Name: disruption of the blood-spinal cord barrier using low-intensity focused ultrasound in a rat model
Uploaded: 2023-03-10T14:15:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

Støttet af T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15 (NVT) Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (AM). Flere figurer skabt med BioRender.com.

Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC RA20M223). Kun voksne hunrotter af Sprague-Dawley (gennemsnitsvægt: 250 g; alder: 11 uger) blev anvendt til denne undersøgelse.
1. Lavintensitet fokuseret ultralydssamling og opsætning
<ol><li>Anskaf et fokuseret ultralydstransducersystem med specifikationer, der er tilstrækkelige til at opnå BSCB-åbning hos rotter. Foreslåede parametre fra litteraturen inkluderer en central frekvens mellem 0,25-4 MHz og evnen til at producere toptryk mellem 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17. Sørg for, at systemet omfatter køre-/kontroludstyret, som mindst omfatter en bølge-/signalgenerator, radiofrekvensdrev/effektforstærker (RF) og matchende netværk (figur 2A). BEMÆRK: Den her beskrevne opsætning bruger en kommercielt tilgængelig multielementtransducer med en central frekvens på 250 kHz og 64 mm diameter (figur 2B).</li>
	<li>Fastgør den 3D-printede sondeholder og vandkeglen på transduceren (figur 2C). Sørg for en vandtæt tætning mellem keglen og transduceren. BEMÆRK: En brugerdefineret kegle- og sondeholder fulgte med transduceren, der blev brugt i dette eksperiment. Keglen og sondeholderen fastgøres til transduceren med skruer, som også er tilvejebragt.</li>
	<li>Steriliser en 50 μm tyk, akustisk gennemsigtig polyestermembran og fastgør den til bunden af vandkeglen ved hjælp af et gummibånd.</li>
	<li>Fyld vandkeglen med afgasset og deioniseret vand ved hjælp af indløbs- og udløbsrørene. Sørg for at undgå luftbobler inde i keglen, da de kan forstyrre akustisk kobling mellem transduceren og målet. Polyestermembranen skal være let oppustet. BEMÆRK: For at fjerne luftbobler fra keglen skal du føre boblerne til udløbsventilen, mens keglen fyldes med vand gennem indløbsventilen. Hvis der er mange små bobler til stede, skal du lukke alle ventilerne og dreje keglen, indtil der er en stor boble tilbage. Før denne boble til udløbsventilen, og genoptag påfyldningen af keglen.</li>
	<li>Tilslut drivudstyret, som inkluderer bølgegeneratoren og RF-drevforstærkeren, til transduceren. Transducerkablet opretter forbindelse til udgangssiden af det matchende netværk, og signalgeneratoren/effektforstærkeren opretter forbindelse til indgangssiden af det matchende netværk. Kablerne skal tilsluttes deres tilsvarende kanalnummer (figur 2D-G). BEMÆRK: I det kommercielle system, der anvendes i denne undersøgelse, er bølgegeneratoren og RF-drevforstærkeren komponenter i transducereffektudgangen (TPO) (figur 2D).</li>
	<li>Fastgør sondeholderen til den stereotaktiske arm. Fastgør den stereotaktiske arm til fikseringspladeenheden. Dette vil gøre det muligt for transduceren at blive placeret præcist over gnaveren under sonikering.</li>
</ol>2. Dyreforberedelse og kirurgisk laminektomi
<ol><li>Bedøv rotten med en blanding af isofluran og medicinsk luft i et induktionskammer fastgjort til en kulfilterbeholder. Indstil gasstrømningshastigheden til 400 ml / min og isofluranfordamperen mellem 1,5% -2,5% til anæstesiinduktion. Mængden af tid brugt i kammeret før fuldstændig sedation er variabel, selvom den typisk varierer fra 3-6 min.</li>
	<li>Registrer vægten af den bedøvede rotte og udfør en tåklemmetest. Hvis der observeres ryk eller bevægelse som reaktion på klemmen, skal du placere rotten tilbage inde i induktionskammeret i yderligere 1 minut og gentage tåklemmetesten. Gentag efter behov for at sikre, at rotten er og forbliver fuldt bedøvet.</li>
	<li>Anbring en varmepude og steril absorberende pude på fikseringspladen. Placer rotten på den absorberende pude, påfør øjensalve og placer et rektalt termometer for at overvåge kropstemperaturen. BEMÆRK: Under det kirurgiske indgreb bør rottens temperatur og puls overvåges (ideelt set bør hjertefrekvensen være mellem 330-480 slag i minuttet og temperaturen mellem 35,9-37,5 °C)18,19. Isofluran eller varmepude justeres i overensstemmelse hermed for at forhindre for tidlig død. Varmepuden kan indstilles til en temperatur omkring 37 °C og skal tændes og slukkes efter behov for at opretholde den optimale kropstemperatur.</li>
	<li>Palperer rottens sidste ribben, som er fastgjort til rygsøjlen ved den 13. brysthvirvel (T13). Brug en elektrisk barbermaskine til at barbere pelsen af rygoverfladen mellem den sidste ribben og halsen. Tør den udsatte hud med gasbind dyppet i 10% iodopovidon.</li>
	<li>Opret et midterlinjesnit ved hjælp af irissaks og disseker gennem fasciaen, indtil de spinøse processer og lamina er udsat. Fjern knogle med forskudte knoglenippers og vinklet bladiris saks, indtil rygmarven er udsat20. Længden af laminektomi og snit varierer afhængigt af antallet af forskellige mål, der skal sonikeres. I denne undersøgelse blev en tre-niveau laminektomi udført ved hjælp af et 3 cm snit. BEMÆRK: Undgå at røre ved eller lægge pres på rygmarven, mens du fjerner knogle for at forhindre skade. Hvis rottens bagben rykker under laminektomi, blev der brugt for meget kraft på ledningen eller nerverødderne.</li>
	<li>Fastgør rotten til fikseringspladen ved at klemme de spinøse processer ved siden af laminektomien. Træk let i rygsøjlen stram for at minimere krumning, før klemmerne låses.</li>
</ol>3. Mållokalisering ved hjælp af laservejledning
<ol><li>Transducerens position justeres med stereotaktisk arm, indtil den er placeret nøjagtigt over laminektomien (figur 3A). Rammen tillader bevægelse i x-, y- og z-akserne samt 180° rotation i lodret plan og 360° rotation i vandret plan.</li>
	<li>Fastgør laserapparatet til bunden af vandkeglen, og sænk det, indtil laserpunktet er synligt. Juster transducerens laterale position, indtil laserpunktet er over det sted, der er målet for BSCB-forstyrrelse (figur 3B, C). BEMÆRK: En CAD-fil (Computer-Aided Design) til laserapparatet er inkluderet i det supplerende afsnit (supplerende figur 1).</li>
	<li>Fjern laserapparatet og fyld mellemrummet mellem keglen og rygmarven med afgasset ultralydgel (figur 3D). For maksimal kobling skal du sørge for, at der ikke er luftbobler til stede i gelen. BEMÆRK: I denne undersøgelse blev transduceren med en fastgjort vandkegle sænket, indtil den var placeret 1 cm over ledningen. Da vandkeglen var 30 mm lang, var den samlede afstand fra transduceren til ledningen 40 mm. Vandkeglen blev placeret 1 cm væk fra rygmarven, fordi rottens hud, fascia og muskulatur på hver side af snittet forhindrer direkte kontakt mellem spidsen af keglen og ledningen. Brug af tallene på den stereotaktiske arms y-akse kan være nyttigt til at holde styr på den lodrette afstand, hvor keglen er 1 cm væk fra ledningen, især da gelen vil gøre visuel bekræftelse af keglens afstand fra ledningen vanskelig.</li>
	<li>Indstil parametrene for sonikering på TPO. En række værdier kan bruges til at opnå en vellykket BSCB-forstyrrelse. For maksimal effekt skal du indstille sonikeringsfrekvensen tæt på transducerens centerfrekvens. De værdier, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i tabel 1. BEMÆRK: De parametre, der er anført her, blev tilpasset fra tidligere arbejde med LIFU, med en centerfrekvens på 500 kHz, toneudbrudsvarighed på 500 μs, en arbejdscyklus på 50% og sonikeringstider på 5 eller 10 minutter for sikkert at neuromodulere en gnavermarv21. Baseret på undersøgelser, der med succes opnåede BSCB-forstyrrelse, er andre parametre, der kan bruges, centrale frekvenser mellem 500 kHz-1 MHz, tryk på 0,2-2,1 MPa, burstlængder på 10-25 ms og sonikeringstider på 2-5 min 6,10,11,22.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>Værdi</td>
		</tr><tr><td>Frekvens (kHz)</td>
			<td>250</td>
		</tr><tr><td>Fokusafstand (mm)</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>Akustisk toptryk (MPa)</td>
			<td>0.47</td>
		</tr><tr><td>Maksimalydelse</td>
			<td>40%</td>
		</tr><tr><td>Burstlængde (ms)</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>Periode(r)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Sonikeringstid (min.)</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Sonikeringsparametre, der anvendes til BSCB-forstyrrelse.
4. Administration af mikrobobler
<ol><li>Forbered en MB-opløsning i overensstemmelse med producentens anvisninger. Undgå at indføre luft i opløsningen. BEMÆRK: MB'erne er skrøbelige og klumper sammen nær toppen af hætteglasset/sprøjten, hvis de står stille i et par minutter. Ryst hætteglasset og sprøjten regelmæssigt for at forhindre en ujævn spredning af MB. MB'er har korte levetider; Se producentens vejledning for at bestemme udløbstiden.</li>
	<li>Indsæt et 22 G halevenekateter og skyl med 0,2 ml hepariniseret saltvand (500 IE / ml)23. For at øge chancerne for vellykket halevenekateterisering skal du dyppe halen i varmt vand og placere en turnering i bunden af halen for at forstørre venens diameter. BEMÆRK: Halevenekateterisering kan udføres før dyrelaminektomi, positionering og målretning for at spare undersøgelsestid.</li>
	<li>Injicer 1 ml/kg 3% EBD i kateteret. Skyl med 0,2 ml hepariniseret saltvand. Rottens ekstremiteter og øjne bliver blå. Bekræft vellykket halevenekateterisering ved at kontrollere for blå farveændring i rottens dorsale rygmarvsvene (figur 4). BEMÆRK: EBD kan injiceres godt før MB injektion og vil ikke påvirke sonikering. Hertil kommer, at da Food and Drug Administration (FDA) i øjeblikket ikke har godkendt sonikering med lægemidler, der allerede er i systemet, kan EBD også administreres efter sonikering. Dette vil resultere i mindre farvestofoptagelse, men kan være mere klinisk relevant.</li>
	<li>Injicer en 0,2 ml bolus MB i kateteret og skyl med 0,2 ml hepariniseret saltvand. Start sonikering 1-2 minutter efter injektion af MB'er. Den opsætning, der bruges her, indsamler ikke feedback i realtid sonikering. BEMÆRK: Undersøgelser for BSCB-forstyrrelser bruger typisk en højere koncentration af MB end indiceret til diagnostisk billeddannelse. Nogle koncentrationer af almindelige MB-mærker, der anvendes til BBB- og BSCB-forstyrrelser i rottemodeller, inkluderer 0,02-0,2 ml / kg og 200 μL bolusser 10,15,24,25.</li>
</ol>5. Rygmarvsekstraktion og vævsbehandling
<ol><li>Efter afslutning af sonikering perfuseres rotten transkardialt med 100 ml koldt fosfatbufret saltvand (PBS), indtil blodet løber helt klart. Leveren, som er en rig blå farve på grund af farvestoffet, skal falme til en lysebrunblå26. BEMÆRK: Formålet med perfusion er at fjerne overskydende blod fra rygmarvens vaskulatur. Da EBD binder sig til albumin, fjerner dette også overskydende EBD. Dette sikrer, at enhver EBD, der detekteres enten visuelt eller gennem fluorescensmikroskopi i rygmarven, er fra ekstravasation af farvestof ind i spinal parenchyma.</li>
	<li>Transkardialt perfusere med 100 ml koldt 4% paraformaldehyd (PFA). Rottens lemmer vil rykke under denne fiksering, hvis det gøres grundigt. Denne perfusion med PFA afliver rotten.</li>
	<li>Fjern rygmarven og anbring den i 4% PFA ved 4 °C natten over. Udskift PFA med PBS den følgende dag.</li>
</ol>6. Visualisering af BSCB-forstyrrelse
<ol><li>Isoler en 2 cm sektion omkring placeringen af sonikering ved hjælp af et barberblad. Opdel sektionen ned langs midterlinjen med bladet og sektionen i 10 μm tykke sektioner ved hjælp af et mikrotom. Til lysfeltvisualisering, plet med hæmatoxylin-eosin (H&E) plet. BEMÆRK: H&E-rygmarvsprøverne vist i denne undersøgelse blev farvet med hæmatoxylin i 3 minutter og eosin i 1 min27.</li>
	<li>Til fluorescensmikroskopi afparaffineres diasene indeholdende rygmarvssektionerne og modfarven med 25 μL 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) opløst i monteringsmediet (0,5 μg / ml). Der inkuberes ved 4 °C i mindst 10 minutter. Undgå lys for at forhindre blegning. BEMÆRK: Afparaffiniseringen kan erstattes ved at bruge en kryostat til at opnå frosne sektioner.</li>
	<li>Brug et fluorescerende mikroskop til at afbilde alle diasene. EBD autofluorescens (excitation: 470 nm og 540 nm; emission: 680 nm) er synlig i den røde kanal, mens DAPI er til stede i den blå kanal. Brug et lysmikroskop til at afbilde H&E-diasene. BEMÆRK: Selvom denne protokol beskrev en ikke-overlevelsesprocedure, blev den også udført ved hjælp af overlevelseskirurgiske teknikker. Ved overlevelseskirurgi desinficeres huden før snit med 3 skiftevis anvendelser af iodopocidon og buprenorphin administreres subkutant (0,05 mg/kg) før operationen. Fortsæt med at give subkutan buprenorphin hver 12. time mindst 3 dage postoperativt, med yderligere dage, hvis rotten udviser tegn på smerte. Hvis rygmarvsskade opstår, kan rotter udvise urinretention eller unormal gang. Dette vil præsentere som træk eller forsinket bevægelse af bagbenene eller håndgribelige, udspilede blærer. Hvis dette sker, skal husrotter med ernæringsberiget vandgel til mad og hydrering manuelt udtrykke blærer to gange om dagen, indtil reflekstømning er genoprettet. Hvis der er fuldstændig lammelse af bagben eller uhåndterlig smerte, skal du aflive rotten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chopra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-spinal+cord+barrier:+Its+role+in+spinal+disorders+and+emerging+therapeutic+strategies.">Blood-spinal cord barrier: Its role in spinal disorders and emerging therapeutic strategies.</a> NeuroSci. 3 (1), 1-27 (2021).</li><li>Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-spinal+cord+barrier:+morphology+and+clinical+implications.">The blood-spinal cord barrier: morphology and clinical implications.</a> Annals of Neurology. 70 (2), 194-206 (2011).</li><li>Hersh, A. M., Alomari, S., Tyler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+blood-brain+barrier:+Advances+in+nanoparticle+technology+for+drug+delivery+in+neuro-oncology.">Crossing the blood-brain barrier: Advances in nanoparticle technology for drug delivery in neuro-oncology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4153 (2022).</li><li>Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+blood-brain+and+blood-spinal+cord+barriers+to+interferons.">Permeability of the blood-brain and blood-spinal cord barriers to interferons.</a> Journal of Neuroimmunology. 76 (1-2), 105-111 (1997).</li><li>Bellettato, C. M., Scarpa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+strategies+to+cross+the+blood-brain+barrier.">Possible strategies to cross the blood-brain barrier.</a> Italian Journal of Pediatrics. 44, 131 (2018).</li><li>Weber-Adrian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+the+spinal+cord+using+MRI-guided+focused+ultrasound.">Gene delivery to the spinal cord using MRI-guided focused ultrasound.</a> Gene Therapy. 22 (7), 568-577 (2015).</li><li>Hersh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+focused+ultrasound+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+new+frontier.">Applications of focused ultrasound for the treatment of glioblastoma: A new frontier.</a> Cancers. 14 (19), 4920 (2022).</li><li>Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+the+blood-brain+barrier+opening+induced+by+ultrasound+in+presence+of+microbubbles.">Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 30 (7), 979-989 (2004).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+down-regulation+of+P-glycoprotein+by+focused+ultrasound+and+microbubbles+induced+blood-brain+barrier+disruption+in+rat+brain.">Localized down-regulation of P-glycoprotein by focused ultrasound and microbubbles induced blood-brain barrier disruption in rat brain.</a> Scientific Reports. 6, 31201 (2016).</li><li>Smith, P., Ogrodnik, N., Satkunarajah, J., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ultrasound-mediated+delivery+of+trastuzumab+to+normal+and+pathologic+spinal+cord+tissue.">Characterization of ultrasound-mediated delivery of trastuzumab to normal and pathologic spinal cord tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4412 (2021).</li><li>Montero, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-induced+blood-spinal+cord+barrier+opening+in+rabbits.">Ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening in rabbits.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 45 (9), 2417-2426 (2019).</li><li>Fletcher, S. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+transvertebral+ultrasound+and+microbubble-mediated+blood-spinal+cord+barrier+opening.">A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening.</a> Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).</li><li>Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Evans+blue+dye+to+fluorescently+label+and+image+intact+vasculature.">Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature.</a> BioTechniques. 70 (3), 181-185 (2021).</li><li>Fletcher, S. P., Choi, M., Ramesh, R., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-induced+blood-spinal+cord+barrier+opening+using+short-burst+phase-keying+exposures+in+rats:+A+parameter+study.">Focused ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening using short-burst phase-keying exposures in rats: A parameter study.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 47 (7), 1747-1760 (2021).</li><li>Cross, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+note:+Quantification+of+blood-spinal+cord+barrier+permeability+after+application+of+magnetic+resonance-guided+focused+ultrasound+in+spinal+cord+injury.">Technical note: Quantification of blood-spinal cord barrier permeability after application of magnetic resonance-guided focused ultrasound in spinal cord injury.</a> Medical Physics. 48 (8), 4395-4401 (2021).</li><li>Hong, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+stimulation+improves+inflammatory+resolution,+neuroprotection,+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3636 (2021).</li><li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+focused+ultrasound+alleviates+spasticity+and+increases+expression+of+the+neuronal+K-Cl+cotransporter+in+the+L4-L5+sections+of+rats+following+spinal+cord+injury.">Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the L4-L5 sections of rats following spinal cord injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 882127 (2022).</li><li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+anesthetic+agent,+depth+of+anesthesia+and+body+temperature+on+cardiovascular+functional+parameters+in+the+rat.">Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat.</a> Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).</li><li>Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+young+normal+Sprague-Dawley+rats:+weight+gain,+hematology+and+clinical+chemistry.">Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).</li><li>Lin, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+lateral+hemisection+and+asymmetric+behavioral+assessments+in+adult+rats.">Spinal cord lateral hemisection and asymmetric behavioral assessments in adult rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e57126 (2020).</li><li>Tsehay, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+pulsed+ultrasound+neuromodulation+of+a+rodent's+spinal+cord+suppresses+motor+evoked+potentials.">Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. , (2023).</li><li>Payne, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging-guided+focused+ultrasound+to+increase+localized+blood-spinal+cord+barrier+permeability.">Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability.</a> Neural Regeneration Research. 12 (12), 2045-2049 (2017).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents.">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59295 (2019).</li><li>Sabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+the+blood-brain+barrier+using+low-intensity+pulsed+ultrasound+enhances+responses+to+immunotherapy+in+preclinical+glioma+models.">Opening of the blood-brain barrier using low-intensity pulsed ultrasound enhances responses to immunotherapy in preclinical glioma models.</a> Clinical Cancer Research. 27 (15), 4325-4337 (2021).</li><li>Dr&#233;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+blood-brain+barrier+disruption+by+low+intensity+pulsed+ultrasound+increases+carboplatin+delivery+and+efficacy+in+preclinical+models+of+glioblastoma.">Temporary blood-brain barrier disruption by low intensity pulsed ultrasound increases carboplatin delivery and efficacy in preclinical models of glioblastoma.</a> Journal of Neuro-Oncology. 144 (1), 33-41 (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Yamamoto, H., Imai, S., Okuyama, T., Tsubura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+lesions+in+rats+caused+by+intravenous+injection.">Pulmonary lesions in rats caused by intravenous injection.</a> Acta Pathologica Japonica. 32 (5), 741-747 (1982).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., M&#248;llg&#229;rd, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).</li><li>Mainprize, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+primary+brain+tumors+with+non-invasive+MR-guided+focused+ultrasound:+A+clinical+safety+and+feasibility+study.">Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study.</a> Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).</li><li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt. Amir Manbachi underviser og rådgiver for BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical og er opfinder på en række patentanmeldte FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering fra NIH og er medejer af accelererende kombinationsterapier (herunder egenkapital eller optioner). Ashvattha Therapeutics Inc. har også licenseret et af hendes patenter og er aktionær for Peabody Pharmaceuticals. Nicholas Theodore modtager royalties fra og ejer aktier i Globus Medical. Han er konsulent for Globus Medical og har siddet i det videnskabelige advisory board/andet kontor for Globus Medical. De resterende forfattere har ingen interessekonflikt at oplyse.

Her beskrives det udstyr og de trin, der kræves til effektiv og målrettet BSCB-forstyrrelse ved hjælp af lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) kombineret med mikroboble (MB) administration. Denne protokol er fleksibel og kan optimeres til individuel brug med transducere med forskellige specifikationer. Andre teknikker til LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse er afhængige af brugen af magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)-styrede systemer til mållokalisering, hvilket er en dyr ressource16. Fordelene ved teknikken, der præsenteres her, ligger i den hurtige visuelle bekræftelse i realtid af BSCB-forstyrrelse og den lette målretning på grund af procedurens åbne karakter. Desuden er laserapparatet enkelt at bruge og konstruere, og en CAD-fil er inkluderet i det supplerende afsnit. Som følge heraf kan forskere, der er interesserede i at udføre indledende tests af målretningsmulighederne for deres LIFU-transducer i en lille dyremodel, bruge denne protokol som et værktøj til hurtigt at bekræfte fokuszonepositionering over et sted af interesse. Denne teknik kan også bruges af laboratorier, der begynder at studere kliniske anvendelser af LIFU, såsom lægemiddelafgivelse, før de investerer i mere komplekse vejledningsmetoder som amerikanske eller MR-systemer. I øjeblikket præsenterer USA-styrede modaliteter en mere lovende og omkostningseffektiv vej sammenlignet med MR-systemer, selvom sidstnævnte hyppigere ses i litteraturen.

Der er flere kritiske trin i denne procedure, der skal udføres omhyggeligt for at sikre en vellykket BSCB-forstyrrelse. Det er bydende nødvendigt at undgå at lægge unødvendigt pres på rygmarven under den kirurgiske laminektomi. For meget fysisk manipulation af ledningen øger sandsynligheden for skade på BSCB. Skader vises som en mørkebrun plet inde i ledningen efter ekstraktion på grund af blødning og øget EBD-ekstravasation. Desuden skal der sikres maksimal kobling mellem transduceren og den eksponerede rygmarv. Som følge heraf skal man sørge for at fjerne bobler fra vandkeglen og ultralydgelen. Der bør ikke være mellemrum mellem bunden af vandkeglen og ledningen for at sikre fuld transmission af den akustiske bølge. Under halevenekateteriseringen bør man undgå ved et uheld at passere luft sammen med de hepariniserede saltvands-, EBD- eller MB-opløsninger. Injektion af luft øger i høj grad chancen for en lungeemboli, der resulterer i gnaverdød inden afslutningen af proceduren28.
Et almindeligt problem, der kan opstå under denne procedure, er manglende vellykket EBD-injektion. For personer med minimal erfaring i halevenekateterisering sparer det tid at udføre dette trin før dyrelaminektomi, positionering eller målretning. EBD kan også injiceres godt før MB injektion uden at påvirke sonikering. Brug af turnering og varmt vandbad, der foreslås i denne protokol, hjælper med at udvide halevenerne og øge succesraten. Desuden reducerer dehydrering af rotter sandsynligheden for korrekt kateterplacering. En intraperitoneal saltvandsinjektion 10-15 minutter før halevenekateterisering kan hjælpe. Under kateteriseringen skal man starte 2 ind over enden af halen og bevæge sig i en kaudal til kranial retning. At bevæge sig i modsat retning mindsker sandsynligheden for succes på grund af potentiel venekollaps eller blødning.
En anden almindelig udfordring indebærer manglen på EBD ekstravasation på trods af sonikering. Dette kan indikere, at de parametre, der anvendes til sonikering, er utilstrækkelige til BSCB-forstyrrelse. For eksempel, hvis sonikeringsfrekvensen er indstillet til en værdi, der adskiller sig meget fra transducerens centrale frekvens, vil sonikeringseffekten være for lav til at svinge MB'er og forårsage tæt krydsløsning. Desuden jo flere grænseflader mellem transduceren og ledningen (f.eks. Vandkegle, membran, gel, luftbobler i vand / gel), jo lavere vil den sande sonikeringsintensitet være ved målet. Minimering af disse grænseflader, såsom ved hjælp af afgasset gel og grundigt fjernelse af bobler inde i keglen, vil hjælpe med at overføre det fulde potentiale af sonikeringen. Protokollen tilskynder også til at øge tiden mellem sonikering og perfusion for at give mere tid til EBD-ekstravasation i spinal parenchyma. Selvom BSCB-forstyrrelse er en forbigående procedure, er hullerne til stede i flere timer, før de lukkes. En lang ventetid øger eksponeringen for isofluran, men resulterer også i større EBD-ekstravasation i ledningen. Alternativt kan EBD ekstravasation være til stede på trods af ingen sonikering med LIFU. For at fejlfinde dette problem skal der udvises forsigtighed under laminektomien for at forhindre utilsigtet skade på BSCB. Potentielle løsninger omfatter løft af rotterygsøjlen under fastspænding for at øge mængden af plads mellem lamine og ledning samt en kortere laminektomi. En grundig PFA-perfusion reducerer også baggrundsfarvning ved at fjerne EBD-beriget blod fra vaskulaturen i rygmarven. Under transkardieperfusionen skal man sørge for at forhindre utilsigtet brud på hjertet, hvilket kan resultere i lækage af PBS eller PFA.
Det er vigtigt at bemærke, at denne undersøgelse repræsenterer en enkelt centeroplevelse for LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse. Desuden tester eller optimerer denne protokol ikke forskellige sonikeringsenergiparametre og MB-koncentrationer. Som følge heraf opfordres forskere til at undersøge forskellige parametre og koncentrationer, når de udfører denne teknik for at optimere mållokalisering og BSCB-forstyrrelse til deres særlige forskningsbehov, især hvis de første resultater giver negative virkninger. Grupper, der gerne vil se ingen temperaturændringer, kan for eksempel teste forskellige parametre, indtil de finder et sæt, der opfylder dette kriterium og opnår tilstrækkelig BSCB-forstyrrelse. Desuden kan yderligere eksperimenter udføres for at bekræfte sikkerheden ved denne teknik. For eksempel kan prøvestørrelser øges, overlevelsesperioden kan forlænges, og elektromyografi / ganganalyseundersøgelser kan udføres. For længere overlevelser er det vigtigt at huske på, at nogle undersøgelser viser, at høje doser EBD undertiden kan forårsage kronisk systemisk toksicitet, så en lavere dosis kan være forsigtig29.
En anden begrænsning af denne procedure er den invasive karakter af laminektomien (som er nødvendig for enhver teknik, der bruger LIFU til BSCB-åbning, da ultralyd ikke kan trænge gennem knoglen). Den invasive karakter af denne procedure kan reduceres ved at begrænse længden af laminektomi. Udførelse af laminektomi i de øvre brysthvirvler, som er kortere og tyndere, kan reducere den tid, der er nødvendig for laminektomi til under 10 minutter. På grund af MB'ernes skrøbelige karakter samt deres korte halveringstid er tiden begrænset under denne protokol. Injektionen af MB'er skal ske 1-2 minutter før behandling med LIFU, og nye MB'er skal administreres før hver sonikering, hvis der udføres flere LIFU-behandlinger. For forsøg, der involverer BSCB-forstyrrelse for flere rotter, kan det være nødvendigt at klargøre flere MB hætteglas. Da mikrobobler er dyre, foretrækkes ændring af den kirurgiske arbejdsgang for at minimere tiden mellem sonikeringer for at bevare antallet af anvendte MB'er.
Teknikken beskrevet her er primært til brug som en forskningsprotokol. Selvom lasermålretningsapparatet ikke erstatter traditionelle målretningsmetoder i alle kliniske indstillinger, kan det være nyttigt i andre situationer. Til ikke-invasive operationer kan traditionelle MR-modaliteter pålideligt bruges til målretningmod 30. For invasive operationer, der omfatter en laminektomi, der udføres, kan laserpunktapparatet beskrevet i denne protokol bruges til hurtigt at lokalisere midten af fokalzonen for sonikering over en bestemt region (for eksempel en tumor eller et sted for rygmarvsskade) med henblik på lægemiddelafgivelse eller immunmodulerende terapi, samtidig med at der suppleres enhver MR-vejledning, der ville finde sted.
Samlet set beskriver denne protokol en effektiv og vellykket teknik til BSCB-forstyrrelse og indeholder flere muligheder for bekræftelse af BSCB-åbningen, både i realtid og efterbehandling. Da BSCB fungerer som en barriere for adgang til rygmarvsparenchymen, er forstyrrelse af BSCB en mulig metode til at forbedre leveringen af terapi. For eksempel brugte Weber-Adrian et al. LIFU med en frekvens på 1,114 MHz og burstlængde på 10 ms til at formidle genlevering til cervikal rygsøjlen6. Tilsvarende viste Smith et al., at LIFU med en frekvens på 580 kHz, gennemsnitlige akustiske toptryk omkring 0,46 MPa og en sprænglængde på 10 ms kunne hjælpe med levering af et monoklonalt antistof, trastuzumab, til rygmarven i en gnavermodel af leptomeningeale metastaser10. De fleste undersøgelser har fokuseret på at udnytte LIFU, snarere end HIFU på grund af LIFUs evne til forbigående permeabilisering af BSCB og samtidig undgå skade på det underliggende væv. LIFU bruger typisk intensiteter mellem 0,125-3 W/cm2, mens HIFU bruger intensiteter fra 100-10.000 W/cm2 eller højere31. Som et resultat udøver HIFU sine virkninger primært gennem opvarmning af væv, mens LIFU med samtidig administration af MB'er virker gennem mekaniske kavitationseffekter. Samtidig administration af terapi med MB'er kan resultere i større ekstravasation af lægemidlet i spinal parenchyma, samt potentialet til at indlæse MB'er med lægemiddel og lyse MB'erne med ultralyd til målrettet lægemiddelafgivelse.
Sonikeringsparametrene, MB-koncentrationen og typen af transducer, der anvendes i denne undersøgelse, kan ændres baseret på eksperimentelle behov. For eksempel kan en transducer med et mindre fokusområde være at foretrække til eksperimenter, hvor der er behov for større kontrol over lokaliseret målretning, mens en transducer med højere effekt kan bruges til eksperimenter, der kræver kraftig forstyrrelse på kortere tid. På grund af den fleksibilitet, som denne protokol tilbyder, er der et stort potentiale for anvendelse i præklinisk, klinisk og translationel forskning.

I lighed med blod-hjerne-barrieren (BBB) regulerer blod-rygmarvsbarrieren (BSCB) bevægelsen af cirkulerende opløste stoffer, celler og plasmakomponenter ind i spinal parenchyma1. Denne beskyttende funktion er resultatet af et specialiseret system af tæt bundne, ikke-fenestrerede endotelceller, der forer rygsøjlekapillærerne2. Typisk kan kun lipofile molekyler med lav vægt med en positiv ladning krydse begge barrierer3. På trods af undersøgelser, der tyder på, at BSCB har en lidt højere permeabilitet end BBB, begrænser begge barrierer leveringen af terapi til centralnervesystemet4. Flere strategier er blevet udviklet for at øge transporten af lægemidler på tværs af BSCB, herunder teknikker til at øge det osmotiske tryk i rygsøjlen, udviklingen af lægemidler, der interagerer med bradykininreceptorer og oprettelsen af funktionaliserede nanopartikler5.
BSCB-forstyrrelse kan også opnås via intravenøs administration af mikrobobler (MB'er) efterfulgt af lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) sonikering6. Det akustiske felt, der genereres af ultralydstransduceren, forårsager MB-svingninger, som igen anvender stress mod endotelvæggen og løsner tætte kryds7. Den stramme krydsløsning skaber forbigående huller i kapillærerne, hvilket gør det muligt for terapi at trænge ind i spinal parenchyma (figur 1). Denne proces kan også skabe transendotelfenestrationer, øge transcytose og nedregulere ATP-bindende kassettetransportører, såsom P-glycoprotein 8,9. En vigtig fordel ved denne teknik er evnen til at minimere off-target effekter ved at lede fokalområdet af sonikering til placeringen af interesse i rygmarven. Flere kliniske forsøg har undersøgt effekten af LIFU-medieret BBB-åbning til behandling af patologier i centralnervesystemet, herunder gliomer, amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom. Selvom LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse ikke er så omfattende karakteriseret som LIFU-medieret BBB-forstyrrelse, har flere grupper rapporteret vellykket BSCB-forstyrrelse i gnaver-, kanin- og svinemodeller10,11,12. Samlet set vokser interessen for teknikken hurtigt, især som en levedygtig vej til lægemiddellevering.
I denne protokol beskrives en teknik til LIFU-medieret BSCB-forstyrrelse i en rottemodel. Proceduren omfatter detaljerede beskrivelser af dyreforberedelse, opsætning af LIFU-udstyr, MB-administration, mållokalisering og rygmarvsekstraktion. Bekræftelse af mållokalisering og BSCB-forstyrrelse evalueres via Evans blå farvestof (EBD) ekstravasation i rygmarven. EBD er en ikke-toksisk forbindelse, der binder til serumalbumin og kan identificeres ved sin rige blå farve visuelt og rød autofluorescens under mikroskopi13.
De trin, der er anført her, tilbyder et hurtigt og billigt alternativ til traditionelle ultralyd (US) eller magnetisk resonans (MR) -guidede LIFU-systemer. Som et resultat er denne metode nyttig for forskere, der er interesserede i hurtigt at teste og bekræfte målretnings- og BSCB-forstyrrelsesfunktionerne i deres LIFU-transducer, før de erhverver yderligere udstyr og materialer eller forfølger LIFU-applikationer ved rygmarven, såsom lægemiddelafgivelse, immunmodulation og neuromodulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Heparinized Sodium Chloride</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FKB0953G</td>
			<td>Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL Luer Lock Tip Syringe (2)</td>
			<td>Wilburn Medical</td>
			<td>WUSA/120</td>
			<td>One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10010001</td>
			<td>For transcardial perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G catheter</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>50-209-1694</td>
			<td>Use to place a tail vein catheter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>97% Isoflurane</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>247-897-7</td>
			<td>While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 7.5%</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>4677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class A clear threaded glass vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-314</td>
			<td>Use to store spinal cord extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital balance scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Wahl Home Products</td>
			<td>79449-200</td>
			<td>Shave fur off skin at incision site before surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>71304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>02151108-CF</td>
			<td>Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps</td>
			<td>PSI Impactors</td>
			<td>7001-2</td>
			<td>Affix the stereotactic arm to this frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>7211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors with Angled Blades</td>
			<td>ProDentUSA</td>
			<td>12-15315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction system&#160;&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-RATKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser targetting apparatus</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom</td>
			<td>CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating eye ointment</td>
			<td>Systane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 3-Way Stopcock</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAS7521-10EA</td>
			<td>Can use to fill water cone through inlet valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumason microbubbles kit</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>0270-7099-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>23-900-671&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-2000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar membrane</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>3016</td>
			<td>Can cut membrane to appropriate size if too large for cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroFUS 2.52&#34; diameter 250 kHz transducer</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>CTX-250</td>
			<td>Transducer system includes custom water cone and probe holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroFUS PRO v2.0 system</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>NFS102v2</td>
			<td>Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Offset Bone Nippers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16101-10</td>
			<td>Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24364-1&#160;</td>
			<td>Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J61899-AK</td>
			<td>For transcardial perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Surgical Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSRATKIT</td>
			<td>Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal thermometer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RET-2</td>
			<td>Maintain rat temperature between 35.9&#8211;37.5 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>50-205-1983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single animal vaporizer unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic arm</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorbent pad</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Aquasonic</td>
			<td>PLI 01-34</td>
			<td>Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disruption of the blood-spinal cord barrier using low-intensity focused ultrasound in a rat model

Lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) bruger ultralydpulsationer ved lavere intensiteter end ultralyd og testes som en reversibel og præcis neuromodulerende teknologi. Selvom LIFU-medieret blod-hjerne-barriere (BBB) åbning er blevet undersøgt i detaljer, er der ikke etableret nogen standardiseret teknik til åbning af blod-rygmarvsbarriere (BSCB) til dato. Derfor præsenterer denne protokol en metode til vellykket BSCB-forstyrrelse ved hjælp af LIFU-sonikering i en rottemodel, herunder beskrivelser af dyreforberedelse, mikrobobleadministration, målvalg og lokalisering samt BSCB-forstyrrelsesvisualisering og bekræftelse. Den tilgang, der rapporteres her, er især nyttig for forskere, der har brug for en hurtig og omkostningseffektiv metode til at teste og bekræfte mållokalisering og præcis BSCB-forstyrrelse i en lille dyremodel med en fokuseret ultralydstransducer, evaluere BSCB-effekten af sonikeringsparametre eller udforske applikationer til LIFU ved rygmarven, såsom lægemiddelafgivelse, immunmodulation og neuromodulation. Det anbefales at optimere denne protokol til individuel brug, især for at fremme fremtidigt præklinisk, klinisk og translationelt arbejde.

Dette papir viser, at den samtidige anvendelse af LIFU-sonikering og MB-administration er en effektiv teknik til lokaliseret BSCB-forstyrrelse. Åbningen af BSCB er indikeret ved tilstedeværelsen af EBD-ekstravasation i spinal parenchymen. Ændringerne er tydelige både visuelt og under fluorescensmikroskopi. Rygmarvsvaskulaturen er synlig efter laminektomi og viser den bageste rygmarvsvene med flere mindre kar, der udstråler sideværts (figur 4A). Intravenøs injektion af EBD gennem halevenekateteret resulterer i, at denne vaskulatur beriges med blåt farvestof (figur 4B). Dette er et godt punkt i proceduren for at kontrollere, at laminektomien ikke resulterede i brud på nogen rygmarvsvaskulatur, da dette ville resultere i blå blodsamling over ledningen. Efter sonikering skal en blå plet blive synlig over den målrettede placering, hvilket indikerer ekstravasation af EBD i det hvide parenchyma på grund af BSCB-forstyrrelse (figur 4C). Størrelsen af dette sted varierer baseret på en række faktorer, herunder størrelsen af transducerens brændvidde og mængden af tid efter sonikering. For at øge chancerne for at se EBD ekstravasation, bør man forlænge mængden af tid mellem sonikering og rygmarv ekstraktion.
Selvom PFA-perfusion ikke er et nødvendigt trin at udføre før navlestrengsekstraktion og efterfølgende vævsanalyse, fjerner det blod fra prøven og øger kontrasten mellem det hvide spinale parenkym og de blå EBD-farvede regioner. Alle rotter, der modtog MB administration og LIFU sonikering viser tilsyneladende ekstravasation af EBD i rygmarven, mens negative kontroller, der modtog MB'er og EBD uden LIFU sonikering ikke. Repræsentative billeder er vist i figur 5. Sagittale snit gennem vævene afslører, at EBD-ekstravasationen ikke kun er overfladisk, men strækker sig godt ind i selve ledningen. Dette forventes, da fokusområdet for transduceren, der anvendes i denne undersøgelse, er større end diameteren af rotterygmarven. Nogle gange kan små mængder blødning ses i sagittale nedskæringer. Dette kan skyldes laminektomi eller ultralydsonikering. Hvis blødningen er tæt på ledningens dorsale periferi, skyldes det mere sandsynligt laminektomi.
For yderligere at evaluere EBD-ekstravasation blev sagittale rygmarvssektioner farvet med DAPI (nuklear markør) og afbildet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. Alle ledninger, der modtog LIFU-sonikering (n = 3), viste en signifikant større intensitet af EBD-autofluorescens (p = 0,016) end ledninger, der ikke modtog sonikering, med lignende intensiteter af DAPI til stede i begge (figur 6). H &E-analyse afslørede yderligere ingen neuronal skade, blødning eller hulrumslæsioner til stede i de sonikerede steder, hvilket understøtter sikkerheden ved denne procedure. Eksempler på skadede ledninger på grund af kirurgisk mishandling og en kraftig sonikering er vist som en sammenligning. Blødning, vævsskade, hulrumslæsioner og mulig vakuolisering er mærket. Selvom eksemplet med sonikering med høj effekt ikke viser blødning, er dette også blevet rapporteret som en effekt af ultralydforstyrrelser.
Desuden blev adfærdsanalyse udført på rotter, der modtog MB'er, EBD og LIFU-sonikering. Selvom denne metode ikke helt udelukker vævsskade, tester den, om motorunderskud opstod på grund af denne procedure. Rotter blev registreret gående i et bur i 5 minutter hver dag over en periode på 5 dage, og lokomotorisk funktion blev klassificeret ud fra Basso Beattie Bresnahan lokomotorisk skala (supplerende videofil 1). Alle rotter (n = 5) fik den højeste score før sonikering, post-sonikering og hver dag i overlevelsesperioden (figur 7).
Endelig blev de termiske virkninger af sonikeringsparametrene, der blev anvendt i denne undersøgelse, målt ved hjælp af to ex vivo rotte rygmarvsprøver og en digital termometersonde med en fin spids indsat i ledningen.  Temperaturen af rygmarvsprøverne blev sporet i 5 minutter før, under og efter sonikering i alt 15 minutter. Minimale temperaturændringer blev set. Faktisk var der ≤1,3 ° C ændring på grund af sonikering i begge prøver, hvilket reducerer sandsynligheden for hypertermisk skade som følge af sonikering (figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig01.jpg"> Figur 1: Lavintensitetsfokuseret ultralydmedieret blod-rygmarvsbarriereåbningsmekanisme . (A) Skematisk oversigt over lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU) sonikering af rotterygmarv. (B) Mekanismen for åbning af blod-rygmarvsbarriere (BSCB) via LIFU-sonikering af intravenøse mikrobobler (MB'er). MB'er svinger som reaktion på LIFU, hvilket forårsager udvidelse af tætte kryds mellem endotelceller. Denne forstyrrelse af BSCB muliggør ekstravasation af nanopartikler, terapeutiske lægemidler eller Evans blå farvestof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig02.jpg"> Figur 2: Lavintensitetsfokuseret ultralydsopsætning og tilslutningsmuligheder. (A) Skematisk repræsentation, der viser typiske fokuserede ultralydskomponenter. (B) Oversigtsbillede af den fokuserede ultralydsopsætning, herunder: 1. transducereffekt (TPO), 2. matchende netværk, 3. LIFU transducer, 4. Det stereotaksiske instrument, 5. mobile klemmer. C) Transducer, herunder: 1. sondeholder, 2. ringtransducer, 3. vandkegle, 4. vandindløbsrør, 5. vandudløbsrør, 6. membran fastgjort med elastik. (D) Forsiden af TPO'en, herunder: 1. RF-afskærmet kabinet, 2. berøringsfølsomt frontdisplaypanel med justerbar menu, 3. roterende knap til parameterjustering, 4. start/stop-udgangskontakt. (E) Bagsiden af TPO'en, herunder: 1. kanaludgangsstik, 2. jord, 3. USB-indgangsport til softwarestyring, 4. intern udløser, 5. synkroniseringsudgangsstik, 6. strømindgangsstik og forsyning, 7. tænd / sluk-knap. (F) Matchende netværksudgang med ledninger, der matcher kanalnumre. (G) Matchende XDR-netværksindgang med ledninger, der matcher kanalnumre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig03.jpg"> Figur 3: Mållokalisering med laserstyring . (A) Stereotaktisk arm med bevægelsesområde i alle tre akser og rotationskapacitet. Det er fastgjort til fikseringspladen nedenfor. B) Laserapparater til identifikation af brændvidde. Laseren er placeret på spidsen af transduceren og er på linje med fokusområdet. (C) Illustration, der viser laseren på den blottede rygmarv, og som angiver, at transducerens fokusområde nu er rettet mod dette sted. (D) Transduceren sænkes, indtil spidsen af keglen er placeret 1 cm over ledningen, og mellemrummet er fyldt med gel for at sikre maksimal kobling. Afstanden fra transduceren til rygmarven er 40 mm (brændvidde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig04.jpg"> Figur 4: Evans blå farvestof ekstravasation i rygmarv post-sonikering . (A) Billede af T9-T11 rottelaminektomi snit, med den blottede rygmarv og bageste dorsale vene tydeligt synlige. (B) Den omgivende vævs- og rygmarvsvaskulatur bliver blå efter intravenøs injektion af Evans blå farvestof (EBD). (C) EBD-ekstravasation i rygmarvsparenchyma på sonikeringsstedet, hvilket indikerer, at BSCB-forstyrrelse har fundet sted. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig05.jpg"> Figur 5: Rygmarvsekstraktion og visualisering af BSCB-åbning efter perfusion. (A) Udskåret rygmarv fra kontrolrotte uden LIFU-behandling. Denne rotte modtog kun MB'er og EBD. Mid-sagittal skive af ledningen indlejret i paraffin er vist i indsatsen, og ingen EBD ekstravasation er synlig. (B) Udskåret rygmarv fra rotter med LIFU-behandling. Denne rotte modtog også MB'er og EBD. Kolonnen af EBD-ekstravasation er synlig og lokaliseret til den sonikerede region. Mid-sagittal skive af ledningen indlejret i paraffin er vist i indsatsen, med en pil, der peger på EBD-koncentrationen synlig inde i sonikeret placering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig06.jpg"> Figur 6: Påvisning og evaluering af BSCB-åbning. (A) Rygmarv farvet med DAPI (nuklear markør, blå). Minimal EBD-autofluorescens (rød) er synlig. Denne rotte modtog ikke LIFU. (B) Rygmarv farvet med DAPI (nuklear markør, blå). Lokaliseret EBD autofluorescens (rød) på sonikeret målplacering er synlig. Denne rotte modtog LIFU og MB'er. (C) Rygmarven fra en rotte uden LIFU farvet med hæmatoxylin (nukleinsyreplet) og eosin (uspecifik proteinplet) (H&E). Ingen neuronal skade, blødning eller hulrumslæsioner er synlige. (D) Rygmarven hos en rotte med LIFU farvet med H&E. Ingen neuronal skade, blødning eller hulrumslæsioner er synlige. (E) Rygmarv af en rotte med kirurgisk skade farvet med H &E. Pile peger på rigelig blødning og vævsskade. (F) Rygmarven hos en rotte med skader på grund af sonikering med høj effekt farvet med H &E. Pile peger på hulrumslæsioner, og indsatsen viser mulig vakuolisering. (G) Bar grafer, der viser intensiteten af DAPI og EBD i rygmarv af rotter med og uden LIFU sonikering. Der er signifikant mere EBD-intensitet i LIFU-rygmarven sammenlignet med den negative kontrol (p = 0,016) på trods af lignende DAPI-intensitet (p > 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig07.jpg"> Figur 7: Adfærdsmæssig analyse før og efter sonikering . (A) Basso, Beattie, Bresnahan apparatopsætning, hvor rotter blev registreret gående i 5 minutter nedenfra. (B) Stillbillede fra en optaget video. Denne video blev brugt til at vurdere rottens motoriske koordination og gang på Basso, Beattie, Bresnahan skalaen. (C) Boxplot (n = 5), der ikke viser nogen ændring i motoriske scorer præ-sonikering, post-sonikering eller i løbet af en 5-dages overlevelsesperiode hos rotter, der modtog MB'er og LIFU-behandling (p > 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig08.jpg"> Figur 8: Temperaturanalyse ved hjælp af ex vivo rygmarv. Graf, der viser temperaturændringer i to ex vivo rygmarvsprøver i en 5 min før-, under- og post-sonikeringsvarighed. De parametre, der anvendes til sonikering, er anført i tabel 1. For prøve 1 var gennemsnitstemperaturerne før, under og efter sonikering henholdsvis 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,1 °C ± 0,1 °C og 22,0 °C ± 0,1 °C. For prøve 2 var præ-, under- og post-sonikeringstemperaturerne henholdsvis 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C og 22,4 °C ± 0,2 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: CAD-fil af lasermålretningsapparater. (A) Udsigt over laserapparatet nedefra. Enhver laser kan placeres inden for det centrale hul i midten. B) Laserapparatet set fra siden. (C) Laserapparatets dimensioner med enheder i tommer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende videofil 1: Video af en rotte, der går i apparatet Basso, Beattie, Bresnahan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/Supplemental%20File%202%20Low%20Res.mov" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Forstyrrelse af blod-rygmarvsbarrieren (BSCB) kan opnås med succes ved intravenøs administration af mikrobobler og anvendelse af lavintensitetsfokuseret ultralyd (LIFU). Denne protokol beskriver åbningen af BSCB ved hjælp af LIFU i en gnavermodel, herunder udstyrsopsætning, mikrobobleinjektion, mållokalisering og BSCB-forstyrrelsesvisualisering.

Forstyrrelse af blod-rygmarvsbarrieren ved hjælp af fokuseret ultralyd med lav intensitet i en rottemodel

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

Blod-rygmarvsbarrieren er tæt bundet og har begrænset permeabilitet. Denne protokol giver forskere mulighed for sikkert og forbigående at åbne blod-rygmarvsbarrieren ved hjælp af mikrobobler og fokuseret ultralyd. Denne teknik gør det muligt at lokalisere åbning af blod-rygmarvsbarrieren til det målrettede rygmarvssegment.Derudover kan forstyrrelsen let bekræftes via visuel observation eller fluorescerende mikroskopi. Denne protokol kan undersøges for dens potentiale til at forbedre leveringen af genterapier eller lægemidler til rygmarven til behandling af tumorer, atrofi eller skade. Meghana Bhimreddy demonstrerer proceduren.En stjernelæge fra mit laboratorium, der dagligt bygger bro mellem teknik og medicin. Til at begynde med skal du erhverve et fokuseret ultralydstransducersystem med specifikationer, der er tilstrækkelige til at opnå blod-rygmarvsbarriere eller BSCB-åbninger hos rotter. Fastgør den 3D-printede sondeholder og vandkegle på transduceren.Sørg for, at der er en vandtæt forsegling mellem keglen og transduceren. Fastgør den steriliserede, 50 mikron tykke, akustisk gennemsigtige polyestermembran til bunden af vandkeglen ved hjælp af et gummibånd. Fyld vandkeglen med afgasset og deioniseret vand ved hjælp af indløbs- og udløbsrørene.Undgå luftbobler inde i keglen, da de kan forstyrre akustisk kobling mellem transduceren og målet. På dette stadium bør Mylar-membranen være lidt oppustet. Tilslut drivudstyret, der indeholder bølgegeneratoren og radiofrekvensdrevforstærkeren, til transduceren.Fastgør den stereotaktiske arm til fikseringspladen, og fastgør sondeholderen til armen. Optag vægten af en bedøvet Sprague-Dawley hunrotte, og udfør en tå- og haleklemmetest for at bekræfte anæstesi. Anbring en varmepude og steril absorberende pude på fikseringspladen.Placer rotten på den absorberende pude. Påfør øjensalve og læg et rektalt termometer for at overvåge kropstemperaturen. Palperer rottens sidste ribben, som er fastgjort til rygsøjlen ved den 13. brysthvirvel.Brug en elektrisk barbermaskine til at barbere pelsen af rygoverfladen mellem den sidste ribben og halsen. Tør den udsatte hud med gasbind dyppet i 10% iodopovidon. Opret et midterlinjesnit ved hjælp af irissaks og disseker gennem fasciaen, indtil de spinøse processer og lamina er udsat.Fjern knoglen med forskudte knoglenippere og vinklet bladirissaks, indtil rygmarven er udsat. Fastgør rotten til fikseringspladen ved at klemme de spinøse processer ved siden af laminektomien. Træk derefter let i klemmerne for at gøre rygsøjlen stram.Juster transducerens position med den stereotaktiske arm, indtil den er placeret nøjagtigt over laminektomien. Fastgør laserapparatet til bunden af vandkeglen, og sænk det, indtil laserpunktet er synligt. Juster derefter transducerens laterale position, indtil laserpunktet er over målstedet for BSCB-forstyrrelse.Fjern laserapparatet og fyld mellemrummet mellem keglen og rygmarven med afgasset ultralydgel uden at indføre luftbobler. Indstil parametrene for sonikering på transducerens effektudgang. Forbered en mikrobobleopløsning i henhold til producentens anvisninger.For at øge chancerne for vellykket halevenekateterisering skal du dyppe halen i varmt vand og placere en turnering i bunden af halen for at forstørre venernes diameter. Indsæt derefter et 22 gauge halevenekateter og skyl med 0,2 ml hepariniseret saltvand. Injicer en milliliter pr. kg 3% Evans Blue Dye eller EBD i kateteret.Skyl derefter kateteret med 0,2 ml hepariniseret saltvand. Bekræft den vellykkede halevenekateterisering ved at kontrollere for blå farveændring i rottens hud, øjne eller rygmarv. Injicer 0,2 ml bolus af mikrobobler i kateteret og skyl med hepariniseret saltvand, inden sonikering påbegyndes.Efter aflivning af rotten skal du fjerne rygmarven og placere den i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius natten over. Den følgende dag erstattes paraformaldehyd med PBS. For at visualisere BSCB-forstyrrelse skal du isolere en to centimeter sektion omkring placeringen af sonikering ved hjælp af et barberblad.Opdel sektionen i 10 mikron tykke sektioner ved hjælp af et mikrotomt og plet med hæmatoxylin eosin plet. Til fluorescensmikroskopi afparaffiniseres diaset, der indeholder rygmarvssektionen, og modpletter med 25 mikroliter DAPI opløst i monteringsmediet. Inkuber sektionerne ved fire grader celsius i 10 minutter i mørke for at forhindre blegning.Efter inkubation skal du bruge et fluorescerende mikroskop til at afbilde alle diasene. Billede hæmatoxylin og eosin farvet dias ved hjælp af et lysmikroskop. Rygmarvsvaskulaturen er synlig efter laminektomi og viser den bageste rygmarvsvene med flere mindre kar, der udstråler sideværts.Efter intravenøs injektion af EBD fremstod den omgivende vævs- og rygmarvsvaskulatur blå. Efter sonikering bliver en blå plet synlig over den målrettede placering, hvilket indikerer ekstravasation af EBD i det hvide parenchyma på grund af BSCB-forstyrrelse. Udskåret rygmarv fra rotter med lav intensitet fokuseret ultralyd, eller LIFU sonikering, bekræftede tilsyneladende ekstravasation af EBD i rygmarven.Mens negative kontrollerede rotter uden LIFU-behandling ikke viste EBD-ekstravasation. Rygmarv med LIFU-sonikering viste signifikant større intensitet af EBD-autofluorescens end ledninger, der ikke modtog sonikering. Med lignende intensiteter af DAPI til stede i begge.Hæmatoxylin og eosin analyse afslørede ingen neuronal skade, blødning, eller hulrum læsioner i sonikerede steder. Eksempler på skadede ledninger på grund af kirurgisk fejlhåndtering og højdrevet sonikering vises som en sammenligning. Hos rotter, der modtog mikrobobler og LIFU-behandling, blev der ikke observeret nogen ændring i motorisk score, præ-sonikering, post-sonikering og i løbet af en fem dages overlevelsesperiode.Minimale ændringer i rygmarvstemperaturen blev observeret før, under og efter sonikeringsanalyse. Det er vigtigt at begrænse kirurgisk skade på ledningen under laminektomi. Visualisering af H- og E-farvede sektioner med mikroskopi vil indikere, om der er sket skade.Efter forstyrrelse af blod-rygmarvsbarrieren ved hjælp af fokusultralyd kan dyr injiceres med antineoplastiske midler eller genterapier. Resultatet vil afgøre, om denne teknik kan forbedre leveringen af terapi og forlænge overlevelsen i forbindelse med rygmarvspatologi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Induktion af adhæsionsafhængige Signaler af ringe intensitet Ultralyd

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing af Barrier vævssprængning med en organisk Elektrokemisk Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Real-time overvågning af High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) ablation af<em&gt; In vitro</em&gt; Canine Lever Brug Harmonisk Motion Imaging for fokuseret ultralyd (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Uddannelse Personer med rygmarvsskader at ambulate Ved hjælp af en Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In vitro gennemtrængning af FITC-loaded Ferritins tværs af en rotte blodhjernebarrieren: en model til at studere den Levering af Nanoformulated molekyler

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Korrekt positionering og fiksering af en rotte Hind lemmer for fokuseret høj opløsning billeddannelse af knogle-mikroarkitektur ved hjælp af In Vivo mikro-beregnet tomografi

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...