Experimentele auto-immune encefalomyelitis of EAE is een diermodel dat wordt gebruikt om nieuwe en verbeterde behandelingen voor multiple sclerosepatiënten te ontwikkelen. Het induceren van ziekten in EAE vereist een perfecte olie- en wateremulsie om consistente resultaten te bereiken. De hier gepresenteerde methode van emulsiepreparaat is vrij van menselijke invloed, waardoor inconsistenties van het ene experiment naar het andere worden beperkt.
Hoewel de methode is geoptimaliseerd voor EAE, kan deze ook worden gebruikt voor andere auto-immuunziektemodellen en ook om kankervaccins te testen. Om de CFA-slurry te bereiden op 100 milligram gevriesdroogde M tuberculosis H37 RA en vijf, 3,2 millimeter stalen kralen aan een buis van zeven milliliter. Schud de buis in de homogenisator gedurende 60 seconden op de hoogste snelheidsinstelling.
Voeg vijf milliliter IFA-adjuvans toe aan de buis en schud opnieuw gedurende 60 seconden met de hoogste snelheid. Breng vervolgens de slurry over in een verse buis met een pipet die de kralen achterlaat en bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik. Om een CFA/Peptide-emulsie voor te bereiden, downloadt u aanvullend bestand één om de hoeveelheid te berekenen die nodig is voor elk reagens.
Plaats vervolgens de buis met schroefdeksel en de reagentia die moeten worden gebruikt op ijs. Voeg vervolgens de emulsiecomponenten toe. Eerst PBS, dan het peptide, de CFA-slurry.
En tot slot IFA. Sluit de buis met de dop stevig af door deze meerdere keren aan te spannen en los te maken. Schud de tube krachtig gedurende 5 tot 10 seconden met de hand om de reagentia vooraf te mengen.
Plaats de buis in de schudhomogenisator en zet deze vast met de staaf. Stel de snelheid in op de hoogste stand en de tijd op 60 seconden. Zodra de run is voltooid, plaatst u de buis drie minuten op ijs en herhaalt u de run nog een of twee keer met dezelfde instellingen.
Centrifugeer de buis vanaf één minuut op 300 G om opgesloten lucht te verwijderen en de emulsie te verdichten. Verwijder de dop van de buis. Steek de zuiger in de buis en duw deze langzaam naar beneden totdat deze de bovenkant van de emulsie bereikt.
Verwijder de snap-off behuizing aan de onderkant van de buis door deze te draaien. Verwijder vervolgens de zuiger uit alle injectiespuiten en voeg een naald toe aan de injectiespuiten. Bevestig vervolgens de achterkant van de injectiespuit aan het speciale slot aan de onderkant van de buis en vergrendel deze met een korte draai.
Breng de emulsie van de buis over naar de injectiespuit door de zuiger voorzichtig in te drukken. Stop wanneer de emulsie de schaalverdeling van 0,15 milliliter van de injectiespuit bereikt. Scheid de injectiespuit van de buis en plaats de zuiger voorzichtig en zorg ervoor dat er geen lucht in deze spuit komt.
Druk op de zuiger totdat de emulsie uit de naald komt en herhaal het proces voor de rest van de emulsie die in de buis aanwezig is. Om de grootte van het water en de oliedeeltjes te analyseren, voegt u een kleine druppel van de emulsie toe aan een microscoopglaasje, smeert u deze uit met een afdekslip en duwt u vervolgens hard in een cirkelvormige beweging om de emulsie af te vlakken. Onderzoek de uitgesmeerde emulsie onder een fasecontrastmicroscoop met 400 keer vergroting en focus op een veld met een monolaag van de emulsie.
Zorg ervoor dat kleine, uniforme, grijze of witte deeltjes zichtbaar zijn. Emulsies geproduceerd door de homogenisatiemethode vertoonden grijze of witte boonvormige deeltjes die kleine druppeltjes water en olie-emulsies vertegenwoordigden. Daarentegen waren de emulsedruppels die met behulp van de spuitmethode werden geproduceerd groter en breder.
In de vortexmethode werden grote grijze of zwarte deeltjes waargenomen die overeenkomen met luchtbellen die in de emulsie gevangen zitten. Veranderingen in de deeltjesgrootteverdeling in de loop van de tijd, gemeten met behulp van een laserdefractiondeeltjesgrootteanalysator voor water- en olie-emulsies, vertoonden geen verandering in deeltjesgrootte gedurende een periode van zes weken. De verse emulsies van 3 weken oud en 15 weken oud veroorzaakten allemaal vergelijkbare EAE-ziekten bij alle dieren die tijdens het experiment werden getest.
Muizen ontwikkelden een vergelijkbaar ziektepatroon in alle experimenten waaruit bleek dat de hier gepresenteerde homogenisatiemethode emulsies produceerde die EAE op een consistente en reproduceerbare manier induceerden. Voordat u de emulsie voor een experiment maakt, downloadt u het aanvullende bestand nummer één om de hoeveelheid van elke component te berekenen die nodig is om verspilling te minimaliseren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om emulsiepreparaat te standaardiseren, niet alleen voor preklinisch onderzoek, maar ook in de toekomst om kankervaccins in de kliniek te bereiden.
