Name: detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry
Uploaded: 2023-05-05T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Эта статья была профинансирована проектом POCI-01-0145-FEDER-029947 «Оценка риска хронического истощения в Португалии» при поддержке FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Кроме того, авторы исследовательского подразделения CECAV получили финансирование от FCT в рамках проекта UIDB/CVT/0772/2020.Мы благодарим Брюса К. Кэмпбелла, директора по исследованиям (в отставке), Западный региональный исследовательский центр, Министерство сельского хозяйства США, за его помощь.

Описанная в настоящем документе процедура IHC является компонентом исследовательского проекта FAIRJ-CT98-7021 «Создание европейской сети по надзору за жвачными животными TSE, а также стандартизация и гармонизация процесса и критериев для выявления подозрительных случаев». Он соответствует д?...

<ol>
	<li>. WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022) Available from: <a target="_blank" href="https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/">https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/</a> (2022)</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M., Oliver, C., Jamur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-Induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.+Immunocytochemical+Methods+and+Protocols.">Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 103-119 (2010).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry).">Applications of immunohistochemistry).</a> Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology+of+Animal+Prion+Diseases.">Neuropathology of Animal Prion Diseases.</a> Biomolecules. 11 (3), 466 (2021).</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf">https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf</a> (2022)</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+tissue+processing,+histology+and+immunohistochemistry+procedures+for+diagnosis+of+animal+TSE+(BSE,+scrapie,+atypical+scrapie,+CWD).+Histo+&amp;+IHC+protocols+for+TSE+diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.">Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo &amp; IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2022).</li><li>Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL Available from: <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019)</li><li>Machado, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSE+Monitoring+in+Wildlife+Epidemiology,+Transmission,+Diagnosis,+Genetics+and+Control.">TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control.</a> Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).</li><li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathology:+Confirmatory+diagnosis+of+transmissible+spongiform+encephalopathies+(TSEs)+in+cattle+and+small+ruminants.+Confirmatory+(Histo+&amp;+IHC)+diagnostic+criteria+Rev_Jan2019.pdf.">Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo &amp; IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , (2019).</li><li>Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+PrP+in+the+medulla+oblongata+of+sheep:+The+spectrum+of+staining+in+normal+and+scrapie-affected+sheep.">Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep.</a> The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).</li><li>Simmons, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+classical+bovine+spongiform+encephalopathy:+definition+and+progression+of+neural+PrP+immunolabeling+in+relation+to+diagnosis+and+disease+controls.">Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls.</a> Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).</li><li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+H-type+BSE+in+Portugal.">Identification of H-type BSE in Portugal.</a> Prion. 9 (1), 22-28 (2015).</li><li>Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+the+lesion+profile+of+BSE+in+Portuguese+cattle+to+that+described+in+British+cattle.">Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle.</a> Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).</li><li>Pires, M. A., Travassos, F. S., G&#228;rtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+veterinary+pathology.">Atlas of veterinary pathology.</a> Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).</li><li>Pires, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+protocols,+didactic+series.">Immunology protocols, didactic series.</a> Applied Sciences. , 357 (2010).</li></ol>

TSE являются потенциальными зоонозными заболеваниями. После появления BSE в 1986 году в Соединенном Королевстве Португалия стала одним из государств-членов Европейского Союза с более высокой заболеваемостью этим заболеванием14,15. Для борьбы с этим заболеван...

Согласно прионной гипотезе, аномальная изоформа (PrPSc) является первичным или единственным компонентом инфекционного агента при трансмиссивных губчатых энцефалопатиях (TSE). Подтверждение диагноза TSE основано на иммунодетекции PrPSc с применением протоколов иммуногистохимии (ИГХ) и/или западных иммуноблоттинговых методов (WB) тканей головного мозга1.
ИГХ представляет собой метод, использующий моноклональные или, в некоторых случаях, поликлональные антитела (в качестве первичных антител) в качестве первого шага в иммуноокрашивании специфически целевых антигенов, представляющих интерес, расположенных в клетках среза ткани. Любое эффективное первичное связывание антитело-антиген затем визуализируется с использованием вторичных антител, специфичных к первичным антителам. Эти вторичные антитела конъюгированы с ферментами, такими как пероксидаза хрена (HRP) или щелочная фосфатаза (AP). Затем визуализация достигается путем добавления субстрата к этим ферментам, образуя нерастворимые цветные продукты, локализованные в областях, где первичные антитела связаны с целевыми антигенами. Улучшенная визуализация может быть достигнута путем контрокрашивания, при котором краситель используется для создания контраста между иммуномеченой и неиммуномеченной тканью2.
При ИГХ с использованием фиксированных формалином тканей, встроенных в парафин (FFPE), фиксация формалина может свести на нет эффективность первичных антител из-за сшивания формальдегидом, а также нагревания и обезвоживания во время заделки парафина. Они изменяют конформацию белков, разрушая, денатурируя или маскируя эпитопы, тем самым уменьшая или отменяя их обнаружение3. Таким образом, это требует поиска антигена (AR). Методы AR нарушают сшивание химических групп, связанных с формальдегидом, в антигенных молекулах, тем самым восстанавливая или демаскируя исходную конформацию антиген-белок. Это приводит к восстановлению сродства антитело-антиген (эпитоп) к иммуномаркировке. Конечная эффективность АР зависит от качеств целевого антигена и/или первичного антитела2.
Термоиндуцированный поиск антигена (эпитопа) (HIER) является одной из процедур AR3 и обычно используется для обнаружения PrPSc IHC, как описано в настоящем документе. ИГХ необходим для диагностики и используется в исследовательских лабораториях для определения тканевого распределения антигена, связанного с патологией. Он широко используется, в частности, для диагностики и исследования рака, неврологии и инфекционных заболеваний4. Для TSE ИГХ играет важную роль в диагностике и исследованиях для подтверждения и исследования распределения PrPSc в естественных хозяевах и экспериментальных моделях. ИГХ способствует изучению прионного патогенеза и анализу типов и паттернов отложения PrPSc , а именно в нервных тканях5, для выявления отклонений от обычно описанных инфекций и выявления предполагаемых новых прионных штаммов.
Поскольку прионы губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE) могут инфицировать людей, некоторые лабораторные протоколы, связанные с работой с BSE, могут потребовать использования оборудования и методов BSL-36. К ним относятся использование герметичного вторичного контейнера для транспортировки потенциальных образцов тканей, инфицированных BSE, в институте и лаборатории. Это также включает в себя обозначение зон локализации и оборудования, предназначенного для исследований и анализа BSE, когда это возможно. Это делается для предотвращения загрязнения за пределами рабочей зоны и обеспечения замкнутого пространства, поскольку процедуры дезактивации становятся необходимыми.
Соответственно, Лаборатория патологии INIAV следует рекомендуемым объектам и практикам уровнябиобезопасности 3 (BSL-3) 6 для управления потенциально инфицированными прионами образцами тканей крупного рогатого скота, мелких жвачных животных и цервидов, связанных с эпиднадзором TSE.
Ткани, закрепленные формалином и залитые парафином, включенные в диагностические или исследовательские процедуры TSE, особенно в центральной нервной системе, могут быть потенциально инфекционными. Следовательно, эти фиксированные ткани должны быть обработаны муравьиной кислотой, чтобы уменьшить инфекционность прионов, если они присутствуют, перед обработкой ткани. Это выполняется путем помещения фиксированных, обрезанных тканей (толщиной примерно 2-4 мм) в обрабатываемую кассету. Затем кассету погружают в 98% муравьиную кислоту (на 1 ч). После погружения кассеты с салфетками промывают в проточной водопроводной воде в течение 30 мин, а перед дальнейшей обработкой возвращают в фиксатор. Если срезы тканей не обработаны перед обработкой, постмикротомные срезы тканей должны быть погружены в неразбавленную муравьиную кислоту не менее чем на 5 мин перед гистологическим окрашиванием7. Протокол IHC для PrPSc включает в себя рутинную стадию демаскировки эпитопа муравьиной кислоты, также служащую для инактивации прионов7. После этих этапов инактивации прионов полученные фиксированные ткани могут быть обработаны в BSL-2 с использованием стандартных методов BSL-2.
Минимальным требованием к выборке тканей для диагностики TSE у любого животного, включенного в наблюдение TSE, является сбор ствола мозга (на уровне обекса). Кроме того, для выявления атипичных BSE и царапин рекомендуется также собрать часть мозжечка 1,8. Для диагностики CWD следует тестировать как ствол головного мозга (obex), так и ретрофарингеальные лимфатические узлы, поскольку PrP Sc может быть обнаружен в лимфоидных тканях без обнаруживаемого PrPSc в obex9, рассмотренный Machado et al.10.
Обексная часть ствола мозга включает диагностические целевые участки TSE, а именно дорсальное ядро блуждающего нерва (DVN), ядро солитарного тракта (STN) и ядро спинномозгового тракта тройничного нерва (V). В этих областях последовательно присутствует двустороннее накопление PrPSc даже на ранних стадиях BSE и классического скрепи. В клинических случаях прогрессирующей TSE все области серого вещества в стволе мозга демонстрируют широко распространенное распределение PrPSc 11.
Перед секционированием и обработкой образцы мозга оценивают (рис. 1), чтобы определить уровень аутолиза и наличие каких-либо повреждений тканей, которые могут поставить под угрозу пригодность образца для подтверждающего диагноза на основе ИГХ8. Для проверки целостности препаративных протоколов и результатов анализа положительные и отрицательные образцы тканей TSE включаются в качестве контроля в сочетании с подготовкой тканей из тестовых случаев в каждом анализе.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64560/64560fig01.jpg"> Рисунок 1: Процедура PrPSc IHC. Представление, демонстрирующее пошаговую последовательность процедуры PrPSc IHC от депарафинизации срезов ткани до возможного иммуноокрашивания и обнаружения (FFPE - Формалин-фиксированный парафин-встраиваемый; Mab - моноклональное антитело; DAB - 3,3' диаминобензидин). Эта фигура была создана в BioRender.com году. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64560/64560fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td>Undituled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin-biotin complex and peroxidase 
			Vectastain Elite ABC kit Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2000-1.5</td>
			<td>Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Prepare before use according to kit instructions. 
			Use 400 &#181;L of solution per section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation Pascal pressure chamber</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ehrlich&#8217;s Hematoxylin:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>115938</td>
			<td>Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol&#160;</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>LB0507-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium alum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01047.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04091.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. 
			Prepare before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (30% w/w)</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid 98%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00264.1000</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Shandon-AS325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Entellan</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107960</td>
			<td>Ready- to- use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (20% ) block solution in TBS: 
			Horse normal serum</td>
			<td> 
			Gibco</td>
			<td> 
			16050-122&#160;</td>
			<td>Prepare final volume according to the number of sections in the assay 
			(200 &#181;L of solution per section).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>MCA2460</td>
			<td>PrP 146-R154R171182 
			Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. 
			According to the number of sections in the assay (200 &#181;L of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) 
			Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 &#956;L into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10&#160;</td>
			<td>Cayman&#160; Chemical Company&#160;</td>
			<td>189710</td>
			<td>PrP142-160 
			Bovine, not suitable for ovine 
			Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon CoverplateTM chamber</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>72110017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining center&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73300001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Sequenza&#174; Immunstaining slide rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>73310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate&#160; and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. 
			Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) 
			Prepare on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-aldrich&#160;</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar and basket</td>
			<td>Deltalab&#160;</td>
			<td>19360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): 
			TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5&#177; 3 &#176;C until 2 months) 
			Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA BASE</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Panreac Applied Chem ITW reagents</td>
			<td>251769</td>
			<td>Undiluted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of abnormal prion protein by immunohistochemistry

Аномальные прионные белки (PrPSc) представляют собой ассоциированную с заболеванием изоформу клеточного прионного белка и диагностические маркеры трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE). Эти нейродегенеративные заболевания поражают людей и несколько видов животных и включают скрепи, зоонозную губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), хроническую истощающую болезнь шейки матки (CWD) и недавно выявленную прионную болезнь верблюда (CPD). Диагностика TSE основана на иммунодетекции PrPSc с применением методов иммуногистохимии (ИГХ) и западного иммуноблоттинга (WB) на тканях головного мозга, а именно на стволе мозга (уровень obex). ИГХ является широко используемым методом, при котором используются первичные антитела (моноклональные или поликлональные) против интересующих антигенов в клетках среза ткани. Связывание антитела с антигеном может быть визуализировано с помощью цветовой реакции, которая остается локализованной в области ткани или клетки, где было нацелено антитело. Таким образом, при прионных заболеваниях, как и в других областях исследований, методы иммуногистохимии используются не только в диагностических целях, но и в исследованиях патогенеза. Такие исследования включают выявление паттернов и типов PrPSc из ранее описанных для идентификации новых прионных штаммов. Поскольку BSE может инфицировать людей, рекомендуется, чтобы лабораторные объекты биобезопасности уровня 3 (BSL-3) использовались для работы с крупным рогатым скотом, мелкими жвачными животными и образцами цервидов, включенными в эпиднадзор TSE. Кроме того, рекомендуется, когда это возможно, использовать защитную оболочку и оборудование, предназначенное для использования прионов, чтобы ограничить загрязнение. Процедура PrPSc IHC состоит из этапа демаскирования эпитопа муравьиной кислоты, который также действует как мера инактивации прионов, поскольку ткани, фиксированные формалином и залитые парафином, используемые в этом методе, остаются инфекционными. При интерпретации результатов необходимо соблюдать осторожность, чтобы отличить неспецифическую иммуномаркировку от целевой маркировки. С этой целью важно распознать артефакты иммуномаркирования, полученные у известных TSE-отрицательных контрольных животных, чтобы дифференцировать их от специфических типов иммуномечения PrPSc , которые могут варьироваться между штаммами TSE, видами-хозяевами и генотипом prnp , далее описанными в настоящем описании.

Учитывая, что неспецифическая целевая иммуномаркировка возможна, важно выяснить уровень неспецифической иммуномаркировки у известных TSE-отрицательных контрольных животных. Это важный шаг для правильной интерпретации специфической иммуномаркировки PrPSc 7 (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry at JoVE.com

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Иммуномаркировка аномального прионного белка с использованием протоколов иммуногистохимии требует специфического образца и методологий подготовки антител против PrP. В настоящем протоколе описаны ключевые этапы демаскировки эпитопов для обеспечения надлежащей иммуномаркировки PrP и минимизации неспецифического фонового окрашивания. Также при таком подходе учитываются меры биобезопасности при проведении иммуногистохимических исследований с прион-инфицированными тканями.

Обнаружение аномального прионного белка методом иммуногистохимии

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Методика позволяет проводить подтверждающую диагностику прионных заболеваний с помощью методики PrP scrapie в тканях, анализируя типы и распределение PrP scrapie для оценки карательного отклонения от известного профиля отложения PrP scrapie. Метод стандартизирован и использует специфические антитела к PrP scrapie, что позволяет визуализировать отложение PrP scrapie в тканях. Методика также дает информацию о нейроанатомической области и типе клеток.Начните с помещения предметных стекол с тканевыми срезами в корзину для окрашивания из нержавеющей стали. Вытащите корзину в ксилольной ванне. Через три минуты выньте и снова погрузите корзину.Чтобы удалить ксилол и регидратировать срезы, погрузите корзину в ванну с абсолютным этанолом. Через три минуты выньте и снова погрузите корзину. Высушите срезы на воздухе, прежде чем поместить их в ванну с 90% этанолом на одну минуту.Затем перенесите секцию в ванну с 70% этанолом еще на минуту. При каждой процедуре ванны с этанолом осторожно перемешивайте скользящую корзину дважды и сливайте воду из корзины перед следующей передачей. Переложите корзину в ванну с 50% этанолом на одну минуту.Аккуратно погрузите срезы тканей в 98%-ную муравьиную кислоту комнатной температуры на 30 минут. Промойте срезы в водопроводной воде в течение пяти минут, а затем дважды ополосните в дистиллированной воде. Используйте контейнер для окрашивания из нержавеющей стали в барокамере, заполненный 500 миллилитрами дистиллированной воды, для предварительной обработки 10-миллимолярного цитратного буфера при температуре 98 градусов Цельсия в течение 20 минут.В целях контроля качества поместите на корзину участок клейкой индикаторной ленты автоклава для контроля температуры и давления. Как только сигнал тревоги укажет, что оборудование достигло программного времени и температуры, погрузите корзину с направляющими. Затем инициируйте программу в барокамере до заданной точки 2 и запишите начальное и конечное давление этой программы.Для инактивации эндогенной пероксидазы погрузите корзину, содержащую срезы пробы, в ванну с 3%-ной перекисью водорода в метаноле на 30 минут. Соедините секции под проточной водой на пять минут После слива погрузите секции в солевой раствор с трис-буфером еще на пять минут. Для иммунодетекции поместите каждое предметное стекло на имеющийся в продаже держатель крышки, предварительно смоченный физиологическим раствором с трис-буфером, так, чтобы тканевая сторона была обращена к держателю, а края предметного стекла совпадали с двумя нижними точками держателя.Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха. Удерживайте держатель затвора между большим и указательным пальцами. Держите один палец на верхней части предметного стекла образца, а другой на нижней части держателя, затем поместите сборку в галерею системы.Чтобы убедиться, что набор хорошо собран, заполните лунку между предметным стеклом и держателем физиологическим раствором с трис-буфером, не переполняя его. С этого момента убедитесь, что между держателем и предметным стеклом должно удерживаться около 80 микролитров физиологического раствора с трис-буфером. Не допускайте высыхания срезов.Уменьшите фоновое окрашивание перед лечением первичным антителом путем предварительной инкубации образцов предметного стекла в течение 30 минут с 20% нормальной сывороткой того же вида, что и вторичный хозяин антител в физиологическом растворе, буферизованном Tris. Не промывая срезы, нанесите 200 микролитров раствора первичного антитела непосредственно в каждую лунку набора для предметного стекла и выдержите в течение 60 минут при комнатной температуре. Чтобы промыть срезы, заполните лунки солевым раствором Tris-buffer и подождите пять минут.Повторите стирку дважды. Затем разбавьте биотинилированное вторичное антитело в концентрации от 1 до 200 в трис-буферном физиологическом растворе с 10% сывороткой лошади. Отремонтируйте необходимый объем в зависимости от количества обрабатываемых участков.Нанесите 200 микролитров раствора вторичных антител на каждую лунку набора держателей предметных стекол. После 30 минут инкубации при комнатной температуре повторите промывку солевым раствором с трис-буфером. Для инкубации с пероксидазой авидин-биотинового комплекса готовят реагент за 30 минут до применения и наносят по 200 мкг раствора в каждую лунку держателя предметного стекла.После этого инкубируйте тарелку-держатель в течение 30 минут при комнатной температуре. Уровень неспецифического иммуномечения у известных трансмиссивных губчатых энцефалопатий-отрицательных контрольных животных определяли для правильной интерпретации иммуномечения специфических аномальных прионных белков. Было отмечено, что нецелевое мечение антителами против PrP происходит в виде дискретного внутринейронального окрашивания мелкими частицами, нерегулярных тонких линейных нитей окрашивания в нейропиле, диффузной нетвердой маркировки в некоторых областях серого и белого вещества и диффузной цитоплазматической маркировки нейронов.В таблице обобщено описание иммуномеченых аномальных типов прионных белков, наблюдаемых при губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота, классическом и атипичном скрепе и хроническом истощении цервидов для положительного диагноза и установленных критериев отрицательных, неубедительных и неподходящих результатов. Все шаги очень важны. pH растворов и комнатная температура являются важными характеристиками успеха этого метода.Развитие иммуногистохимии для обнаружения как скрепи PrP, так и типа клеток может дать информацию о каждой клетке, участвующей в первичном патогенезе.

detection-of-abnormal-prion-protein-by-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Объединение Липофильные краситель, На месте Гибридизация, иммуногистохимии, и гистологии

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Wholemount иммуногистохимии для выявления сложной топографии мозга

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Сетчатки

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Обнаружение<em&gt; На месте</em&gt; белок-белковых комплексов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

Биолюминесценция Визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей после инокуляции периферической альфа-синуклеина фибрилл

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.

Мониторинг в ячейке передачи китовая птичка подобных белков агрегатов в Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Количественное определение морфологии микроглии от микрофотографиями иммуногистохимия подготовлен с использованием ImageJ ткани

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

Количественный авторадиографический метод для определения региональных показателей синтеза церебрального белка в Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...