Name: disruption of the blood-spinal cord barrier using low-intensity focused ultrasound in a rat model
Uploaded: 2023-03-10T14:15:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

Støttet av T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15 (N.V.T.); Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (AM). Flere figurer laget med BioRender.com.

Alle dyreforsøk ble godkjent og utført i samsvar med Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC RA20M223). Kun voksne Sprague-Dawley hunnrotter (gjennomsnittsvekt: 250 g; alder: 11 uker) ble brukt i denne studien.
1. Lavintensitetsfokusert ultralydmontering og oppsett
<ol><li>Skaff deg et fokusert ultralydtransdusersystem med spesifikasjoner som er tilstrekkelige til å oppnå BSCB-åpning hos rotter. Foreslåtte parametere fra litteraturen inkluderer en sentral frekvens mellom 0,25-4 MHz og evnen til å produsere topptrykk mellom 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17. Sørg for at systemet inkluderer kjøre-/kontrollutstyret, som minst inkluderer en bølge-/signalgenerator, radiofrekvens (RF) driv-/effektforsterker og matchende nettverk (figur 2A). MERK: Oppsettet som er beskrevet her, bruker en kommersielt tilgjengelig multielementtransduser med en sentralfrekvens på 250 kHz og 64 mm diameter (figur 2B).</li>
	<li>Fest den 3D-printede sondeholderen og vannkjeglen på svingeren (figur 2C). Sørg for en vanntett forsegling mellom kjeglen og svingeren. MERK: En tilpasset kjegle og sondeholder fulgte med svingeren som ble brukt i dette eksperimentet. Keglen og sondeholderen festes til transduseren med skruer, som også er tilveiebrakt.</li>
	<li>Steriliser en 50 μm tykk, akustisk gjennomsiktig polyestermembran og fest til bunnen av vannkjeglen ved hjelp av et gummibånd.</li>
	<li>Fyll vannkjeglen med avgasset og avionisert vann ved hjelp av innløps- og utløpsrørene. Pass på å unngå luftbobler inne i kjeglen, da de kan forstyrre akustisk kobling mellom svingeren og målet. Polyestermembranen skal være litt oppblåst. NOTAT: For å fjerne luftbobler fra kjeglen, før boblene til utløpsventilen mens du fyller kjeglen med vann gjennom innløpsventilen. Hvis det er mange små bobler, lukk alle ventilene og roter kjeglen til en stor boble gjenstår. Før denne boblen til utløpsventilen og fortsett å fylle kjeglen.</li>
	<li>Koble drivutstyret, som inkluderer bølgegeneratoren og RF-drivforsterkeren, til transduseren. Transduserkabelen vil koble til utgangssiden av det matchende nettverket, og signalgeneratoren / effektforsterkeren vil koble til inngangssiden av det tilsvarende nettverket. Kablene skal kobles til det tilsvarende kanalnummeret (figur 2D-G). MERK: I det kommersielle systemet som brukes i denne studien, er bølgegeneratoren og RF-drivforsterkeren komponenter i svingereffekten (TPO) (figur 2D).</li>
	<li>Fest sondeholderen til den stereotaktiske armen. Fest den stereotaktiske armen til fikseringsplateenheten. Dette vil tillate transduseren å bli plassert nøyaktig over gnageren under sonikering.</li>
</ol>2. Animal forberedelse og kirurgisk laminektomi
<ol><li>Bedøv rotta med en blanding av isofluran og medisinsk luft i et induksjonskammer festet til en kullfilterbeholder. Sett gasstrømningshastigheten til 400 ml/min og isofluran fordamperen mellom 1,5 % -2,5 % for anestesiinduksjon. Mengden tid brukt i kammeret før fullstendig sedasjon er variabel, selv om det vanligvis varierer fra 3-6 min.</li>
	<li>Registrer vekten av den bedøvede rotta og utfør en tåklemmetest. Hvis det observeres rykk eller bevegelse som respons på klemmen, plasser rotta tilbake i induksjonskammeret i ytterligere 1 min og gjenta tåklemmetesten. Gjenta etter behov for å sikre at rotta er og forblir fullt bedøvet.</li>
	<li>Plasser en varmepute og en steril absorberende pute på fikseringsplaten. Plasser rotta på den absorberende puten, bruk øyesalve og plasser et rektalt termometer for å overvåke kroppstemperaturen. MERK: Under den kirurgiske prosedyren bør rottens temperatur og hjertefrekvens overvåkes (ideelt sett bør hjertefrekvensen være mellom 330-480 bpm og temperaturen mellom 35,9-37,5 ° C) 18,19. Juster isofluran eller varmepute tilsvarende for å forhindre for tidlig død. Varmeputen kan stilles inn på en temperatur rundt 37 °C og bør slås av og på etter behov for å opprettholde optimal kroppstemperatur.</li>
	<li>Palpere den siste ribben av rotta, som er festet til ryggraden ved 13th thoracic vertebra (T13). Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere pelsen av ryggflaten mellom den siste ribben og nakken. Tørk den eksponerte huden med gasbind dyppet i 10% iodopovidon.</li>
	<li>Lag et midtlinjesnitt ved hjelp av irissaks og dissekere gjennom fascia til de spinøse prosessene og lamina blir eksponert. Fjern bein med offset bone nippers og vinklet blad iris saks til ryggmargen er utsatt20. Lengden på laminektomi og snitt varierer basert på antall forskjellige mål som skal soniseres. I denne studien ble en tre-nivå laminektomi utført ved hjelp av et 3 cm snitt. MERK: Unngå å berøre eller legge press på ryggmargen mens du fjerner bein for å forhindre skade. Hvis rottens bakre lemmer rykker under laminektomi, ble det brukt for mye kraft på ledningen eller nerverøttene.</li>
	<li>Fest rotta til fikseringsplaten ved å klemme de spinøse prosessene ved siden av laminektomi. Trekk ryggraden stramt for å minimere krumning før du låser klemmene.</li>
</ol>3. Mållokalisering ved hjelp av laserveiledning
<ol><li>Juster posisjonen til transduseren med den stereotaktiske armen til den ligger nøyaktig over laminektomien (figur 3A). Rammen tillater bevegelse i x-, y- og z-aksene, samt 180° rotasjon i vertikalplanet og 360° rotasjon i horisontalplanet.</li>
	<li>Fest laserapparatet til bunnen av vannkjeglen og senk det til laserpunktet er synlig. Juster sideposisjonen til transduseren til laserpunktet er over stedet som er målet for BSCB-forstyrrelser (figur 3B,C). MERK: En dataassistert konstruksjonsfil (CAD) for laserapparatet er inkludert i tilleggsdelen (tilleggsfigur 1).</li>
	<li>Fjern laserapparatet og fyll mellomrommet mellom kjeglen og ryggmargen med avgasset ultralydgel (figur 3D). For maksimal kobling må du sørge for at det ikke er luftbobler i gelen. MERK: I denne studien ble transduseren med en festet vannkjegle senket til den var plassert 1 cm over ledningen. Siden vannkeglen var 30 mm lang, var den totale avstanden fra svingeren til ledningen 40 mm. Vannkjeglen ble plassert 1 cm fra ryggmargen fordi rottens hud, fascie og muskulatur på hver side av snittet hindrer direkte kontakt mellom tuppen av kjeglen og navlesnoren. Bruk av tallene på den stereotaktiske armens y-akse kan være nyttig for å holde styr på den vertikale avstanden der kjeglen er 1 cm fra ledningen, spesielt siden gelen vil gjøre visuell bekreftelse av kjeglens avstand fra ledningen vanskelig.</li>
	<li>Sett parametrene for sonikering på TPO. En rekke verdier kan brukes for å oppnå vellykket BSCB-forstyrrelse. For maksimal effekt, sett sonikeringsfrekvensen nær senterfrekvensen til transduseren. Verdiene som ble brukt i denne studien er listet opp i tabell 1. MERK: Parametrene som er oppført her, ble tilpasset fra tidligere arbeid med LIFU, med en senterfrekvens på 500 kHz, toneburstvarighet på 500 μs, en driftssyklus på 50% og sonikeringstider på 5 eller 10 minutter for å trygt neuromodulere en gnager ryggmargen21. Basert på studier som vellykket oppnådde BSCB-forstyrrelse, er andre parametere som kan brukes, sentrale frekvenser mellom 500 kHz-1 MHz, trykk på 0,2-2,1 MPa, burstlengder på 10-25 ms og sonikeringstider på 2-5 min 6,10,11,22.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>Verdi</td>
		</tr><tr><td>Frekvens (kHz)</td>
			<td>250</td>
		</tr><tr><td>Fokusavstand (mm)</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>Akustisk topptrykk (MPa)</td>
			<td>0.47</td>
		</tr><tr><td>Driftssyklus</td>
			<td>40%</td>
		</tr><tr><td>Serielengde (ms)</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>Periode(r)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Sonikeringstid (min)</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Sonikeringsparametere brukt til BScb-forstyrrelse.
4. Administrasjon av mikrobobler
<ol><li>Forbered en MB-løsning i samsvar med instruksjonene fra produsenten. Unngå å introdusere luft i løsningen. MERK: MB-ene er skjøre og klumper seg sammen nær toppen av hetteglasset/sprøyten hvis de får stå stille i noen minutter. Rist hetteglasset og sprøyten regelmessig for å hindre ujevn spredning av MB. MB har kort levetid; Sjekk produsentens veiledning for å bestemme utløpstiden.</li>
	<li>Sett inn et 22 G halevenekateter og skyll med 0,2 ml heparinert saltvann (500 IE/ml)23. For å øke sjansene for vellykket kateterisering av halevene, dypp halen i varmt vann og plasser en turniquet ved foten av halen for å forstørre venens diameter. MERK: Hale venekateterisering kan utføres før dyr laminektomi, posisjonering og målretting for å spare studietid.</li>
	<li>Injiser 1 ml/kg 3 % EBD inn i kateteret. Skyll med 0,2 ml heparinisert saltvann. Rottens ekstremiteter og øyne blir blå. Bekreft vellykket halevenekateterisering ved å sjekke for blå fargeendring i rottens dorsale spinalvene (figur 4). MERK: EBD kan injiseres godt før MB injeksjon og vil ikke påvirke sonikering. I tillegg, siden Food and Drug Administration (FDA) for tiden ikke har godkjent sonikering med legemidler som allerede er i systemet, kan EBD også administreres etter sonikering. Dette vil gi mindre fargestoffopptak, men kan være mer klinisk relevant.</li>
	<li>Injiser en 0,2 ml bolus med MB i kateteret og skyll med 0,2 ml heparinisert saltvann. Start sonikering 1-2 minutter etter injeksjon av MB. Oppsettet som brukes her, samler ikke sanntids sonikeringstilbakemelding. MERK: Studier for BSCB-forstyrrelser bruker vanligvis en høyere konsentrasjon av MB enn indikert for diagnostisk bildebehandling. Noen konsentrasjoner av vanlige MB-merker som brukes til BBB- og BSCB-forstyrrelser i rottemodeller inkluderer 0,02-0,2 ml/kg og 200 μL boluser 10,15,24,25.</li>
</ol>5. Ryggmargsekstraksjon og vevsbehandling
<ol><li>Etter ferdigstillelse av sonikering, transkardielt perfusere rotta med 100 ml kald fosfatbufret saltvann (PBS) til blodet går helt klart. Leveren, som er en rik blå farge på grunn av fargestoffet, skal falme til en lysebrunblå26. MERK: Hensikten med perfusjon er å fjerne overflødig blod fra ryggmargens vaskulatur. Siden EBD binder seg til albumin, fjerner dette også overflødig EBD. Dette sikrer at enhver EBD oppdaget enten visuelt eller gjennom fluorescensmikroskopi i ryggmargen er fra ekstravasasjon av fargestoff inn i spinal parenkym.</li>
	<li>Transkardialt perfusert med 100 ml kald 4% paraformaldehyd (PFA). Rottens lemmer vil rykke under denne fikseringen hvis det gjøres grundig. Denne perfusjonen med PFA avliver rotta.</li>
	<li>Fjern ryggmargen og legg den i 4 % PFA ved 4 °C over natten. Erstatt PFA med PBS neste dag.</li>
</ol>6. Visualisering av BSCB-forstyrrelser
<ol><li>Isoler en 2 cm seksjon som omgir plasseringen av sonikering ved hjelp av et barberblad. Del seksjonen ned midtlinjen med bladet og seksjonen i 10 μm tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotom. For lysfeltvisualisering, flekk med hematoksylin-eosin (H &E) flekk. MERK: H&E ryggmargsprøvene vist i denne studien ble farget med hematoksylin i 3 minutter og eosin i 1 min27.</li>
	<li>For fluorescensmikroskopi, deparaffiniser lysbildene som inneholder ryggmargsseksjonene og motflekk med 25 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) oppløst i monteringsmediet (0,5 μg / ml). Inkuber ved 4 °C i minst 10 minutter. Unngå lys for å forhindre bleking. MERK: Deparaffiniseringen kan erstattes ved å bruke en kryostat for å oppnå frosne seksjoner.</li>
	<li>Bruk et fluorescerende mikroskop til å avbilde alle lysbildene. EBD autofluorescens (eksitasjon: 470 nm og 540 nm; utslipp: 680 nm) er synlig i den røde kanalen, mens DAPI er tilstede i den blå kanalen. Bruk et lysmikroskop til å avbilde H&E-lysbildene. MERK: Selv om denne protokollen beskrev en ikke-overlevelsesprosedyre, ble den også utført ved hjelp av overlevelseskirurgiske teknikker. For overlevelseskirurgi, desinfiser huden før snitt med 3 alternerende påføringer av iodopovidon og administrer buprenorfin subkutant (0,05 mg/kg) før kirurgi. Fortsett å gi subkutan buprenorfin hver 12. time minst 3 dager postoperativt, med ytterligere dager hvis rotta viser tegn på smerte. Hvis ryggmargsskade oppstår, kan rotter utvise urinretensjon eller unormal gange. Dette vil presentere som dra eller forsinket bevegelse av bakre lemmer eller palpable, oppblåste blærer. Hvis dette skjer, husrotter med ernæringsmessig forsterket vanngel for mat og hydrering og manuelt uttrykke blærene to ganger om dagen til reflekstømming er gjenopprettet. Hvis det er fullstendig lammelse av bakre lemmer eller ugjennomtrengelig smerte, avlive rotta.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chopra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-spinal+cord+barrier:+Its+role+in+spinal+disorders+and+emerging+therapeutic+strategies.">Blood-spinal cord barrier: Its role in spinal disorders and emerging therapeutic strategies.</a> NeuroSci. 3 (1), 1-27 (2021).</li><li>Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-spinal+cord+barrier:+morphology+and+clinical+implications.">The blood-spinal cord barrier: morphology and clinical implications.</a> Annals of Neurology. 70 (2), 194-206 (2011).</li><li>Hersh, A. M., Alomari, S., Tyler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+blood-brain+barrier:+Advances+in+nanoparticle+technology+for+drug+delivery+in+neuro-oncology.">Crossing the blood-brain barrier: Advances in nanoparticle technology for drug delivery in neuro-oncology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4153 (2022).</li><li>Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+blood-brain+and+blood-spinal+cord+barriers+to+interferons.">Permeability of the blood-brain and blood-spinal cord barriers to interferons.</a> Journal of Neuroimmunology. 76 (1-2), 105-111 (1997).</li><li>Bellettato, C. M., Scarpa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+strategies+to+cross+the+blood-brain+barrier.">Possible strategies to cross the blood-brain barrier.</a> Italian Journal of Pediatrics. 44, 131 (2018).</li><li>Weber-Adrian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+the+spinal+cord+using+MRI-guided+focused+ultrasound.">Gene delivery to the spinal cord using MRI-guided focused ultrasound.</a> Gene Therapy. 22 (7), 568-577 (2015).</li><li>Hersh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+focused+ultrasound+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+new+frontier.">Applications of focused ultrasound for the treatment of glioblastoma: A new frontier.</a> Cancers. 14 (19), 4920 (2022).</li><li>Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+the+blood-brain+barrier+opening+induced+by+ultrasound+in+presence+of+microbubbles.">Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 30 (7), 979-989 (2004).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+down-regulation+of+P-glycoprotein+by+focused+ultrasound+and+microbubbles+induced+blood-brain+barrier+disruption+in+rat+brain.">Localized down-regulation of P-glycoprotein by focused ultrasound and microbubbles induced blood-brain barrier disruption in rat brain.</a> Scientific Reports. 6, 31201 (2016).</li><li>Smith, P., Ogrodnik, N., Satkunarajah, J., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ultrasound-mediated+delivery+of+trastuzumab+to+normal+and+pathologic+spinal+cord+tissue.">Characterization of ultrasound-mediated delivery of trastuzumab to normal and pathologic spinal cord tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4412 (2021).</li><li>Montero, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-induced+blood-spinal+cord+barrier+opening+in+rabbits.">Ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening in rabbits.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 45 (9), 2417-2426 (2019).</li><li>Fletcher, S. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+transvertebral+ultrasound+and+microbubble-mediated+blood-spinal+cord+barrier+opening.">A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening.</a> Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).</li><li>Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Evans+blue+dye+to+fluorescently+label+and+image+intact+vasculature.">Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature.</a> BioTechniques. 70 (3), 181-185 (2021).</li><li>Fletcher, S. P., Choi, M., Ramesh, R., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-induced+blood-spinal+cord+barrier+opening+using+short-burst+phase-keying+exposures+in+rats:+A+parameter+study.">Focused ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening using short-burst phase-keying exposures in rats: A parameter study.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 47 (7), 1747-1760 (2021).</li><li>Cross, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+note:+Quantification+of+blood-spinal+cord+barrier+permeability+after+application+of+magnetic+resonance-guided+focused+ultrasound+in+spinal+cord+injury.">Technical note: Quantification of blood-spinal cord barrier permeability after application of magnetic resonance-guided focused ultrasound in spinal cord injury.</a> Medical Physics. 48 (8), 4395-4401 (2021).</li><li>Hong, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+stimulation+improves+inflammatory+resolution,+neuroprotection,+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3636 (2021).</li><li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+focused+ultrasound+alleviates+spasticity+and+increases+expression+of+the+neuronal+K-Cl+cotransporter+in+the+L4-L5+sections+of+rats+following+spinal+cord+injury.">Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the L4-L5 sections of rats following spinal cord injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 882127 (2022).</li><li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+anesthetic+agent,+depth+of+anesthesia+and+body+temperature+on+cardiovascular+functional+parameters+in+the+rat.">Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat.</a> Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).</li><li>Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+young+normal+Sprague-Dawley+rats:+weight+gain,+hematology+and+clinical+chemistry.">Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).</li><li>Lin, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+lateral+hemisection+and+asymmetric+behavioral+assessments+in+adult+rats.">Spinal cord lateral hemisection and asymmetric behavioral assessments in adult rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e57126 (2020).</li><li>Tsehay, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+pulsed+ultrasound+neuromodulation+of+a+rodent's+spinal+cord+suppresses+motor+evoked+potentials.">Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. , (2023).</li><li>Payne, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging-guided+focused+ultrasound+to+increase+localized+blood-spinal+cord+barrier+permeability.">Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability.</a> Neural Regeneration Research. 12 (12), 2045-2049 (2017).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents.">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59295 (2019).</li><li>Sabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+the+blood-brain+barrier+using+low-intensity+pulsed+ultrasound+enhances+responses+to+immunotherapy+in+preclinical+glioma+models.">Opening of the blood-brain barrier using low-intensity pulsed ultrasound enhances responses to immunotherapy in preclinical glioma models.</a> Clinical Cancer Research. 27 (15), 4325-4337 (2021).</li><li>Dr&#233;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+blood-brain+barrier+disruption+by+low+intensity+pulsed+ultrasound+increases+carboplatin+delivery+and+efficacy+in+preclinical+models+of+glioblastoma.">Temporary blood-brain barrier disruption by low intensity pulsed ultrasound increases carboplatin delivery and efficacy in preclinical models of glioblastoma.</a> Journal of Neuro-Oncology. 144 (1), 33-41 (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Yamamoto, H., Imai, S., Okuyama, T., Tsubura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+lesions+in+rats+caused+by+intravenous+injection.">Pulmonary lesions in rats caused by intravenous injection.</a> Acta Pathologica Japonica. 32 (5), 741-747 (1982).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., M&#248;llg&#229;rd, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).</li><li>Mainprize, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+primary+brain+tumors+with+non-invasive+MR-guided+focused+ultrasound:+A+clinical+safety+and+feasibility+study.">Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study.</a> Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).</li><li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li></ol>

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt. Amir Manbachi underviser og konsulterer for BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, og er oppfinner på en rekke patentsøkte FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering fra NIH og er medeier for Accelerating Combination Therapies (inkludert egenkapital eller opsjoner). Ashvattha Therapeutics Inc. har også lisensiert et av patentene sine og er aksjonær for Peabody Pharmaceuticals. Nicholas Theodore mottar royalty fra og eier aksjer i Globus Medical. Han er konsulent for Globus Medical og har sittet i det vitenskapelige rådgivende styret/annet kontor for Globus Medical. De øvrige forfatterne har ingen interessekonflikt å opplyse.

Her beskrives utstyret og trinnene som kreves for effektiv og målrettet BSCB-forstyrrelse ved bruk av lavintensitetsfokusert ultralyd (LIFU) kombinert med mikroboble (MB) administrasjon. Denne protokollen er fleksibel og kan optimaliseres for individuell bruk med transdusere med varierende spesifikasjoner. Andre teknikker for LIFU-mediert BSCB-forstyrrelse er avhengige av bruk av magnetisk resonans imaging (MRI) -guidede systemer for mållokalisering, som er en kostbar ressurs16. Fordelene med teknikken som presenteres her ligger i den raske visuelle bekreftelsen i sanntid av BSCB-forstyrrelse og enkel målretting på grunn av prosedyrens åpne natur. Videre er laserapparatet enkelt å bruke og konstruere, og en CAD-fil er inkludert i tilleggsdelen. Som et resultat kan forskere som er interessert i å gjennomføre innledende tester på målrettingsegenskapene til deres LIFU-svinger i en liten dyremodell, bruke denne protokollen som et verktøy for raskt å bekrefte fokalsoneposisjonering over et sted av interesse. Denne teknikken kan også brukes av laboratorier som begynner å studere kliniske anvendelser av LIFU, for eksempel legemiddellevering, før de investerer i mer komplekse veiledningsmodaliteter som amerikanske eller MR-systemer. For tiden presenterer USA-guidede modaliteter en mer lovende og kostnadseffektiv vei sammenlignet med MR-systemer, selv om sistnevnte er hyppigere sett i litteraturen.

Det er flere kritiske trinn i denne prosedyren som må utføres nøye for å sikre vellykket BSCB-forstyrrelse. Det er viktig å unngå å legge unødvendig press på ryggmargen under kirurgisk laminektomi. For mye fysisk manipulering av ledningen øker sannsynligheten for skade på BSCB. Skader vises som en mørk brun flekk inne i ledningen etter ekstraksjon på grunn av blødning og økt EBD ekstravasasjon. Videre må det sikres maksimal kobling mellom transduser og eksponert ryggmarg. Som et resultat må det tas hensyn til å fjerne bobler fra vannkeglen og ultralydgelen. Det skal ikke være mellomrom mellom bunnen av vannkjeglen og ledningen for å sikre full overføring av den akustiske bølgen. Under hale venekateterisering, bør man unngå utilsiktet passerer luft sammen med heparinisert saltvann, EBD, eller MB løsninger. Injeksjon av luft øker sjansen for en lungeemboli som resulterer i gnagerdød før avslutningen av prosedyren28.
Et vanlig problem som kan oppstå under denne prosedyren er svikt i vellykket EBD-injeksjon. For personer med minimal erfaring i hale venekateterisering, utføre dette trinnet før dyr laminektomi, posisjonering, eller målretting vil spare tid. EBD kan også injiseres godt før MB-injeksjon uten å påvirke sonikering. Bruk av tourniquet og varmt vannbad foreslått i denne protokollen vil bidra til å utvide halen vener og øke suksessraten. Videre reduserer dehydrering av rotter sannsynligheten for riktig kateterplassering. En intraperitoneal saltvannsinjeksjon 10-15 minutter før halevenekateterisering kan hjelpe. Under kateteriseringen skal man starte 2 i over enden av halen og bevege seg i en kaudal til kranial retning. Å bevege seg i motsatt retning reduserer sannsynligheten for suksess på grunn av potensiell venekollaps eller blødning.
En annen vanlig utfordring innebærer mangelen på EBD ekstravasasjon til tross for sonikering. Dette kan tyde på at parametrene som brukes til sonikering er utilstrekkelige for BScb-forstyrrelser. For eksempel, hvis sonikeringsfrekvensen er satt til en verdi som i stor grad avviker fra transduserens sentralfrekvens, vil sonikeringseffekten være for lav til å svinge MB og forårsake tett kryssløsning. Videre vil jo flere grensesnitt mellom transduseren og ledningen (f.eks. Vannkegle, membran, gel, luftbobler i vann / gel), desto lavere vil den sanne sonikeringsintensiteten være på målet. Minimering av disse grensesnittene, for eksempel ved å bruke avgasset gel og grundig fjerne bobler inne i keglen, vil bidra til å overføre det fulle potensialet av sonikeringen. Protokollen oppfordrer også til å øke tiden mellom sonikering og perfusjon for å gi mer tid til EBD ekstravasasjon i spinal parenchyma. Selv om BSCB-forstyrrelser er en forbigående prosedyre, er hullene til stede i flere timer før lukking. Lang ventetid øker eksponeringen for isofluran men gir også større EBD-ekstravasasjon i navlesnoren. Alternativt kan EBD ekstravasasjon være tilstede til tross for ingen sonikering med LIFU. For å feilsøke dette problemet må det utvises forsiktighet under laminektomi for å forhindre utilsiktet skade på BSCB. Potensielle løsninger inkluderer å løfte rotteryggen under klemming for å øke mengden plass mellom laminae og ledning, samt en kortere laminektomi. En grundig PFA-perfusjon reduserer også bakgrunnsfarging ved å fjerne EBD-beriket blod fra vaskulaturen i ryggmargen. Under transkardial perfusjon må det utvises forsiktighet for å forhindre utilsiktet ruptur av hjertet, noe som kan føre til lekkasje av PBS eller PFA.
Det er viktig å merke seg at denne studien representerer en enkelt senteropplevelse for LIFU-mediert BSCB-forstyrrelse. Videre tester eller optimaliserer denne protokollen ikke forskjellige sonikeringsenergiparametere og MB-konsentrasjoner. Som et resultat oppfordres forskere til å undersøke ulike parametere og konsentrasjoner når de utfører denne teknikken for å optimalisere mållokalisering og BSCB-forstyrrelse for deres spesielle forskningsbehov, spesielt hvis de første resultatene gir noen bivirkninger. Grupper som ikke ønsker å se noen temperaturendringer, kan for eksempel teste ulike parametere til de finner et sett som oppfyller dette kriteriet og oppnår tilstrekkelig BSCB-forstyrrelse. Videre kan ytterligere eksperimenter utføres for å bekrefte sikkerheten til denne teknikken. For eksempel kan prøvestørrelser økes, overlevelsesperioden kan forlenges, og elektromyografi / ganganalysestudier kan utføres. For lengre overlevelse er det viktig å huske på at noen studier viser at høye doser EBD noen ganger kan forårsake kronisk systemisk toksisitet, så en lavere dose kan være forsvarlig29.
En annen begrensning av denne prosedyren er laminektomiens invasive natur (som kreves for enhver teknikk som bruker LIFU for BSCB-åpning, siden ultralyd ikke kan trenge gjennom bein). Den invasive karakteren av denne prosedyren kan reduseres ved å begrense lengden på laminektomi. Utføre laminektomi i øvre thoracic vertebrae, som er kortere og tynnere, kan redusere tiden som trengs for laminektomi til under 10 minutter. På grunn av MBs skjøre natur, så vel som deres korte halveringstid, er tiden begrenset under denne protokollen. Injeksjonen av MB bør skje 1-2 minutter før behandling med LIFU, og nye MB skal administreres før hver sonikering hvis flere LIFU-behandlinger utføres. For eksperimenter som involverer BSCB-forstyrrelser for flere rotter, kan det være nødvendig å forberede flere MB hetteglass. Siden mikrobobler er dyre, foretrekkes endring av kirurgisk arbeidsflyt for å minimere tiden mellom sonikeringer for å bevare antall MB som brukes.
Teknikken beskrevet her er først og fremst til bruk som forskningsprotokoll. Selv om lasermålrettingsapparatet ikke vil erstatte tradisjonelle målrettingsmodaliteter i alle kliniske innstillinger, kan det være nyttig i andre situasjoner. For ikke-invasive operasjoner kan tradisjonelle MR-modaliteter brukes pålitelig for å målrette30. For invasive operasjoner som inkluderer en laminektomi som utføres, kan laserpunktapparatet beskrevet i denne protokollen brukes til raskt å lokalisere sentrum av fokalsonen av sonikering over en bestemt region (for eksempel en svulst eller et sted for ryggmargsskade) med henblikk på legemiddellevering eller immunmodulerende terapi mens du supplerer MR-veiledning som ville finne sted.
Samlet sett beskriver denne protokollen en effektiv og vellykket teknikk for BSCB-forstyrrelse og inkluderer flere alternativer for bekreftelse av BSCB-åpningen, både i sanntid og etterbehandling. Med BSCB fungerer som en barriere for oppføring i ryggmargen parenchyma, er forstyrrelse av BSCB en mulig metode for å forbedre leveransen av terapeutika. For eksempel brukte Weber-Adrian et al. LIFU med en frekvens på 1.114 MHz og burstlengde på 10 ms for å formidle genlevering til cervical ryggraden6. Tilsvarende viste Smith et al. at LIFU med en frekvens på 580 kHz, gjennomsnittlig akustisk topptrykk rundt 0,46 MPa og en burstlengde på 10 ms kunne hjelpe til med levering av et monoklonalt antistoff, trastuzumab, til ryggmargen i en gnagermodell av leptomeningeale metastaser10. De fleste studier har fokusert på å bruke LIFU, snarere enn HIFU, på grunn av LIFUs evne til forbigående å permeabilisere BSCB samtidig som man unngår skade på det underliggende vevet. Vanligvis bruker LIFU intensiteter mellom 0,125-3 W / cm 2, mens HIFU bruker intensiteter fra 100-10 000 W / cm2 eller høyere31. Som et resultat utøver HIFU sine effekter primært gjennom oppvarmingsvev, mens LIFU, med samtidig administrering av MB, virker gjennom mekaniske kavitasjonseffekter. Samtidig administrering av legemidler med MB kan resultere i større ekstravasasjon av legemidlet i spinalparenkymet, samt potensialet til å laste MBs med legemiddel og lyse MBs med ultralyd for målrettet legemiddellevering.
Sonikeringsparametrene, MB-konsentrasjonen og typen transduser som brukes i denne studien, kan endres basert på eksperimentelle behov. For eksempel kan en svinger med et mindre fokusområde være å foretrekke for eksperimenter der større kontroll er nødvendig over lokalisert målretting, mens en svinger med høyere effekt kan brukes til eksperimenter som krever kraftig forstyrrelse på kortere tid. På grunn av fleksibiliteten som tilbys av denne protokollen, er det stort potensial for bruk i preklinisk, klinisk og translasjonsforskning.

I likhet med blod-hjernebarrieren (BBB) regulerer blod-ryggmargsbarrieren (BSCB) bevegelsen av sirkulerende løsemidler, celler og plasmakomponenter i spinalparenkymet1. Denne beskyttende egenskapen er resultatet av et spesialisert system av tett bundne, ikke-fenestrerte endotelceller som fôrer ryggkapillærene2. Vanligvis kan bare lipofile molekyler med lav vekt med positiv ladning krysse begge barrierer3. Til tross for studier som tyder på at BSCB har litt høyere permeabilitet enn BBB, begrenser begge barrierer levering av terapeutika til sentralnervesystemet4. Flere strategier er utviklet for å øke transporten av legemidler over BSCB, inkludert teknikker for å øke osmotisk trykk i ryggradskapillærene, utvikling av legemidler som interagerer med bradykininreseptorer og opprettelsen av funksjonaliserte nanopartikler5.
BScb forstyrrelse kan også oppnås via intravenøs administrering av mikrobobler (MB) etterfulgt av lav intensitet fokusert ultralyd (LIFU) sonikering6. Det akustiske feltet som genereres av ultralydtransduseren forårsaker MB-svingninger, som igjen påfører spenning mot endotelveggen og løsner tette kryss7. Den stramme koblingen skaper forbigående hull i kapillærene, slik at terapeutika kan trenge inn i spinalparenkymet (figur 1). Denne prosessen kan også skape transendoteliale fenestrasjoner, øke transcytose og nedregulere ATP-bindende kassetttransportører, for eksempel P-glykoprotein 8,9. En viktig fordel ved denne teknikken er evnen til å minimere off-target effekter ved å lede fokalområdet av sonikering til stedet av interesse i ryggmargen. Flere kliniske studier har undersøkt effekten av LIFU-mediert BBB-åpning for behandling av patologier i sentralnervesystemet, inkludert gliomer, amyotrofisk lateralsklerose, Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom. Selv om LIFU-mediert BSCB-forstyrrelse ikke er så omfattende karakterisert som LIFU-mediert BBB-forstyrrelse, har flere grupper rapportert vellykket BSCB-forstyrrelse i gnager-, kanin- og svinemodeller10,11,12. Samlet sett er interessen for teknikken raskt voksende, spesielt som en levedyktig avenue for narkotika levering.
I denne protokollen beskrives en teknikk for LIFU-mediert BSCB-forstyrrelse i en rottemodell. Prosedyren inkluderer detaljerte beskrivelser av dyreforberedelse, oppsett av LIFU-utstyr, MB-administrasjon, mållokalisering og ryggmargsekstraksjon. Bekreftelse av mållokalisering og BSCB-forstyrrelse evalueres via Evans blå fargestoff (EBD) ekstravasasjon i ryggmargen. EBD er en ikke-toksisk forbindelse som binder seg til serumalbumin og kan identifiseres ved sin rike blå farge visuelt og rød autofluorescens under mikroskopi13.
Trinnene som er oppført her, tilbyr et raskt og rimelig alternativ til tradisjonelle ultralyd (US) eller magnetisk resonans (MR) -guidede LIFU-systemer. Som et resultat er denne metoden nyttig for forskere som er interessert i raskt å teste og bekrefte målrettings- og BSCB-forstyrrelsesevnen til deres LIFU-transduser før de anskaffer tilleggsutstyr og materialer eller forfølger LIFU-applikasjoner i ryggmargen, for eksempel legemiddellevering, immunmodulering og nevromodulering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Heparinized Sodium Chloride</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FKB0953G</td>
			<td>Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL Luer Lock Tip Syringe (2)</td>
			<td>Wilburn Medical</td>
			<td>WUSA/120</td>
			<td>One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10010001</td>
			<td>For transcardial perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G catheter</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>50-209-1694</td>
			<td>Use to place a tail vein catheter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>97% Isoflurane</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>247-897-7</td>
			<td>While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 7.5%</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>4677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class A clear threaded glass vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-314</td>
			<td>Use to store spinal cord extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital balance scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Wahl Home Products</td>
			<td>79449-200</td>
			<td>Shave fur off skin at incision site before surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>71304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>02151108-CF</td>
			<td>Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps</td>
			<td>PSI Impactors</td>
			<td>7001-2</td>
			<td>Affix the stereotactic arm to this frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>7211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors with Angled Blades</td>
			<td>ProDentUSA</td>
			<td>12-15315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction system&#160;&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-RATKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser targetting apparatus</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom</td>
			<td>CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating eye ointment</td>
			<td>Systane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 3-Way Stopcock</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAS7521-10EA</td>
			<td>Can use to fill water cone through inlet valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumason microbubbles kit</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>0270-7099-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>23-900-671&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-2000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar membrane</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>3016</td>
			<td>Can cut membrane to appropriate size if too large for cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroFUS 2.52&#34; diameter 250 kHz transducer</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>CTX-250</td>
			<td>Transducer system includes custom water cone and probe holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroFUS PRO v2.0 system</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>NFS102v2</td>
			<td>Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Offset Bone Nippers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16101-10</td>
			<td>Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24364-1&#160;</td>
			<td>Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J61899-AK</td>
			<td>For transcardial perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Surgical Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSRATKIT</td>
			<td>Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal thermometer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RET-2</td>
			<td>Maintain rat temperature between 35.9&#8211;37.5 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>50-205-1983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single animal vaporizer unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic arm</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorbent pad</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Aquasonic</td>
			<td>PLI 01-34</td>
			<td>Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disruption of the blood-spinal cord barrier using low-intensity focused ultrasound in a rat model

Lavintensitetsfokusert ultralyd (LIFU) bruker ultralydpulsasjoner ved lavere intensiteter enn ultralyd og testes som en reversibel og presis nevromodulerende teknologi. Selv om åpningen av LIFU-mediert blod-hjernebarriere (BBB) har blitt utforsket i detalj, er det hittil ikke etablert noen standardisert teknikk for åpning av blodryggmargsbarriere (BSCB). Derfor presenterer denne protokollen en metode for vellykket BSCB-forstyrrelse ved bruk av LIFU-sonikering i en rottemodell, inkludert beskrivelser av dyrepreparasjon, mikrobobleadministrasjon, målvalg og lokalisering, samt BSCB-forstyrrelsesvisualisering og bekreftelse. Tilnærmingen som er rapportert her, er spesielt nyttig for forskere som trenger en rask og kostnadseffektiv metode for å teste og bekrefte mållokalisering og presis BSCB-forstyrrelse i en liten dyremodell med en fokusert ultralydtransduser, evaluere BSCB-effekten av sonikeringsparametere, eller utforske applikasjoner for LIFU i ryggmargen, for eksempel legemiddellevering, immunmodulering og nevromodulering. Det anbefales å optimalisere denne protokollen for individuell bruk, spesielt for å fremme fremtidig preklinisk, klinisk og translasjonsarbeid.

Dette papiret viser at samtidig bruk av LIFU sonikering og MB-administrasjon er en effektiv teknikk for lokalisert BSCB-forstyrrelse. Åpningen av BSCB indikeres av tilstedeværelsen av EBD-ekstravasasjon i spinalparenkymet. Endringene er tydelige både visuelt og under fluorescensmikroskopi. Ryggmargsvaskulaturen er synlig etter laminektomi og viser bakre spinalvene med flere mindre kar som stråler ut lateralt (figur 4A). Intravenøs injeksjon av EBD gjennom halevenekateteret fører til at denne vaskulaturen blir beriket med blått fargestoff (figur 4B). Dette er et godt punkt i prosedyren for å verifisere at laminektomi ikke resulterte i brudd på noen spinal vaskulatur, da dette ville resultere i at blått blod samlet seg over navlesnoren. Etter sonikering bør et blått flekk bli synlig over det målrettede stedet, noe som indikerer ekstravasasjon av EBD i den hvite parenchymen på grunn av BSCB-forstyrrelser (figur 4C). Størrelsen på dette stedet varierer basert på en rekke faktorer, inkludert størrelsen på transduserens fokalområde og hvor lang tid etter sonikering. For å øke sjansene for å se EBD ekstravasasjon, bør man forlenge tiden mellom sonikering og ryggmargsekstraksjon.
Selv om PFA-perfusjon ikke er et nødvendig trinn å utføre før ledningsekstraksjon og påfølgende vevsanalyse, fjerner det blod fra prøven og øker kontrasten mellom den hvite spinalparenkymen og de blå EBD-fargede områdene. Alle rotter som fikk MB-administrasjon og LIFU-sonikering viser tilsynelatende ekstravasasjon av EBD i ryggmargen, mens negative kontroller som mottok MB og EBD uten LIFU-sonikering, ikke gjør det. Representative bilder er vist i figur 5. Sagittale kutt gjennom vevet avslører at EBD-ekstravasasjonen ikke bare er overfladisk, men strekker seg godt inn i selve navlesnoren. Dette forventes, siden fokalområdet til transduseren som brukes i denne studien er større enn diameteren på rotte ryggmargen. Noen ganger kan små mengder blødning ses i sagittal kutt. Dette kan skyldes laminektomi eller ultralyd sonikering. Hvis blødningen er nær ledningens dorsale periferi, er det mer sannsynlig på grunn av laminektomi.
For ytterligere å evaluere EBD-ekstravasasjon ble sagittale ryggmargssnitt farget med DAPI (nukleær markør) og avbildet med fluorescerende mikroskop. Alle ledninger som mottok LIFU-sonikering (n = 3) viste en signifikant større intensitet av EBD-autofluorescens (p = 0, 016) enn ledninger som ikke mottok sonikering, med tilsvarende intensiteter av DAPI tilstede i begge (figur 6). H &E-analyse avslørte videre ingen nevronskader, blødninger eller hulromslesjoner tilstede i sonikerte steder, noe som støtter sikkerheten til denne prosedyren. Eksempler på skadede ledninger på grunn av kirurgisk mishandling og en kraftig sonikering er vist som en sammenligning. Blødning, vevskader, hulromsskader og mulig vakuolisering er merket. Selv om det kraftige sonikeringseksemplet ikke viser blødning, har dette også blitt rapportert som en effekt av ultralydforstyrrelser.
Videre ble atferdsanalyse utført på rotter som fikk MB, EBD og LIFU sonikering. Selv om denne metoden ikke helt utelukker vevskader, tester den om motoriske underskudd oppstod på grunn av denne prosedyren. Rotter ble registrert gående i bur i 5 min hver dag over en periode på 5 dager, og bevegelsesfunksjonen ble gradert basert på Basso Beattie Bresnahan lokomotorisk skala (Supplemental Video File 1). Alle rotter (n = 5) fikk høyeste poengsum før sonikering, postsonikering og hver dag i overlevelsesperioden (figur 7).
Endelig ble de termiske effektene av sonikeringsparametrene som ble brukt i denne studien målt ved hjelp av to ex vivo rotte ryggmargsprøver og en digital termometersonde med en fin spiss satt inn i ledningen.  Temperaturen på ryggmargsprøvene ble sporet i 5 minutter før, under og etter sonikering, i totalt 15 minutter. Minimale temperaturendringer ble sett. Faktisk var det ≤1,3 ° C endring på grunn av sonikering i begge prøvene, noe som reduserte sannsynligheten for hypertermisk skade som følge av sonikering (figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig01.jpg"> Figur 1: Lavintensitetsfokusert ultralydmediert blod-ryggmargsbarriereåpningsmekanisme . (A) Skjematisk oversikt over lavintensitetsfokusert ultralyd (LIFU) sonikering av rotte ryggmargen. (B) Mekanismen for blod-ryggmargsbarriere (BSCB) åpning via LIFU sonikering av intravenøse mikrobobler (MB). MB svinger som respons på LIFU, noe som forårsaker utvidelse av tette kryss mellom endotelceller. Denne forstyrrelsen av BSCB tillater ekstravasasjon av nanopartikler, terapeutiske legemidler eller Evans blåfargestoff. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig02.jpg"> Figur 2: Lavintensitetsfokusert ultralyd benchtop-oppsett og tilkobling. (A) Skjematisk fremstilling som viser typiske fokuserte ultralydkomponenter. (B) Oversiktsbilde av det fokuserte ultralydoppsettet, inkludert: 1. transdusereffekt (TPO), 2. matchende nettverk, 3. LIFU-svinger, 4. Det stereotaktiske instrumentet, 5. mobile klemmer. (C) Svinger, inkludert: 1. sondeholder, 2. ringtransduser, 3. vannkjegle, 4. vanninnløpsrør, 5. vannutløpsrør, 6. membran festet med en gummistrikk. (D) Forsiden av TPO, inkludert: 1. RF-skjermet kabinett, 2. berøringsfølsomt frontdisplaypanel med justerbar meny, 3. roterende knapp for parameterjustering, 4. Start / stopp utgangsbryter. (E) Baksiden av TPO, inkludert: 1. kanalutgangskontakter, 2. bakken, 3. USB-inngangsport for programvarekontroll, 4. intern utløser, 5. Synkroniser utgangskontakt, 6. Strøminngangskontakt og forsyning, 7. På / av strømbryter. (F) Matchende nettverksutgang, med ledninger som samsvarer med kanalnumre. (G) Matchende nettverks-XDR-inngang, med ledninger som samsvarer med kanalnumre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig03.jpg"> Figur 3: Mållokalisering med laserveiledning . (A) Stereotaktisk arm med bevegelsesområde i alle tre akser og rotasjonsmuligheter. Den er festet til fikseringsplaten under. (B) Laserapparat for identifisering av brennsonen. Laseren er plassert på tuppen av svingeren og er på linje med fokalområdet. (C) Illustrasjon som viser laseren på den eksponerte ryggmargen, som indikerer at transduserens fokale region nå er rettet mot dette stedet. (D) Transduseren senkes til spissen av kjeglen er plassert 1 cm over ledningen, og gapet er fylt med gel for å sikre maksimal kobling. Avstanden fra transduseren til ryggmargen er 40 mm (brennvidde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig04.jpg"> Figur 4: Evans blå fargestoff ekstravasasjon i ryggmargen post-sonication . (A) Bilde av T9-T11 laminektomisnitt fra rotter, med den eksponerte ryggmargen og bakre dorsale vene godt synlig. (B) Det omkringliggende vevet og ryggmargsvaskulaturen blir blå etter intravenøs injeksjon av Evans blått fargestoff (EBD). (C) EBD ekstravasasjon i ryggmargen parenchyma på stedet for sonikering, noe som indikerer BSCB forstyrrelse har oppstått. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig05.jpg"> Figur 5: Ryggmargsekstraksjon og visualisering av BSCB-åpning etter perfusjon. (A) Utskåret ryggmarg fra kontrollrotte uten LIFU-behandling. Denne rotta fikk bare MB og EBD. Midtsagittal bit av navlesnoren innebygd i parafin er vist innfelt, og ingen EBD-ekstravasasjon er synlig. (B) Utskåret ryggmarg fra rotte med LIFU-behandling. Denne rotta fikk også MB og EBD. Kolonnen av EBD ekstravasasjon er synlig og lokalisert til sonikert region. Midt-sagittal skive av ledningen innebygd i paraffin er vist i innsatsen, med en pil som peker på EBD-konsentrasjonen synlig inne i sonikert sted. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig06.jpg"> Figur 6: Deteksjon og evaluering av BSCB-åpning. (A) Ryggmargen farget med DAPI (nukleær markør, blå). Minimal EBD autofluorescens (rød) er synlig. Denne rotta fikk ikke LIFU. (B) Ryggmargen farget med DAPI (nukleær markør, blå). Lokalisert EBD-autofluorescens (rød) ved sonikert målplassering er synlig. Denne rotta fikk LIFU og MB. (C) Ryggmargen til en rotte uten LIFU farget med hematoksylin (nukleinsyreflekk) og eosin (uspesifikk proteinflekk) (H&E). Ingen nevronskader, blødninger eller hulromsskader er synlige. (D) Ryggmargen til en rotte med LIFU farget med H&E. Ingen nevronskader, blødninger eller hulromslesjoner er synlige. (E) Ryggmargen til en rotte med kirurgisk skade farget med H &E. Pilene peker på rikelig blødning og vevskader. (F) Ryggmargen til en rotte med skade på grunn av høy effekt sonikering farget med H &E. Pilene peker på hulromsskader, og innsatsen viser mulig vakuolisering. (G) Bargrafer som viser intensiteten av DAPI og EBD i ryggmargen av rotter med og uten LIFU sonikering. Det er signifikant høyere EBD-intensitet i LIFU-ryggmargen sammenlignet med negativ kontroll (p = 0,016), til tross for tilsvarende DAPI-intensitet (p > 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig07.jpg"> Figur 7: Behavioral assay pre- og post-sonication . (A) Basso, Beattie, Bresnahan apparatoppsett, hvor rotter ble registrert gående i 5 minutter nedenfra. (B) Stillbilde fra en innspilt video. Denne videoen ble brukt til å rangere rottens motoriske koordinasjon og gang på Basso, Beattie, Bresnahan-skalaen. (C) Boxplot (n = 5) viser ingen endring i motor score pre-sonication, post-sonication, eller i løpet av en 5-dagers overlevelsesperiode hos rotter som fikk MB og LIFU behandling (p > 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig08.jpg"> Figur 8: Temperaturanalyse med ex vivo ryggmarg. Graf som viser temperaturendringer i to ex vivo ryggmargsprøver for en 5 min pre-, under- og post-sonikering varighet. Parametrene som brukes til sonikering er oppført i tabell 1. For prøve 1 var gjennomsnittstemperaturene før , under og etter sonikering henholdsvis 21,9 ° C ± 0,1 ° C, 22,1 ° C ± 0,1 ° C og 22,0 ° C ± 0,1 ° C. For prøve 2 var temperaturene før, under og etter sonikering henholdsvis 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C og 22,4 °C ± 0,2 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfigur 1: CAD-fil av lasermålrettingsapparat. (A) Utsikt over laserapparatet nedenfra. Enhver laser kan plasseres i det sentrale hullet i midten. (B) Lateral visning av laserapparatet. (C) Dimensjoner på laserapparatet, med enheter i tommer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende videofil 1: Video av en rotte som går i Basso, Beattie, Bresnahan-apparatet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/Supplemental%20File%202%20Low%20Res.mov" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Forstyrrelse av blod-ryggmargsbarrieren (BSCB) kan oppnås med intravenøs administrering av mikrobobler og anvendelse av lavintensitetsfokusert ultralyd (LIFU). Denne protokollen beskriver åpningen av BSCB ved bruk av LIFU i en gnagermodell, inkludert utstyrsoppsett, mikrobobleinjeksjon, mållokalisering og BSCB-forstyrrelsesvisualisering.

Forstyrrelse av blod-ryggmargsbarrieren ved bruk av lavintensitetsfokusert ultralyd i en rottemodell

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

Blod-ryggmargsbarrieren er tett bundet og har begrenset permeabilitet. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å trygt og forbigående åpne blodryggmargsbarrieren, ved hjelp av mikrobobler og fokusert ultralyd. Denne teknikken gjør at blod-ryggmargsbarriereåpningen kan lokaliseres til det målrettede ryggmargssegmentet.I tillegg kan forstyrrelsen enkelt bekreftes via visuell observasjon eller fluorescerende mikroskopi. Denne protokollen kan utforskes for sitt potensial i å forbedre levering av genterapier, eller legemidler til ryggmargen for behandling av svulster, atrofi eller skade. Demonstrere prosedyren vil være Meghana Bhimreddy.En fantastisk MD-student fra laboratoriet mitt, som daglig bygger bro over gapet mellom ingeniørfag og medisin. For å begynne, skaff deg et fokusert ultralydtransdusersystem med spesifikasjoner som er tilstrekkelige til å oppnå blodryggmargsbarriere, eller BSCB-åpninger hos rotter. Fest den 3D-printede sondeholderen og vannkjeglen på svingeren.Sørg for at det er en vanntett forsegling mellom kjeglen og svingeren. Fest den steriliserte, 50 mikron tykke, akustisk gjennomsiktige polyestermembranen til bunnen av vannkeglen ved hjelp av et gummibånd. Fyll vannkjeglen med avgasset og avionisert vann ved hjelp av innløps- og utløpsrørene.Unngå luftbobler inne i kjeglen, da de kan forstyrre akustisk kobling mellom svingeren og målet. På dette stadiet bør Mylarmembranen være litt oppblåst. Koble drivutstyret som inneholder bølgegeneratoren og radiofrekvensforsterkeren til svingeren.Fest den stereotaktiske armen til fikseringsplaten og fest sondeholderen til armen. Registrer vekten av en bedøvet Sprague-Dawley hunnrotte, og utfør en tå- og haleklypetest for å bekrefte anestesien. Plasser en varmepute og en steril absorberende pute på fikseringsplaten.Plasser rotta på den absorberende puten. Påfør øyesalve og plasser et rektalt termometer for å overvåke kroppstemperaturen. Palpere den siste ribben av rotta, som er festet til ryggraden ved den 13.Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere pelsen av ryggflaten mellom den siste ribben og nakken. Tørk den eksponerte huden med gasbind dyppet i 10% iodopovidon. Lag et midtlinjesnitt ved hjelp av irissaks og dissekere gjennom fascia til de spinøse prosessene og lamina blir eksponert.Fjern beinet med offset bone nippers og vinklet blad iris saks, til ryggmargen er utsatt. Fest rotta til fikseringsplaten ved å klemme de spinøse prosessene ved siden av laminektomi. Trekk deretter litt i klemmene for å gjøre ryggraden stram.Juster transduserens posisjon med den stereotaktiske armen til den ligger nøyaktig over laminektomi. Fest laserapparatet til bunnen av vannkjeglen og senk det til laserpunktet er synlig. Juster deretter sideposisjonen til transduseren til laserpunktet er over målstedet for BSCC-forstyrrelser.Fjern laserapparatet og fyll mellomrommet mellom kjeglen og ryggmargen med avgasset ultralydgel, uten å innføre luftbobler. Sett parametrene for sonikering på transdusereffekten. Forbered en mikrobobleløsning i henhold til produsentens instruksjoner.For å øke sjansene for vellykket hale venekateterisering, dypp halen i varmt vann og plasser en turniquet ved foten av halen for å forstørre venene diameter. Sett deretter inn et 22 gauge hale venekateter og skyll med 0,2 ml heparinisert saltvann. Injiser en milliliter per kilo 3% Evans Blue Dye, eller EBD inn i kateteret.Skyll deretter kateteret med 0,2 ml heparinisert saltvann. Bekreft vellykket hale venekateterisering ved å sjekke for blå fargeendring i hud, øyne eller dorsal spinal vene av rotte. Injiser 0,2 ml bolus av mikrobobler i kateteret og skyll med heparinisert saltoppløsning før du starter sonikeringen.Etter å ha avlivet rotten, fjern ryggmargen og legg den i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius over natten. Neste dag erstattes paraformaldehydet med PBS. For å visualisere BSCB-forstyrrelser, isoler en to centimeter seksjon som omgir plasseringen av sonikering, ved hjelp av et barberblad.Del seksjonen i 10 mikron tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotome og flekk med hematoksylindeosinflekk. For fluorescensmikroskopi, deparaffiniser lysbildet som inneholder ryggmargsseksjonen, og motflekk med 25 mikroliter DAPI oppløst i monteringsmediet. Inkuber seksjonene ved fire grader celsius i 10 minutter i mørket for å forhindre bleking.Etter inkubering, bruk et fluorescerende mikroskop for å avbilde alle lysbildene. Bilde hematoksylin- og eosinfarget lysbilde ved hjelp av et lysmikroskop. Ryggmargsvaskulaturen er synlig etter laminektomi, og viser bakre spinalåre, med flere mindre kar som stråler lateralt.Etter intravenøs injeksjon av EBD fremsto omkringliggende vev og ryggmargsvaskulatur som blå. Etter sonikering blir en blå flekk synlig over det målrettede stedet, noe som indikerer ekstravasasjon av EBD i den hvite parenchymen på grunn av BScb-forstyrrelse. Utskåret ryggmarg fra rotter med lav intensitet fokusert ultralyd, eller LIFU sonikering, bekreftet tilsynelatende ekstravasasjon av EBD i ryggmargen.Mens negativt kontrollerte rotter uten LIFU-behandling ikke viste ekstravasasjon av EBD. Ryggmargen med LIFU sonikering viste betydelig større intensitet av EBD autofluorescens, enn ledninger som ikke mottok sonikering. Med lignende intensiteter av DAPI tilstede i begge.Hematoksylin- og eosinanalyse viste ingen nevronskader, blødninger eller hulromslesjoner i sonikerte steder. Eksempler på skadede ledninger på grunn av kirurgisk mishandling, og høy drevet sonikering er vist som en sammenligning. Hos rotter som fikk mikrobobler og LIFU-behandling, ble det ikke observert noen endring i motorpoeng, presonikering, postsonikering og i løpet av en fem dagers overlevelsesperiode.Minimale endringer i ryggmargstemperaturen ble observert før, under og etter sonikasjonsanalyse. Det er viktig å begrense kirurgisk skade på ledningen under laminektomi. Visualisering av H- og E-fargede seksjoner med mikroskopi, vil indikere om det har oppstått skade.Etter blod-ryggmargsbarriereforstyrrelser, ved hjelp av fokus ultralyd, kan dyr injiseres med antineoplastiske midler, eller genterapier. Utfallet vil avgjøre om denne teknikken kan forbedre levering av terapeutika, og forlenge overlevelsen i innstillingen av ryggmargspatologi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Induksjon av adhesjonsmolekylhemmer avhengige signaler ved hjelp Lav-intensitet ultralyd

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensing of Barrier vevsdesintegrasjon med en organisk Elektrokjemisk Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Sanntidsovervåking av High Intensity fokusert ultralyd (HIFU) Ablation av<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Bruke Harmonic Motion Imaging for fokusert ultralyd (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Trening Personer med ryggmargsskade å ambulerer Ved hjelp av en motorisert Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeasjon av FITC-lastet Ferritins over en rotte blod-hjerne-barrieren: en modell for å studere den Levering av Nanoformulated Molekyler

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Riktig posisjonering og beherskelse av en rotte Hind lem ved fokusert høyoppløselig avbildning av bein mikroarkitektur bruker i Vivo mikro-beregnet tomografi

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...