Name: disruption of the blood-spinal cord barrier using low-intensity focused ultrasound in a rat model
Uploaded: 2023-03-10T14:15:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

Apoiado por T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 e R01 HL071568-15 (N.V.T.); Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (A.M). Várias figuras criadas com BioRender.com.

Todos os estudos em animais foram aprovados e conduzidos de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC RA20M223). Apenas ratas adultas da raça Sprague-Dawley (peso médio: 250 g; idade: 11 semanas) foram utilizadas para o presente estudo.
1. Montagem e configuração de ultrassom focado de baixa intensidade
<ol><li>Adquira um sistema de transdutor de ultrassom focalizado com especificações suficientes para conseguir a abertura do BSCB em ratos. Os parâmetros sugeridos pela literatura incluem uma frequência central entre 0,25-4 MHz e a capacidade de produzir picos de pressão entre 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17. Certifique-se de que o sistema inclui o equipamento de condução/controle, que inclui, no mínimo, um gerador de onda/sinal, acionamento de radiofrequência (RF)/amplificador de potência e rede correspondente (Figura 2A). NOTA: A configuração descrita aqui usa um transdutor multielemento disponível comercialmente com uma frequência central de 250 kHz e 64 mm de diâmetro (Figura 2B).</li>
	<li>Afixar o suporte da sonda impresso em 3D e o cone de água no transdutor (Figura 2C). Certifique-se de uma vedação estanque entre o cone e o transdutor. NOTA: Um cone personalizado e um suporte de sonda vieram incluídos com o transdutor usado neste experimento. O suporte do cone e da sonda são fixados no transdutor com parafusos, que também são fornecidos.</li>
	<li>Esterilizar uma membrana de poliéster acusticamente transparente de 50 μm de espessura e afixar no fundo do cone de água usando um elástico.</li>
	<li>Encha o cone de água com água desgaseificada e deionizada usando os tubos de entrada e saída. Tome cuidado para evitar bolhas de ar dentro do cone, pois elas podem interromper o acoplamento acústico entre o transdutor e o alvo. A membrana de poliéster deve ser ligeiramente inflada. NOTA: Para remover as bolhas de ar do cone, guie as bolhas para a válvula de saída enquanto enche o cone com água através da válvula de entrada. Se muitas bolhas pequenas estiverem presentes, feche todas as válvulas e gire o cone até que uma grande bolha permaneça. Guie esta bolha até a válvula de saída e retome o enchimento do cone.</li>
	<li>Conecte o equipamento de acionamento, que inclui o gerador de ondas e o amplificador de acionamento de RF, ao transdutor. O cabo do transdutor se conectará ao lado de saída da rede correspondente, e o gerador de sinal/amplificador de potência se conectará ao lado de entrada da rede correspondente. Os cabos devem ser conectados ao número de canal correspondente (Figura 2D-G). OBS: No sistema comercial utilizado neste estudo, o gerador de ondas e o amplificador de acionamento de RF são componentes da potência de saída do transdutor (TPO) (Figura 2D).</li>
	<li>Conecte o suporte da sonda ao braço estereotáxico. Afixe o braço estereotáxico no conjunto da placa de fixação. Isso permitirá que o transdutor seja posicionado precisamente acima do roedor durante a sonicação.</li>
</ol>2. Preparo dos animais e laminectomia cirúrgica
<ol><li>Anestesiar o rato com uma mistura de isoflurano e ar medicinal em uma câmara de indução acoplada a um recipiente de filtro de carvão. Ajuste o fluxo de gás para 400 mL/min e o vaporizador de isoflurano entre 1,5%-2,5% para indução anestésica. A quantidade de tempo gasto na câmara antes da sedação completa é variável, embora normalmente varie de 3-6 min.</li>
	<li>Registre o peso do rato sedado e realize um teste de pinça dos dedos. Se forem observados movimentos ou movimentos em resposta ao aperto, coloque o rato de volta dentro da câmara de indução por mais 1 min e repita o teste de pinça dos dedos. Repita conforme necessário para garantir que o rato esteja e permaneça totalmente anestesiado.</li>
	<li>Coloque uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente estéril na placa de fixação. Posicione o rato sobre a almofada absorvente, aplique pomada ocular e coloque um termômetro retal para monitorar a temperatura corporal. OBS: Durante a duração do procedimento cirúrgico, a temperatura e a frequência cardíaca do rato devem ser monitoradas (idealmente, a frequência cardíaca deve estar entre 330-480 bpm e a temperatura entre 35,9-37,5 °C)18,19. Ajuste o isoflurano ou a almofada de aquecimento em conformidade para evitar a morte prematura. A almofada de aquecimento pode ser ajustada para uma temperatura em torno de 37 °C e deve ser ligada e desligada conforme necessário para manter a temperatura corporal ideal.</li>
	<li>Palpar a última costela do rato, que está aderida à coluna vertebral na13ª vértebra torácica (T13). Use uma navalha elétrica para raspar o pelo da superfície dorsal entre a última costela e o pescoço. Limpe a pele exposta com gaze mergulhada em iodopovidona a 10%.</li>
	<li>Criar uma incisão mediana com tesoura de íris e dissecar através da fáscia até que os processos espinhosos e a lâmina estejam expostos. Remover osso com pinças ósseas offset e tesoura de íris com lâmina angulada até que a medula espinhal fique exposta20. A duração da laminectomia e da incisão varia de acordo com o número de diferentes alvos a serem sonicados. Neste estudo, foi realizada laminectomia em três níveis com incisão de 3 cm. NOTA: Evite tocar ou colocar pressão na medula espinhal ao remover o osso para evitar lesões. Se os membros posteriores do rato tremerem durante a laminectomia, então muita força foi usada no cordão ou nas raízes nervosas.</li>
	<li>Fixe o rato à placa de fixação apertando os processos espinhosos adjacentes à laminectomia. Puxe levemente a coluna para minimizar a curvatura antes de travar as pinças.</li>
</ol>3. Localização do alvo usando orientação a laser
<ol><li>Ajustar a posição do transdutor com o braço estereotáxico até que este se localize exatamente acima da laminectomia (Figura 3A). O quadro permite movimento nos eixos x, y e z, bem como rotação de 180° no plano vertical e rotação de 360° no plano horizontal.</li>
	<li>Afixar o aparelho laser no fundo do cone de água e baixá-lo até que o ponto laser esteja visível. Ajustar a posição lateral do transdutor até que o ponto laser esteja acima do local alvo de ruptura do BSCB (Figura 3B,C). NOTA: Um arquivo CAD (computer-aided design) para o aparelho a laser está incluído na seção suplementar (Figura suplementar 1).</li>
	<li>Remova o aparelho de laser e preencha o espaço entre o cone e a medula espinhal com gel de ultrassom desgaseificado (Figura 3D). Para um acoplamento máximo, certifique-se de que não existem bolhas de ar no gel. OBS: Neste estudo, o transdutor com cone de água afixado foi abaixado até ficar 1 cm acima do cordão. Como o cone de água tinha 30 mm de comprimento, a distância total do transdutor ao cordão era de 40 mm. O cone de água foi colocado a 1 cm de distância da medula espinhal porque a pele, a fáscia e a musculatura do rato em ambos os lados da incisão impedem o contato direto entre a ponta do cone e a medula. Usar os números no eixo y do braço estereotáxico pode ser útil para manter o controle da distância vertical em que o cone está a 1 cm de distância do cordão, especialmente porque o gel dificultará a confirmação visual da distância do cone em relação ao cordão.</li>
	<li>Defina os parâmetros para sonicação no TPO. Uma gama de valores pode ser usada para alcançar uma interrupção bem-sucedida do BSCB. Para potência máxima, ajuste a frequência de sonicação próxima à frequência central do transdutor. Os valores utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1. NOTA: Os parâmetros aqui listados foram adaptados de trabalhos anteriores com LIFU, com frequência central de 500 kHz, duração de tone burst de 500 μs, ciclo de trabalho de 50% e tempos de sonicação de 5 ou 10 min para neuromodular com segurança a medula espinhal de roedores21. Com base em estudos que obtiveram sucesso na ruptura do BSCB, outros parâmetros que podem ser utilizados são frequências centrais entre 500 kHz-1 MHz, pressões de 0,2-2,1 MPa, comprimentos de burst de 10-25 ms e tempos de sonicação de 2-5 min 6,10,11,22.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parâmetro</td>
			<td>Valor</td>
		</tr><tr><td>Frequência (kHz)</td>
			<td>250</td>
		</tr><tr><td>Distância de foco (mm)</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>Pressão de Pico Acústico (MPa)</td>
			<td>0.47</td>
		</tr><tr><td>Ciclo de trabalho</td>
			<td>40%</td>
		</tr><tr><td>Comprimento de intermitência (ms)</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>Período(s)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Tempo de Sonicação (min)</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Parâmetros de sonicação usados para interrupção do BSCB.
4. Administração de microbolhas
<ol><li>Preparar uma solução MB de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Evite introduzir ar na solução. NOTA: Os MBs são frágeis e amontoam-se perto da parte superior do frasco para injetáveis/seringa se forem deixados parados durante alguns minutos. Agite o frasco para injetáveis e a seringa regularmente para evitar uma dispersão irregular de MBs. MBs têm vida útil curta; Verifique o guia do fabricante para determinar o tempo de expiração.</li>
	<li>Inserir cateter venoso caudal 22G e lavar com 0,2 mL de solução salina heparinizada (500 UI/mL)23. Para aumentar as chances de sucesso do cateterismo da veia caudal, mergulhe a cauda em água morna e coloque um torniquete na base da cauda para aumentar o diâmetro da veia. NOTA: O cateterismo da veia caudal pode ser realizado antes da laminectomia do animal, posicionamento e direcionamento para economizar tempo de estudo.</li>
	<li>Injetar 1 mL/kg de EBD a 3% no cateter. Lave com 0,2 mL de solução salina heparinizada. As extremidades e os olhos do rato ficarão azuis. Confirmar o sucesso do cateterismo da veia caudal verificando se há alteração na cor azul na veia espinhal dorsal do rato (Figura 4). NOTA: EBD pode ser injetado bem antes da injeção de MB e não influenciará a sonicação. Além disso, como a Food and Drug Administration (FDA) atualmente não aprovou a sonicação com medicamentos já no sistema, a EBD também pode ser administrada após a sonicação. Isso resultará em menor absorção de corante, mas pode ser mais relevante clinicamente.</li>
	<li>Injetar um bolus de 0,2 mL de MBs no cateter e lavar com 0,2 mL de solução salina heparinizada. Inicie a sonicação 1-2 min após a injeção de MBs. A configuração usada aqui não coleta feedback de sonicação em tempo real. NOTA: Os estudos para interrupção do BSCB normalmente usam uma concentração maior de MBs do que o indicado para diagnóstico por imagem. Algumas concentrações de marcas comuns de MB usadas para ruptura de BBB e BSCB em modelos de ratos incluem 0,02-0,2 mL/kg e bolus de 200 μL 10,15,24,25.</li>
</ol>5. Extração da medula espinhal e processamento de tecidos
<ol><li>Após o término da sonicação, perfundir transcardialmente o rato com 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) até que o sangue fique completamente limpo. O fígado, que é uma cor azul rica devido ao corante, deve desaparecer para um azul-acastanhado claro26. NOTA: O objetivo da perfusão é remover o excesso de sangue da vasculatura da medula espinhal. Como a EBD se liga à albumina, isso também remove o excesso de EBD. Isso garante que qualquer EBD detectada visualmente ou por microscopia de fluorescência na medula espinhal seja proveniente do extravasamento de corante para o parênquima espinhal.</li>
	<li>Perfusão transcárdica com 100 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% gelado. Os membros do rato se contrairão durante essa fixação se feita completamente. Esta perfusão com PFA eutanasia o rato.</li>
	<li>Retire a medula espinhal e coloque-a em PFA a 4% a 4 °C durante a noite. Substitua o PFA pelo PBS no dia seguinte.</li>
</ol>6. Visualização da ruptura do BSCB
<ol><li>Isole uma seção de 2 cm ao redor do local da sonicação usando uma lâmina de barbear. Divida a seção abaixo da linha média com a lâmina e a seção em seções de 10 μm de espessura usando um micrótomo. Para visualização em campo claro, corar com coloração de hematoxilina-eosina (H&E). NOTA: As amostras de H&E da medula espinhal mostradas neste estudo foram coradas com hematoxilina por 3 min e eosina por 1 min27.</li>
	<li>Para microscopia de fluorescência, desparafinizar as lâminas contendo os cortes medulares e contracorar com 25 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) dissolvido no meio de montagem (0,5 μg/mL). Incubar a 4 °C durante, pelo menos, 10 min. Evite a luz para evitar o clareamento. NOTA: A desparafinização pode ser substituída pelo uso de um criostato para obter seções congeladas.</li>
	<li>Use um microscópio fluorescente para obter imagens de todas as lâminas. A autofluorescência EBD (excitação: 470 nm e 540 nm; emissão: 680 nm) é visível no canal vermelho, enquanto o DAPI está presente no canal azul. Use um microscópio de luz para obter imagens das lâminas H&E. OBS: Embora este protocolo descrevesse um procedimento de não sobrevida, ele também foi realizado usando técnicas cirúrgicas de sobrevida. Para cirurgia de sobrevivência, desinfetar a pele antes da incisão com 3 aplicações alternadas de iodopovidona e administrar buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg/kg) antes da cirurgia. Continuar a fornecer buprenorfina subcutânea a cada 12 h pelo menos 3 dias no pós-operatório, com dias adicionais se o rato apresentar sinais de dor. Se ocorrer lesão medular, os ratos podem apresentar retenção urinária ou marcha anormal. Isso se apresentará como arrastamento ou atraso no movimento dos membros posteriores ou bexigas palpáveis e distendidas. Se isso ocorrer, os ratos domésticos com gel de água nutricionalmente fortificado para alimentação e hidratação e expressam manualmente as bexigas duas vezes por dia até que a micção reflexa seja recuperada. Se houver paralisia completa dos membros posteriores ou dor intratável, eutanasiar o rato.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chopra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-spinal+cord+barrier:+Its+role+in+spinal+disorders+and+emerging+therapeutic+strategies.">Blood-spinal cord barrier: Its role in spinal disorders and emerging therapeutic strategies.</a> NeuroSci. 3 (1), 1-27 (2021).</li><li>Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-spinal+cord+barrier:+morphology+and+clinical+implications.">The blood-spinal cord barrier: morphology and clinical implications.</a> Annals of Neurology. 70 (2), 194-206 (2011).</li><li>Hersh, A. M., Alomari, S., Tyler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+blood-brain+barrier:+Advances+in+nanoparticle+technology+for+drug+delivery+in+neuro-oncology.">Crossing the blood-brain barrier: Advances in nanoparticle technology for drug delivery in neuro-oncology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4153 (2022).</li><li>Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+blood-brain+and+blood-spinal+cord+barriers+to+interferons.">Permeability of the blood-brain and blood-spinal cord barriers to interferons.</a> Journal of Neuroimmunology. 76 (1-2), 105-111 (1997).</li><li>Bellettato, C. M., Scarpa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+strategies+to+cross+the+blood-brain+barrier.">Possible strategies to cross the blood-brain barrier.</a> Italian Journal of Pediatrics. 44, 131 (2018).</li><li>Weber-Adrian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+the+spinal+cord+using+MRI-guided+focused+ultrasound.">Gene delivery to the spinal cord using MRI-guided focused ultrasound.</a> Gene Therapy. 22 (7), 568-577 (2015).</li><li>Hersh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+focused+ultrasound+for+the+treatment+of+glioblastoma:+A+new+frontier.">Applications of focused ultrasound for the treatment of glioblastoma: A new frontier.</a> Cancers. 14 (19), 4920 (2022).</li><li>Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+the+blood-brain+barrier+opening+induced+by+ultrasound+in+presence+of+microbubbles.">Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 30 (7), 979-989 (2004).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+down-regulation+of+P-glycoprotein+by+focused+ultrasound+and+microbubbles+induced+blood-brain+barrier+disruption+in+rat+brain.">Localized down-regulation of P-glycoprotein by focused ultrasound and microbubbles induced blood-brain barrier disruption in rat brain.</a> Scientific Reports. 6, 31201 (2016).</li><li>Smith, P., Ogrodnik, N., Satkunarajah, J., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ultrasound-mediated+delivery+of+trastuzumab+to+normal+and+pathologic+spinal+cord+tissue.">Characterization of ultrasound-mediated delivery of trastuzumab to normal and pathologic spinal cord tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4412 (2021).</li><li>Montero, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-induced+blood-spinal+cord+barrier+opening+in+rabbits.">Ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening in rabbits.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 45 (9), 2417-2426 (2019).</li><li>Fletcher, S. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+transvertebral+ultrasound+and+microbubble-mediated+blood-spinal+cord+barrier+opening.">A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening.</a> Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).</li><li>Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Evans+blue+dye+to+fluorescently+label+and+image+intact+vasculature.">Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature.</a> BioTechniques. 70 (3), 181-185 (2021).</li><li>Fletcher, S. P., Choi, M., Ramesh, R., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-induced+blood-spinal+cord+barrier+opening+using+short-burst+phase-keying+exposures+in+rats:+A+parameter+study.">Focused ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening using short-burst phase-keying exposures in rats: A parameter study.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 47 (7), 1747-1760 (2021).</li><li>Cross, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+note:+Quantification+of+blood-spinal+cord+barrier+permeability+after+application+of+magnetic+resonance-guided+focused+ultrasound+in+spinal+cord+injury.">Technical note: Quantification of blood-spinal cord barrier permeability after application of magnetic resonance-guided focused ultrasound in spinal cord injury.</a> Medical Physics. 48 (8), 4395-4401 (2021).</li><li>Hong, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+stimulation+improves+inflammatory+resolution,+neuroprotection,+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3636 (2021).</li><li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+focused+ultrasound+alleviates+spasticity+and+increases+expression+of+the+neuronal+K-Cl+cotransporter+in+the+L4-L5+sections+of+rats+following+spinal+cord+injury.">Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the L4-L5 sections of rats following spinal cord injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 882127 (2022).</li><li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+anesthetic+agent,+depth+of+anesthesia+and+body+temperature+on+cardiovascular+functional+parameters+in+the+rat.">Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat.</a> Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).</li><li>Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+values+for+young+normal+Sprague-Dawley+rats:+weight+gain,+hematology+and+clinical+chemistry.">Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).</li><li>Lin, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+lateral+hemisection+and+asymmetric+behavioral+assessments+in+adult+rats.">Spinal cord lateral hemisection and asymmetric behavioral assessments in adult rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e57126 (2020).</li><li>Tsehay, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+pulsed+ultrasound+neuromodulation+of+a+rodent's+spinal+cord+suppresses+motor+evoked+potentials.">Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. , (2023).</li><li>Payne, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging-guided+focused+ultrasound+to+increase+localized+blood-spinal+cord+barrier+permeability.">Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability.</a> Neural Regeneration Research. 12 (12), 2045-2049 (2017).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents.">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59295 (2019).</li><li>Sabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+the+blood-brain+barrier+using+low-intensity+pulsed+ultrasound+enhances+responses+to+immunotherapy+in+preclinical+glioma+models.">Opening of the blood-brain barrier using low-intensity pulsed ultrasound enhances responses to immunotherapy in preclinical glioma models.</a> Clinical Cancer Research. 27 (15), 4325-4337 (2021).</li><li>Dr&#233;an, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+blood-brain+barrier+disruption+by+low+intensity+pulsed+ultrasound+increases+carboplatin+delivery+and+efficacy+in+preclinical+models+of+glioblastoma.">Temporary blood-brain barrier disruption by low intensity pulsed ultrasound increases carboplatin delivery and efficacy in preclinical models of glioblastoma.</a> Journal of Neuro-Oncology. 144 (1), 33-41 (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Yamamoto, H., Imai, S., Okuyama, T., Tsubura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+lesions+in+rats+caused+by+intravenous+injection.">Pulmonary lesions in rats caused by intravenous injection.</a> Acta Pathologica Japonica. 32 (5), 741-747 (1982).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., M&#248;llg&#229;rd, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).</li><li>Mainprize, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+primary+brain+tumors+with+non-invasive+MR-guided+focused+ultrasound:+A+clinical+safety+and+feasibility+study.">Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study.</a> Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).</li><li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li></ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses. Amir Manbachi leciona e presta consultoria para a BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical e é inventor de várias tecnologias FUS com patente pendente. Betty Tyler tem financiamento de pesquisa do NIH e é coproprietária da Accelerating Combination Therapies (incluindo capital ou opções). também licenciou uma de suas patentes e é acionista da Peabody Pharmaceuticals. Nicholas Theodore recebe royalties e possui ações da Globus Medical. Ele é consultor da Globus Medical e atuou no conselho consultivo científico da Globus Medical. Os demais autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Aqui, os equipamentos e as etapas necessárias para a interrupção efetiva e direcionada da BSCB usando ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) combinado com a administração de microbolhas (MB) são descritos. Este protocolo é flexível e pode ser otimizado para uso individual com transdutores de especificações variadas. Outras técnicas para a ruptura da BSCB mediada por LIFU dependem do uso de sistemas guiados por ressonância magnética (RM) para localização do alvo, que é um recurso dispendioso16. As vantagens da técnica aqui apresentada residem na rápida confirmação visual em tempo real da ruptura da BSCB e na facilidade de direcionamento devido à natureza aberta do procedimento. Além disso, o aparelho a laser é simples de usar e construir, e um arquivo CAD está incluído na seção suplementar. Como resultado, os pesquisadores interessados em conduzir testes iniciais sobre as capacidades de direcionamento de seu transdutor LIFU em um modelo animal pequeno podem usar este protocolo como uma ferramenta para confirmar rapidamente o posicionamento da zona focal sobre um local de interesse. Essa técnica também pode ser usada por laboratórios que começam a estudar aplicações clínicas de LIFU, como a liberação de medicamentos, antes de investir em modalidades de orientação mais complexas, como sistemas de US ou RM. Atualmente, as modalidades guiadas por US apresentam um caminho mais promissor e custo-efetivo em comparação aos sistemas de RM, embora estes últimos sejam mais frequentemente vistos na literatura.

Existem várias etapas críticas neste procedimento que devem ser cuidadosamente executadas para garantir o sucesso da interrupção do BSCB. É imperativo evitar pressão desnecessária sobre a medula espinhal durante a laminectomia cirúrgica. O excesso de manipulação física do cordão aumenta a probabilidade de danos ao BSCB. O dano aparece como uma mancha marrom escura dentro do cordão umbilical após a extração devido à hemorragia e ao extravasamento acentuado de EBD. Além disso, o acoplamento máximo deve ser assegurado entre o transdutor e a medula espinhal exposta. Como resultado, deve-se tomar cuidado para remover bolhas do cone de água e gel de ultrassom. Não deve haver espaços entre o fundo do cone de água e o cabo para garantir a transmissão total da onda acústica. Durante o cateterismo da veia caudal, deve-se evitar a passagem acidental de ar junto com as soluções salinas heparinizadas, EBD ou MB. A injeção de ar aumenta muito a chance de uma embolia pulmonar que resulte em morte de roedores antes da conclusão do procedimento28.
Um problema comum que pode ser encontrado durante este procedimento é a falha da injeção de EBD bem-sucedida. Para indivíduos com experiência mínima em cateterismo da veia caudal, realizar essa etapa antes da laminectomia, posicionamento ou direcionamento do animal economizará tempo. A EBD também pode ser injetada bem antes da injeção de MB sem influenciar a sonicação. A utilização do torniquete e do banho de água morna sugeridos neste protocolo ajudará a dilatar as veias da cauda e aumentar a taxa de sucesso. Além disso, a desidratação do rato reduz a probabilidade de colocação correta do cateter. Uma injeção intraperitoneal de soro fisiológico 10-15 minutos antes da cateterização da veia caudal pode ajudar. Durante o cateterismo, deve-se iniciar 2 em acima da extremidade da cauda e mover-se no sentido caudal para cranial. Mover-se na direção oposta diminui a probabilidade de sucesso devido ao potencial colapso da veia ou hemorragia.
Outro desafio comum envolve a ausência de extravasamento de EBD apesar da sonicação. Isso pode indicar que os parâmetros que estão sendo usados para sonicação são insuficientes para a interrupção do BSCB. Por exemplo, se a frequência de sonicação é definida em um valor que difere muito da frequência central do transdutor, a potência de sonicação será muito baixa para oscilar MBs e causar afrouxamento da junção apertada. Além disso, quanto mais interfaces entre o transdutor e o cabo (por exemplo, cone de água, membrana, gel, bolhas de ar em água/gel), menor será a verdadeira intensidade de sonicação no alvo. Minimizar essas interfaces, como usar gel desgaseificado e remover completamente as bolhas dentro do cone, ajudará a transmitir todo o potencial da sonicação. O protocolo também incentiva o aumento do tempo entre a sonicação e a perfusão para permitir mais tempo para o extravasamento da EBD para o parênquima espinhal. Embora a ruptura do BSCB seja um procedimento transitório, as lacunas estão presentes por várias horas antes do fechamento. Um longo tempo de espera aumenta a exposição ao isoflurano, mas também resulta em maior extravasamento de EBD no cordão. Alternativamente, o extravasamento de EBD pode estar presente, apesar de não haver sonicação com LIFU. Para solucionar esse problema, deve-se tomar cuidado durante a laminectomia para evitar qualquer dano acidental à BSCB. As soluções potenciais incluem levantar a coluna do rato durante o clampeamento para aumentar a quantidade de espaço entre as lâminas e o cordão, bem como uma laminectomia mais curta. Uma perfusão completa de PFA também reduz a coloração de fundo, removendo o sangue enriquecido com EBD da vasculatura dentro da medula espinhal. Durante a perfusão transcárdica, deve-se tomar cuidado para evitar ruptura acidental do coração, que pode resultar em vazamento de PBS ou PFA.
É importante notar que este estudo representa uma experiência de um único centro para a ruptura da BSCB mediada pela LIFU. Além disso, este protocolo não testa ou otimiza vários parâmetros de energia de sonicação e concentrações de AM. Como resultado, os pesquisadores são encorajados a investigar vários parâmetros e concentrações ao realizar essa técnica para otimizar a localização do alvo e a interrupção da BSCB para suas necessidades específicas de pesquisa, especialmente se os resultados iniciais produzirem quaisquer efeitos adversos. Grupos que gostariam de ver nenhuma mudança de temperatura, por exemplo, podem testar vários parâmetros até encontrar um conjunto que atenda a esse critério e alcançar interrupção suficiente do BSCB. Além disso, experimentos adicionais podem ser realizados para confirmar a segurança dessa técnica. Por exemplo, o tamanho das amostras pode ser aumentado, o período de sobrevida pode ser estendido e estudos de eletromiografia/análise da marcha podem ser realizados. Para sobrevidas mais longas, é importante ter em mente que alguns estudos mostram que altas doses de EBD às vezes podem causar toxicidade sistêmica crônica, portanto, uma dose mais baixa pode ser prudente29.
Outra limitação desse procedimento é a natureza invasiva da laminectomia (que é necessária para qualquer técnica que use LIFU para abertura da BSCB, uma vez que o ultrassom não pode penetrar através do osso). A natureza invasiva deste procedimento pode ser reduzida limitando a duração da laminectomia. A realização da laminectomia nas vértebras torácicas superiores, que são mais curtas e finas, pode reduzir o tempo necessário para laminectomia para menos de 10 min. Devido à natureza frágil dos MBs, bem como sua meia-vida curta, o tempo é limitado durante esse protocolo. A injeção de MBs deve ocorrer 1-2 minutos antes do tratamento com LIFU, e novos MBs devem ser administrados antes de cada sonicação se vários tratamentos com LIFU estiverem sendo realizados. Para experimentos envolvendo interrupção da BSCB para vários ratos, vários frascos MB podem precisar ser preparados. Como as microbolhas são caras, a alteração do fluxo de trabalho cirúrgico para minimizar o tempo entre as sonicações é preferível para conservar o número de MB usados.
A técnica aqui descrita destina-se principalmente ao uso como protocolo de pesquisa. Embora o aparelho de mira a laser não substitua as modalidades tradicionais de direcionamento em todos os cenários clínicos, ele pode ser útil em outras situações. Para cirurgias não invasivas, as modalidades tradicionais de RM podem ser usadas de forma confiável para segmentação30. Para cirurgias invasivas que incluem uma laminectomia sendo realizada, o aparelho de ponto laser descrito neste protocolo pode ser usado para localizar rapidamente o centro da zona focal de sonicação sobre uma região específica (por exemplo, um tumor ou um local de lesão medular) para fins de liberação de drogas ou terapia imunomoduladora, complementando qualquer orientação de RM que esteja ocorrendo.
De modo geral, este protocolo descreve uma técnica eficaz e bem-sucedida para a ruptura do BSCB e inclui várias opções para confirmação da abertura do BSCB, tanto em tempo real quanto no pós-processamento. Com a BSCB funcionando como uma barreira à entrada no parênquima medular, a ruptura da BSCB é um método possível para melhorar a entrega da terapêutica. Weber-Adrian e col., por exemplo, utilizaram LIFU com frequência de 1,114 MHz e comprimento de burst de 10 ms para mediar a liberação gênica para a coluna cervical6. Da mesma forma, Smith e col. mostraram que LIFU com frequência de 580 kHz, pressões médias de pico acústico em torno de 0,46 MPa e comprimento de ruptura de 10 ms poderiam auxiliar na entrega de um anticorpo monoclonal, o trastuzumabe, à medula espinhal em um modelo de metástases leptomeníngeas em roedores10. A maioria dos estudos tem se concentrado na utilização de LIFU, em vez de HIFU, devido à capacidade do LIFU de permeabilizar transitoriamente o BSCB, evitando danos ao tecido subjacente. Normalmente, o LIFU usa intensidades entre 0,125-3 W/cm 2, enquanto o HIFU usa intensidades de 100-10.000 W/cm2 ou superior31. Como resultado, o HIFU exerce seus efeitos principalmente através do aquecimento do tecido, enquanto o LIFU, com a coadministração de MBs, trabalha através de efeitos de cavitação mecânica. A coadministração de terapêutica com MBs pode resultar em maior extravasamento da droga para o parênquima espinhal, bem como o potencial de carregar MBs com droga e lisar os MB com ultrassom para liberação de drogas direcionadas.
Os parâmetros de sonicação, concentração de MB e tipo de transdutor utilizado neste estudo podem ser alterados com base nas necessidades experimentais. Por exemplo, um transdutor com uma região focal menor pode ser preferível para experimentos em que é necessário maior controle sobre o direcionamento localizado, enquanto um transdutor com maior potência pode ser usado para experimentos que exigem ruptura poderosa em um período de tempo mais curto. Devido à flexibilidade oferecida por esse protocolo, há grande potencial para uso em pesquisas pré-clínicas, clínicas e translacionais.

Assim como a barreira hematoencefálica (BHE), a barreira hematoencefálica (BCB) regula o movimento de solutos, células e componentes plasmáticos circulantes para o parênquima espinhal1. Essa característica protetora é o resultado de um sistema especializado de células endoteliais não fenestradas e firmemente ligadas que revestem os capilares espinhais2. Tipicamente, apenas moléculas lipofílicas de baixo peso e carga positiva podem atravessar ambas as barreiras3. Apesar de estudos sugerirem que a BSCB tem uma permeabilidade ligeiramente maior que a BBB, ambas as barreiras limitam a entrega da terapêutica ao sistema nervosocentral4. Várias estratégias têm sido desenvolvidas para aumentar o transporte de fármacos através da BSCB, incluindo técnicas para aumentar a pressão osmótica nos capilares espinhais, o desenvolvimento de fármacos que interagem com receptores de bradicinina e a criação de nanopartículas funcionalizadas5.
A ruptura da BSCB também pode ser obtida por meio da administração intravenosa de microbolhas (MBs) seguida de sonicação de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU)6. O campo acústico gerado pelo transdutor de ultrassom provoca oscilações de MB que, por sua vez, exercem tensão contra a parede endotelial e afrouxam as tight junctions7. O afrouxamento das tight junctions cria lacunas transitórias nos capilares, permitindo que a terapêutica penetre no parênquima espinhal (Figura 1). Esse processo também pode criar fenestrações transendoteliais, aumentar a transcitose e diminuir a regulação dos transportadores de de ligação ao ATP, como a glicoproteína P 8,9. Um dos principais benefícios dessa técnica é a capacidade de minimizar os efeitos fora do alvo, direcionando a região focal de sonicação para o local de interesse na medula espinhal. Vários ensaios clínicos investigaram a eficácia da abertura BBB mediada por LIFU para o tratamento de patologias do sistema nervoso central, incluindo gliomas, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Embora a interrupção da BSCB mediada pela LIFU não seja tão extensivamente caracterizada como a interrupção da BSCB mediada pela LIFU, vários grupos relataram a interrupção bem-sucedida da BSCB em modelos de roedores, coelhos e suínos10,11,12. Em geral, o interesse pela técnica está crescendo rapidamente, especialmente como uma via viável para a liberação de drogas.
Neste protocolo, uma técnica para ruptura da BSCB mediada por LIFU em um modelo de rato é descrita. O procedimento inclui descrições detalhadas da preparação dos animais, configuração do equipamento LIFU, administração de AM, localização do alvo e extração da medula espinhal. A confirmação da localização do alvo e da ruptura da BSCB é avaliada por meio do extravasamento do corante azul de Evans (EBD) para a medula espinhal. A EBD é um composto atóxico que se liga à albumina sérica e pode ser identificada visualmente por sua rica cor azul e autofluorescência vermelha à microscopia13.
As etapas listadas aqui oferecem uma alternativa rápida e barata aos sistemas LIFU guiados por ultrassom (US) ou ressonância magnética (RM) tradicionais. Como resultado, este método é útil para pesquisadores interessados em testar e confirmar rapidamente as capacidades de direcionamento e interrupção do BSCB de seu transdutor LIFU antes de adquirir equipamentos e materiais adicionais ou buscar aplicações de LIFU na medula espinhal, como entrega de drogas, imunomodulação e neuromodulação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Heparinized Sodium Chloride</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FKB0953G</td>
			<td>Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL Luer Lock Tip Syringe (2)</td>
			<td>Wilburn Medical</td>
			<td>WUSA/120</td>
			<td>One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10010001</td>
			<td>For transcardial perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G catheter</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>50-209-1694</td>
			<td>Use to place a tail vein catheter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>97% Isoflurane</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>247-897-7</td>
			<td>While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine 7.5%</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>4677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class A clear threaded glass vial</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-314</td>
			<td>Use to store spinal cord extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital balance scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Wahl Home Products</td>
			<td>79449-200</td>
			<td>Shave fur off skin at incision site before surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>71304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>02151108-CF</td>
			<td>Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps</td>
			<td>PSI Impactors</td>
			<td>7001-2</td>
			<td>Affix the stereotactic arm to this frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>7211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors with Angled Blades</td>
			<td>ProDentUSA</td>
			<td>12-15315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane induction system&#160;&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-RATKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser targetting apparatus</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom</td>
			<td>CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating eye ointment</td>
			<td>Systane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 3-Way Stopcock</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SAS7521-10EA</td>
			<td>Can use to fill water cone through inlet valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumason microbubbles kit</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>0270-7099-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>23-900-671&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-2000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar membrane</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>3016</td>
			<td>Can cut membrane to appropriate size if too large for cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroFUS 2.52&#34; diameter 250 kHz transducer</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>CTX-250</td>
			<td>Transducer system includes custom water cone and probe holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroFUS PRO v2.0 system</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>NFS102v2</td>
			<td>Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Offset Bone Nippers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16101-10</td>
			<td>Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24364-1&#160;</td>
			<td>Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J61899-AK</td>
			<td>For transcardial perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Surgical Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSRATKIT</td>
			<td>Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal thermometer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RET-2</td>
			<td>Maintain rat temperature between 35.9&#8211;37.5 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>50-205-1983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single animal vaporizer unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic arm</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorbent pad</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Aquasonic</td>
			<td>PLI 01-34</td>
			<td>Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disruption of the blood-spinal cord barrier using low-intensity focused ultrasound in a rat model

O ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) usa pulsações ultrassônicas em intensidades mais baixas do que o ultrassom e está sendo testado como uma tecnologia neuromoduladora reversível e precisa. Embora a abertura da barreira hematoencefálica mediada por LIFU (BHE) tenha sido explorada em detalhes, nenhuma técnica padronizada para a abertura da barreira hematoencefálica (BSCB) foi estabelecida até o momento. Portanto, este protocolo apresenta um método para o sucesso da ruptura da BSCB usando a sonicação de LIFU em um modelo de rato, incluindo descrições da preparação animal, administração de microbolhas, seleção e localização do alvo, bem como visualização e confirmação da interrupção da BSCB. A abordagem relatada aqui é particularmente útil para pesquisadores que precisam de um método rápido e econômico para testar e confirmar a localização do alvo e a interrupção precisa do BSCB em um modelo animal pequeno com um transdutor de ultrassom focado, avaliar a eficácia do BSCB dos parâmetros de sonicação ou explorar aplicações para LIFU na medula espinhal, como a liberação de drogas, imunomodulação e neuromodulação. Recomenda-se otimizar esse protocolo para uso individual, especialmente para avançar futuros trabalhos pré-clínicos, clínicos e translacionais.

Este trabalho demonstra que a aplicação concomitante de sonicação de LIFU e administração de MB é uma técnica eficaz para a interrupção localizada da BSCB. A abertura da BSCB é indicada pela presença de extravasamento de EBD para o parênquima espinhal. As alterações são aparentes tanto visualmente quanto sob microscopia de fluorescência. A vasculatura medular é visível após laminectomia e mostra a veia espinhal posterior com múltiplos vasos menores irradiando lateralmente (Figura 4A). A injeção intravenosa de EBD através do cateter da veia caudal resulta no enriquecimento dessa vasculatura com corante azul (Figura 4B). Este é um bom ponto no procedimento para verificar se a laminectomia não resultou na ruptura de nenhuma vasculatura espinhal, pois isso resultaria em acúmulo de sangue azul sobre a medula. Após a sonicação, uma mancha azul deve tornar-se visível sobre o local alvo, indicando o extravasamento de EBD para o parênquima branco devido à ruptura da BSCB (Figura 4C). O tamanho desse ponto varia com base em uma série de fatores, incluindo o tamanho da região focal do transdutor e a quantidade de tempo após a sonicação. Para aumentar as chances de ver extravasamento de EBD, deve-se prolongar o tempo entre a sonicação e a extração da medula espinhal.
Embora a perfusão por PFA não seja uma etapa necessária para realizar antes da extração do cordão umbilical e subsequente análise tecidual, ela remove o sangue da amostra e aumenta o contraste entre o parênquima espinhal branco e as regiões coradas com EBD azul. Todos os ratos que receberam administração de MB e sonicação de LIFU mostram aparente extravasamento de EBD para a medula espinhal, enquanto controles negativos que receberam MBs e EBD sem sonicação de LIFU não. Imagens representativas são mostradas na Figura 5. Cortes sagitais através dos tecidos revelam que o extravasamento de EBD não é apenas superficial, mas se estende até o próprio cordão. Isso é esperado, uma vez que a região focal do transdutor utilizado neste estudo é maior que o diâmetro da medula espinhal de ratos. Às vezes, pequenas quantidades de hemorragia podem ser observadas nos cortes sagitais. Isso pode ser devido à laminectomia ou à sonicação por ultrassom. Se a hemorragia estiver próxima à periferia dorsal do cordão, é mais provável que seja devido à laminectomia.
Para avaliar melhor o extravasamento de EBD, cortes sagitais da medula espinhal foram corados com DAPI (marcador nuclear) e imageados em microscópio fluorescente. Todos os cordões que receberam sonicação com LIFU (n = 3) apresentaram uma intensidade significativamente maior de autofluorescência da EBD (p = 0,016) do que os cordas que não receberam sonicação, com intensidades semelhantes de DAPI presentes em ambos (Figura 6). A análise de H&E revelou ainda que não houve dano neuronal, hemorragia ou lesões cavitárias presentes nos locais sonicados, apoiando a segurança deste procedimento. Exemplos de cordas lesadas devido ao mau manuseio cirúrgico e uma sonicação de alta potência são mostrados como comparação. Hemorragia, dano tecidual, lesões cavitárias e possível vacuolização são marcados. Embora o exemplo de sonicação de alta potência não mostre hemorragia, isso também foi relatado como um efeito da interrupção do ultrassom.
Além disso, a análise comportamental foi conduzida em ratos que receberam MBs, EBD e sonicação LIFU. Embora esse método não exclua completamente o dano tecidual, ele testa se déficits motores ocorreram devido a esse procedimento. Os ratos foram registrados caminhando em uma gaiola por 5 min todos os dias durante um período de 5 dias, e a função locomotora foi graduada com base na escala locomotora de Basso Beattie Bresnahan (Supplemental Video File 1). Todos os ratos (n = 5) receberam a maior pontuação antes da sonicação, pós-sonicação e todos os dias do período de sobrevivência (Figura 7).
Finalmente, os efeitos térmicos dos parâmetros de sonicação utilizados neste estudo foram medidos usando duas amostras ex vivo da medula espinhal de ratos e uma sonda de termômetro digital com uma ponta fina inserida na medula.  A temperatura das amostras da medula espinhal foi rastreada por 5 min antes, durante e após a sonicação, totalizando 15 min. Mudanças mínimas de temperatura foram observadas. De fato, houve alteração de ≤1,3 °C devido à sonicação em ambas as amostras, diminuindo a probabilidade de lesão hipertérmica como resultado da sonicação (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig01.jpg"> Figura 1: Mecanismo de abertura da barreira hematomedular mediado por ultrassom focalizado de baixa intensidade. (A) Visão geral esquemática da sonicação de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) da medula espinhal de ratos. (B) O mecanismo de abertura da barreira hematormedular (BSCB) via sonicação LIFU de microbolhas intravenosas (MBs). Os MBs oscilam em resposta ao LIFU, causando o alargamento das tight junctions entre as células endoteliais. Essa ruptura do BSCB permite o extravasamento de nanopartículas, drogas terapêuticas ou corante azul de Evans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig02.jpg"> Figura 2: Configuração e conectividade da bancada de ultrassom focalizado de baixa intensidade. (A) Representação esquemática mostrando componentes típicos do ultrassom focalizado. (B) Imagem geral da configuração do ultrassom focalizado, incluindo: 1. saída de potência do transdutor (TPO), 2. rede correspondente, 3. Transdutor LIFU, 4. o instrumento estereotáxico, 5. braçadeiras móveis. (C) Transdutor, incluindo: 1. suporte de sonda, 2. transdutor de anel, 3. cone de água, 4. tubo de entrada de água, 5. tubo de saída de água, 6. membrana presa com um elástico. (D) Frente do TPO, incluindo: 1. Gabinete blindado RF, 2. painel frontal sensível ao toque com menu ajustável, 3. botão giratório para ajuste de parâmetros, 4. interruptor de saída start/stop. (E) Parte traseira do TPO, incluindo: 1. conectores de saída de canal, 2. terra, 3. porta de entrada USB para controle de software, 4. gatilho interno, 5. conector de saída de sincronização, 6. tomada de entrada de energia e alimentação, 7. interruptor liga/desliga. (F) Saída de rede correspondente, com fios correspondentes a números de canal. (G) Entrada XDR de rede correspondente, com fios correspondentes a números de canal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig03.jpg"> Figura 3: Localização do alvo com orientação a laser . (A) Braço estereotáxico com amplitude de movimento nos três eixos e capacidades de rotação. É afixado na placa de fixação abaixo. (B) Aparelho laser para identificação da zona focal. O laser é posicionado na ponta do transdutor e está alinhado com a região focal. (C) Ilustração mostrando o laser sobre a medula exposta indicando que a região focal do transdutor está agora direcionada para esse local. (D) O transdutor é abaixado até que a ponta do cone esteja localizada 1 cm acima do cabo, e o vão é preenchido com gel para garantir o máximo acoplamento. A distância do transdutor à medula espinhal é de 40 mm (distância focal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig04.jpg"> Figura 4: Extravasamento do corante azul de Evans na medula espinhal pós-sonicação . (A) Imagem de incisão de laminectomia de ratos T9-T11, com a medula espinhal exposta e veia dorsal posterior claramente visíveis. (B) O tecido circundante e a vasculatura da medula espinhal tornam-se azuis após a injeção intravenosa de corante azul de Evans (EBD). (C) Extravasamento de EBD para o parênquima medular no local da sonicação, indicando que ocorreu ruptura da BSCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig05.jpg"> Figura 5: Extração medular e visualização da abertura da BSCB pós-perfusão. (A) Extirpada medular de rato controle sem tratamento com LIFU. Esse rato recebeu apenas MB e EBD. O corte sagital médio do cordão embutido em parafina é mostrado no inset, e nenhum extravasamento de EBD é visível. (B) Extirpada da medula espinhal de rato com tratamento com LIFU. Esse rato também recebeu MBs e EBD. A coluna de extravasamento da EBD é visível e localizada na região sonicada. O corte sagital médio do cordão embutido em parafina é mostrado no inset, com uma seta apontando para a concentração de EBD visível dentro do local sonicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig06.jpg"> Figura 6: Detecção e avaliação da abertura da BSCB. (A) Medula espinhal corada com DAPI (marcador nuclear, azul). A autofluorescência mínima da EBD (vermelho) é visível. Este rato não recebeu LIFU. (B) Medula espinhal corada com DAPI (marcador nuclear, azul). A autofluorescência localizada da EBD (vermelho) no local de destino sonicated é visível. Este rato recebeu LIFU e MBs. (C) A medula espinhal de um rato sem LIFU corada com hematoxilina (coloração de ácido nucleico) e eosina (coloração de proteína inespecífica) (H&E). Nenhum dano neuronal, hemorragia ou lesões cavitárias são visíveis. (D) A medula espinhal de um rato com LIFU corado com H&E. Nenhum dano neuronal, hemorragia ou lesões cavitárias são visíveis. (E) Medula espinhal de um rato com lesão cirúrgica corada com H&E. As setas apontam para ampla hemorragia e dano tecidual. (F) A medula espinhal de um rato com danos devido à sonicação de alta potência corada com H&E. As setas apontam para lesões cavitárias, e o inset mostra possível vacuolização. (G) Gráficos de barras mostrando a intensidade de DAPI e EBD na medula espinhal de ratos com e sem sonicação de LIFU. Há significativamente mais intensidade de TECs na medula espinhal de LIFU quando comparada ao controle negativo (p = 0,016), apesar da intensidade semelhante do DAPI (p > 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig07.jpg"> Figura 7: Ensaio comportamental pré e pós-sonicação . (A) Configuração do aparelho de Basso, Beattie, Bresnahan, no qual os ratos foram registrados caminhando por 5 min a partir de baixo. (B) Imagem estática de um vídeo gravado. Este vídeo foi usado para classificar a coordenação motora e a marcha do rato na escala de Basso, Beattie, Bresnahan. (C) Boxplot (n = 5) mostrando que não houve alteração nos escores motores pré-sonicação, pós-sonicação ou durante um período de sobrevida de 5 dias em ratos que receberam MB e tratamento com LIFU (p > 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65113/65113fig08.jpg"> Figura 8: Análise da temperatura utilizando medula espinhal ex vivo . Gráfico descrevendo as mudanças de temperatura em duas amostras ex vivo da medula espinhal por uma duração de 5 minutos pré, durante e pós-sonicação. Os parâmetros utilizados para sonicação estão listados na Tabela 1. Para a amostra 1, as temperaturas médias pré, durante e pós-sonicação foram 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,1 °C ± 0,1 °C e 22,0 °C ± 0,1 °C, respectivamente. Para a amostra 2, as temperaturas pré, durante e pós-sonicação foram 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C e 22,4 °C ± 0,2 °C, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/65113fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Arquivo CAD do aparelho de mira a laser. (A) Vista do aparelho laser por baixo. Qualquer laser pode ser colocado dentro do orifício central no meio. (B) Vista lateral do aparelho laser. (C) Dimensões do aparelho laser, com unidades em polegadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de Vídeo Suplementar 1: Vídeo de um rato andando no aparelho Basso, Beattie, Bresnahan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65113/Supplemental%20File%202%20Low%20Res.mov" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

A ruptura da barreira hemato-medular (BSCB) pode ser alcançada com sucesso com a administração intravenosa de microbolhas e a aplicação de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU). Este protocolo detalha a abertura do BSCB usando LIFU em um modelo de roedor, incluindo a configuração do equipamento, injeção de microbolhas, localização do alvo e visualização da interrupção do BSCB.

Ruptura da Barreira Hemato-Medular Usando Ultrassom Focalizado de Baixa Intensidade em Modelo de Rato

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

A barreira hemato-medular é firmemente ligada e tem permeabilidade limitada. Esse protocolo permite que os pesquisadores abram com segurança e transitoriedade a barreira hematoespinhal, usando microbolhas e ultrassom focado. Essa técnica permite que a abertura da barreira hematoespinhal seja localizada no segmento da medula espinhal alvo.Além disso, a interrupção pode ser facilmente confirmada por observação visual ou microscopia fluorescente. Este protocolo pode ser explorado por seu potencial em melhorar a entrega de terapias gênicas, ou drogas para a medula espinhal para o tratamento de tumores, atrofia ou lesão. Quem vai demonstrar o procedimento será Meghana Bhimreddy.Um estudante de MD estelar do meu laboratório, que diariamente faz a ponte entre engenharia e medicina. Para começar, adquira um sistema de transdutor de ultrassom focado com especificações suficientes para alcançar a barreira hemato-medula espinhal, ou aberturas BSCB em ratos. Afixe o suporte de sonda impresso em 3D e o cone de água no transdutor.Verifique se há uma vedação estanque entre o cone e o transdutor. Fixe a membrana de poliéster esterilizada, de 50 mícrons de espessura, acusticamente transparente, no fundo do cone de água usando um elástico. Encha o cone de água com água desgaseificada e deionizada usando os tubos de entrada e saída.Evite bolhas de ar dentro do cone, pois elas podem interromper o acoplamento acústico entre o transdutor e o alvo. Nesta fase, a membrana de Mylar deve ser ligeiramente inflada. Conecte o equipamento de acionamento que contém o gerador de ondas e o amplificador de acionamento de radiofrequência ao transdutor.Fixe o braço estereotáxico na placa de fixação e prenda o suporte da sonda ao braço. Registrar o peso de uma rata Sprague-Dawley anestesiada e realizar um teste de pinça dos dedos dos pés e da cauda para confirmar a anestesia. Coloque uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente estéril na placa de fixação.Posicione o rato sobre a almofada absorvente. Aplique pomada ocular e coloque um termômetro retal para monitorar a temperatura corporal. Palpar a última costela do rato, que está presa à coluna vertebral na 13ª vértebra torácica.Use uma navalha elétrica para raspar o pelo da superfície dorsal entre a última costela e o pescoço. Limpe a pele exposta com gaze mergulhada em iodopovidona a 10%. Criar uma incisão mediana com tesoura de íris e dissecar através da fáscia até que os processos espinhosos e a lâmina estejam expostos.Remova o osso com pinças ósseas offset e tesoura de íris de lâmina angulada, até que a medula espinhal fique exposta. Fixe o rato à placa de fixação apertando os processos espinhosos adjacentes à laminectomia. Em seguida, puxe levemente as braçadeiras para deixar a coluna tensa.Ajustar a posição do transdutor com o braço estereotáxico até que ele esteja localizado exatamente acima da laminectomia. Afixar o aparelho laser no fundo do cone de água e baixá-lo até que o ponto laser esteja visível. Em seguida, ajuste a posição lateral do transdutor até que o ponto laser esteja acima do local alvo para a ruptura da BSCB.Remova o aparelho de laser e preencha o espaço entre o cone e a medula espinhal com gel de ultrassom desgaseificado, sem introduzir bolhas de ar. Defina os parâmetros para sonicação na saída de energia do transdutor. Prepare uma solução de microbolhas de acordo com as instruções do fabricante.Para aumentar as chances de sucesso do cateterismo da veia caudal, mergulhe a cauda em água morna e coloque um torniquete na base da cauda para aumentar o diâmetro das veias. Em seguida, insira um cateter venoso caudal calibre 22 e lave com 0,2 mililitros de soro fisiológico heparinizado. Injete um mililitro por quilograma de corante azul de 3% ou EBD no cateter.Em seguida, lave o cateter com 0,2 mililitros de solução salina heparinizada. Confirme o cateterismo bem-sucedido da veia caudal verificando se há alteração de cor azul na pele, nos olhos ou na veia espinhal dorsal do rato. Injetar 0,2 mililitros em bolus de microbolhas no cateter e lavar com soro fisiológico heparinizado antes de iniciar a sonicação.Após a eutanásia do rato, remova a medula espinhal e coloque-a em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua o paraformaldeído por PBS. Para visualizar a interrupção do BSCB, isole uma seção de dois centímetros ao redor do local da sonicação, usando uma lâmina de barbear.Dividir o corte em cortes de 10 mícrons de espessura usando micrótomo e corar com coloração de hematoxilina eosina. Para microscopia de fluorescência, desparafinizar a lâmina contendo o corte da medula espinhal e contramanchar com 25 microlitros de DAPI dissolvidos no meio de montagem. Incubar as seções a quatro graus Celsius por 10 minutos no escuro para evitar o clareamento.Após a incubação, use um microscópio fluorescente para obter imagens de todas as lâminas. Imagem da lâmina corada pela hematoxilina e eosina usando um microscópio de luz. A vasculatura medular é visível após laminectomia e mostra a veia espinhal posterior, com múltiplos vasos menores irradiando lateralmente.Após a injeção intravenosa de EBD, o tecido circundante e a vasculatura medular pareciam azuis. Após a sonicação, uma mancha azul torna-se visível sobre o local alvo, indicando o extravasamento de EBD para o parênquima branco, devido à ruptura da BSCB. A excisão da medula espinhal dos ratos com ultrassom focado de baixa intensidade, ou sonicação com LIFU, confirmou o aparente extravasamento da EBD para a medula espinhal.Enquanto os ratos controlados negativos sem tratamento com LIFU não mostraram extravasamento de EBD. As medulas, com sonicação por LIFU, apresentaram intensidade significativamente maior de autofluorescência da EBD, do que as medulas, que não receberam sonicação. Com intensidades semelhantes de DAPI presentes em ambos.A análise da hematoxilina e eosina não revelou dano neuronal, hemorragia ou lesões cavitárias nos locais sonicados. Exemplos de cordas lesionadas devido ao mau manuseio cirúrgico e sonicação de alta potência são mostrados como comparação. Nos ratos que receberam microbolhas e tratamento com LIFU, não foi observada alteração nos escores motores, pré-sonicação, pós-sonicação e durante um período de sobrevivência de cinco dias.Mínimas alterações na temperatura medular foram observadas antes, durante e após a análise da sonicação. É importante limitar o dano cirúrgico ao cordão durante a laminectomia. A visualização dos cortes corados em H e E com microscopia, indicará se ocorreu algum dano.Após a ruptura da barreira hemato-espinhal, usando ultrassom de foco, os animais podem ser injetados com agentes antineoplásicos ou terapias gênicas. O resultado determinará se esta técnica pode melhorar a entrega de terapêutica e estender a sobrevivência no contexto da patologia da medula espinhal.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Indução de Sinais de adesão dependentes Usando ultra-som de baixa intensidade

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Bioengenharia

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

Monitoramento em tempo real de High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Fígados Usando Movimento Harmônico Imaging para ultra-som focalizado (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Treinar Pessoas com lesão medular de deambular Usando um exoesqueleto energizado

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...