgen voor een goede PrP-immunolabeling en om niet-specifieke achtergrondkleuring te minimaliseren. Ook houdt deze benadering rekening met bioveiligheidsmaatregelen bij het uitvoeren van immunohistochemische studies met de prion-geïnfecteerde weefsels.

Detectie van abnormaal prioneiwit door immunohistochemie

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

De techniek maakt de bevestigende diagnose van prionziekten mogelijk door de techniek PrP scrapie in weefsels, waarbij de PrP scrapietypes en distributie worden geanalyseerd om de bestraffende afwijking van het bekende PrP scrapie-depositieprofiel te evalueren. De techniek is gestandaardiseerd en maakt gebruik van specifieke antilichamen tegen PrP scrapie, waardoor de visualisatie van de PrP scrapie afzetting in weefsels mogelijk is. De techniek geeft ook informatie over het neuroanatomische gebied en het type cellen.Begin met het plaatsen van de dia's met de weefselsecties in een roestvrijstalen vlekmand. Haal de mand tevoorschijn in een xyleenbad. Verwijder na drie minuten de mand en dompel deze opnieuw onder.Om xyleen te verwijderen en de secties opnieuw te hydrateren, dompelt u de mand onder in een absoluut ethanolbad. Verwijder na drie minuten de mand en dompel deze opnieuw onder. Droog de secties aan de lucht voordat u ze gedurende één minuut in een 90% ethanolbad plaatst.Breng vervolgens de sectie nog een minuut over naar een 70% ethanolbad. Voor elke behandeling met ethanolbad roert u de schuifkorf twee keer voorzichtig en laat u de mand leeglopen voordat u de volgende keer overbrengt. Breng de mand gedurende één minuut over in een 50% ethanolbad.Dompel de weefselsecties voorzichtig onder in 98% mierenzuur bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Spoel de secties gedurende vijf minuten in leidingwater, gevolgd door twee keer spoelen in gedestilleerd water. Gebruik een roestvrijstalen kleuringscontainer in de drukkamer gevuld met 500 milliliter gedestilleerd water om 10 millimolaire citraatbuffer bij 98 graden Celsius gedurende 20 minuten voor te behandelen.Plaats voor kwaliteitscontroledoeleinden een gedeelte van de zelfklevende autoclaafindicatortape op de mand om de temperatuur en druk te controleren. Zodra het alarm aangeeft dat de apparatuur de programmatijd en -temperatuur heeft bereikt, dompelt u de mand onder met dia's. Start vervolgens het programma op de drukkamer naar Punt 2 instellen en noteer de begin- en einddruk van dit programma.Voor de inactivering van endogene peroxidase dompelt u de schuifkorf met de monstersecties gedurende 30 minuten onder in een bad van 3% waterstofperoxide in methanol. Overbrug de secties onder stromend water gedurende vijf minuten Na het aftappen, dompel je de secties nog eens vijf minuten onder in Tris-gebufferde zoutoplossing. Voor immunodetectie plaatst u elke dia op een in de handel verkrijgbare afdekplaathouder die vooraf is bevochtigd met Tris-gebufferde zoutoplossing met de weefselzijde naar de houder gericht en schuifranden die samenvallen met de twee onderste punten van de houder.Zorg ervoor dat u luchtbellen vermijdt. Houd de schuifhouder tussen duim en wijsvinger. Houd één vinger op de bovenkant van de monsterplaat en de andere op de onderkant van de houder en plaats de montage vervolgens in de galerij van het systeem.Om ervoor te zorgen dat de set goed is gemonteerd, vult u de put tussen de monsterplaat en de houder met Tris-gebufferde zoutoplossing zonder deze te overlopen. Zorg er vanaf dit punt voor dat ongeveer 80 microliter Tris-gebufferde zoutoplossing tussen de houder en de glijbaan moet worden gehouden. Laat de secties niet drogen.Verminder de achtergrondkleuring voorafgaand aan de behandeling met het primaire antilichaam door de diamonsters gedurende 30 minuten vooraf te incuberen met 20% normaal serum van dezelfde soort als de secundaire antilichaamgastheer in Tris-gebufferde zoutoplossing. Breng zonder de secties te wassen 200 microliter van de primaire antilichaamoplossing rechtstreeks in elk putje van de schuifhouderset aan en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Om de secties te wassen, vult u de putten met Tris-gebufferde zoutoplossing en wacht u vijf minuten.Herhaal de was twee keer. Verdun vervolgens het gebiotinyleerde secundaire antilichaam bij een concentratie van 1 tot 200 in Tris-gebufferde zoutoplossing met 10% paardenserum. Herstel het vereiste volume afhankelijk van het aantal te behandelen secties.Breng 200 microliter secundaire antilichaamoplossing aan op elk putje van de diahouderset. Na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur herhaalt u de Tris-gebufferde zoutoplossingwassing. Voor incubatie met avidine-biotinecomplexperoxidase, bereidt u het reagens 30 minuten voor gebruik voor en brengt u 200 microliter van de oplossing aan in elk putje van de schuifplaathouder.Als u klaar bent, incubeer u de platenhouder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Het niveau van niet-specifieke immunolabeling bij bekende overdraagbare spongiforme encefalopathieën-negatieve controledieren werd bepaald om de specifieke abnormale prioneiwitten immunolabeling correct te interpreteren. Non-target labeling door anti-PrP-antilichamen werd waargenomen als discrete intraneuronale fijnstofkleuring, onregelmatige fijne lineaire draden van kleuring in de neuropil, diffuse niet-deeltjeslabeling in sommige grijze en witte stofgebieden en diffuse cytoplasmatische labeling van neuronen.De tabel geeft een overzicht van de beschrijving van immunogelabelde abnormale prioneiwittypen waargenomen bij boviene spongiforme encefalopathie, klassieke en atypische scrapie en een chronische verspillende ziekte van hertachtigen voor een positieve diagnose en vastgestelde criteria voor negatieve, niet-overtuigende en ongeschikte resultaten. Alle stappen zijn erg belangrijk. De pH van de oplossingen en de kamertemperatuur zijn belangrijke kenmerken voor het succes van deze techniek.Het ontwikkelen van immunohistochemie om zowel PrP-scrapie als het type cellen te detecteren, kan informatie geven over elke cel die betrokken is bij de primaire pathogenese.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em&gt; Drosophila</em&gt; Netvliezen

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detectie van<em&gt; In Situ</em&gt; Eiwit-eiwit complexen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Controle van cel naar cel transmissie van Prion-achtig eiwit-aggregaten in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...