Name: focused ultrasound neuromodulation of human in vitro neural cultures in multi-well microelectrode arrays
Uploaded: 2024-05-03T12:40:00
Duration: 4 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays at JoVE.com

Amir Manbachi et Nitish Thakor reconnaissent le soutien financier de la Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Contrat d’attribution : N660012024075. En outre, Amir Manbachi remercie le soutien financier du programme de bourses de recherche clinique (KL2) de l’Institut Johns Hopkins pour la recherche clinique et translationnelle (ICTR), administré par le National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) des National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor remercie les National Institutes of Health (NIH) pour leur soutien financier : R01 HL139158-01A1 et R01 HL071568-15.

1. Préparation du matériel
<ol><li>Aspirez le milieu de culture et utilisez-le pour remplir un seul puits dans une plaque de culture de neurones à 24 puits avec MEA intégré (Figure 2A). Cultiver et induire les neurones selon le protocole publié par Taga et al.13.</li>
	<li>Stérilisez l’interface du parafilm, l’élastique et le cône FUS avec sa membrane en caoutchouc avec de l’éthanol à 70 % pendant 10 min, et placez-les dans la hotte pour un montage ultérieur.</li>
	<li>Dégazer 300 mL d’eau déminéralisée et 50 mL de gel de couplage. Centrifuger l’eau et le gel à 160 x g pendant 5 min pour éviter d’induire une cavitation dans le milieu de couplage. REMARQUE : La source d’origine des HiPSC provient des lignées cellulaires GM01582 et CIPS. En moyenne, une densité de 5 x 104 motoneurones et de 2,5 x 104 astrocytes par puits peut être atteinte14.</li>
</ol>2. Connexion et configuration des périphériques
<ol><li>Fixez le cône FUS au transducteur à l’aide de vis et scellez le cône avec une membrane en caoutchouc flexible dans une hotte stérile ventilée. Remplissez le cône avec l’eau dégazée et déminéralisée (DG-DI) de l’étape 1.3 et assurez-vous de l’absence de bulles dans le cône pour éviter la cavitation.</li>
	<li>Utilisez une tige filetée personnalisée pour fixer le support imprimé en 3D à un cadre (Figure 2B). Positionnez le cadre de manière à ce que la tête du transducteur FUS soit au-dessus du puits qui sera stimulé.</li>
	<li>À l’aide d’un élastique, fixez le parafilm sur le puits sur la plaque MEA à 24 puits contenant le milieu et les HiPSC.</li>
	<li>Préparez le système FUS en connectant l’électronique de commande arrière du transducteur à ultrasons, dans ce cas, la puissance de sortie du transducteur (TPO ; Figure 3A), à une prise de courant de 100 à 240 V (Figure 3B, Connexion 6) et en connectant le réseau correspondant au TPO et au transducteur FUS (Figure 3B, Connexion 1 et Connexion 2, respectivement). Le réseau d’adaptation assure un couplage électrique efficace entre le transducteur et le TPO.</li>
	<li>Branchez le système MEA sur une prise de courant (100-240 V) (Figure 3B, Connexion 5). Connectez le port de synchronisation du système MEA au TPO (Figure 3B, Connexion 3). Cette connexion synchronisera l’acquisition des données par le système MEA avec la stimulation FUS.</li>
	<li>Placez la plaque MEA à 24 puits dans le système MEA et retirez le couvercle pour permettre un contact direct entre le transducteur et le puits. Placez le transducteur à 5-10 mm au-dessus de la plaque du puits pour laisser de la place pour le gel de couplage dégazé, comme décrit à l’étape 3.2 (Figure 3A et Figure 2B).</li>
</ol>3. Stimulation et acquisition de signaux neuronaux
<ol><li>Réglez les paramètres FUS sur le panneau de commande TPO (Tableau 1).</li>
	<li>Appliquez le gel de couplage sur le parafilm et abaissez le transducteur FUS dans le gel de couplage, en assurant le contact avec le gel avec un minimum de bulles d’air (Figure 2A).</li>
	<li>Démarrez l’enregistrement du système MEA en cliquant sur le bouton Démarrer de l’interface utilisateur.</li>
	<li>Démarrez la sonication FUS en appuyant sur le bouton inférieur droit du TPO (Figure 3A, étiquette 7) et attendez au moins 5 minutes entre chaque cycle de sonication pour permettre aux neurones de revenir à un état de base.</li>
	<li>Utilisez l’impulsion de déclenchement générée par le système FUS pour aligner la séquence de stimulation FUS sur l’enregistrement MEA (Figure 3B, Connexion 3).</li>
</ol>4. Traitement et analyse des données
<ol><li>Transférez les données du système MEA vers l’ordinateur à l’aide d’une connexion USB (Figure 3B, Connexion 4). Pour commencer, cliquez sur le panneau Configuration de l’expérience . Ensuite, choisissez le type de données que vous souhaitez enregistrer. Dans ce cas, les pointes brutes sont recommandées. Enfin, nommez le fichier et sélectionnez l’emplacement souhaité dans le lecteur de disque pour terminer le transfert. REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées en exécutant le script Python publié dans https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod.</li>
	<li>Lisez les données de chacune des 16 électrodes.</li>
	<li>Appliquez un filtre passe-bande Butterworth avec une bande passante de 5 Hz à 3 kHz avec un ordre de Butterworth de 8. REMARQUE : Pour optimiser ces valeurs, il est crucial de prendre en compte la cadence de déclenchement des cellules spécifiques et le nombre de cellules impliquées. En multipliant ces 2 valeurs, on peut estimer le taux de déclenchement global de la population cellulaire dans l’expérience.</li>
	<li>Appliquez un filtre gaussien avec σ = 3 pour lisser le signal. REMARQUE : Le paramètre peut être optimisé en fonction des valeurs recommandées par le système MEA, car un lissage excessif peut entraîner une distorsion des données après l’acquisition, et un lissage trop faible introduirait un bruit indésirable.</li>
	<li>Définissez un seuil pour détecter les pics potentiels comme étant 5 fois l’écart-type du signal lissé par gaussien.</li>
	<li>Calculez la cadence de déclenchement en divisant le nombre de pics enregistrés dans une fenêtre de 50 ms sur les 16 canaux par la longueur de la fenêtre (c’est-à-dire 50 ms). Déplacez la fenêtre le long du signal jusqu’à l’image suivante et répétez le calcul de la cadence de tir (Figure supplémentaire 1).</li>
	<li>Analysez le signal en lisant le temps de sonication FUS à partir des données transférées en fonction de la variation de la cadence de tir associée au FUS.</li>
</ol>5. Nettoyage et réutilisation des plaques MEA multi-puits
<ol><li>Une fois les expériences terminées, utilisez une pipette pour retirer soigneusement le milieu des puits dans la plaque multi-puits, en prenant soin d’éviter la surface de l’électrode.</li>
	<li>Ajouter 2 mL d’eau DG-DI par puits. Aspirez et répétez une fois.</li>
	<li>Pour déloger les cellules et les débris, ajoutez un mélange de 1 g de détergent enzymatique Terg-A-Zyme avec 10 mL d’eau stérile DG-DI (0,3 mL par puits) dans l’assiette. Laissez-le incuber toute la nuit à température ambiante (RT).</li>
	<li>Le lendemain, retirez la solution des puits et rincez-les avec 1 mL d’eau stérile DG-DI.</li>
	<li>Incubez la plaque multi-puits pendant 5 à 7 minutes et aspirez. Répétez cette étape 5 fois.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL d’eau stérile DG-DI par puits. Enregistrez la ligne de base de la plaque multipuits nettoyée pour vérifier que la plaque MEA est propre. Une plaque nettoyée doit présenter des motifs de bruit gaussien avec des valeurs d’intensité faibles.</li>
	<li>Conservez la plaque multipuits nettoyée à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être réutilisée. Changez l’eau dans laquelle les AME sont stockées au moins une fois par mois.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+neuromodulation:+Mechanisms+and+the+potential+of+multimodal+stimulation+for+neuronal+function+assessment.">Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment.</a> Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).</li><li>Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , (2022).</li><li>. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics &amp; Medical Ultrasound Applications. Audible Available from: <a target="_blank" href="https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83">https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83</a> (2021)</li><li>Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+excites+cortical+neurons+via+mechanosensitive+calcium+accumulation+and+ion+channel+amplification.">Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification.</a> Nature Communications. 13 (1), 493 (2022).</li><li>Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. 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Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel. Amir Manbachi enseigne et est consultant pour BK Medical (GE Healthcare) et Neurosonics Medical et est l’inventeur d’un certain nombre de technologies FUS en instance de brevet. Betty Tyler bénéficie d’un financement de recherche du NIH et est copropriétaire d’Accelerating Combination Therapies (y compris des actions ou des options). Ashvattha Therapeutics Inc. a obtenu une licence pour l’un de ses brevets et elle est actionnaire de Peabody Pharmaceuticals.

Ce manuscrit décrit une nouvelle méthode qui peut être utilisée pour enregistrer l’activité neuronale dans les HiPSCs au cours de la neuromodulation FUS. Ce protocole est généralisable à différents transducteurs FUS et systèmes MEA. Pour reproduire les résultats observés avec le protocole décrit, le chercheur doit s’assurer que le point focal du transducteur est plus grand que la surface du fond du puits MEA. De plus, si différentes lignées de cellules neuronales sont utilisées, les paramètres du filtre doivent être ajustés à la réponse en fréquence attendue pour les cellules du puits. S’il n’est pas possible d’obtenir des résultats représentatifs, il faut envisager de modifier les paramètres susmentionnés (par exemple, la durée de l’éclatement, l’intensité, le rapport cyclique, etc.).
Bien que ces travaux aient démontré une augmentation de la cadence de déclenchement après la stimulation FUS, davantage de données doivent être recueillies pour démontrer la répétabilité de ce résultat avant de tirer des conclusions. Ce protocole hérite des limites des systèmes MEA, qui présentent généralement des faiblesses provenant de l’enregistrement direct du signal de courant de microélectrode. Bien que le contact direct avec le neurone offre une meilleure sensibilité, il peut altérer la cellule et affecter la précision de la mesure. De plus, en raison de la petite taille des puits, notre système n’inclut pas de tissu périphérique, qui peut également jouer un rôle dans la neuromodulation17. Cela peut limiter l’applicabilité des conclusions tirées de cette configuration aux environnements in vivo . Pour étudier des réponses de réseau plus complexes, un système MEA à densité de canaux plus élevée doit être conçu pour améliorer sa sensibilité18. Plusieurs orientations futures pour ce système proposé ont été identifiées, y compris l’utilisation d’un portique 3D pour maintenir le transducteur et assurer un placement précis19. D’autres améliorations pourraient être apportées à l’algorithme de post-traitement, notamment l’utilisation d’un algorithme de tri par pics20 pour classer les neurones individuels. Ce processus serait bénéfique pour démêler les réponses des neurones multi-unités dans de futures études sur les mécanismes de la FUS. Plus important encore, il est essentiel d’incorporer des modalités de stimulation supplémentaires, telles que des stimuli chimiques, électriques et optiques, pour élucider les mécanismes sous-jacents. Ces méthodes peuvent modifier les propriétés et les comportements neuronaux, par exemple en inhibant des canaux ioniques spécifiques15 ou en modifiant les caractéristiques de la membrane21. En modulant les principaux facteurs au sein de la voie de signalisation hypothétique, les chercheurs peuvent identifier les contributions de chaque facteur dans des environnements contrôlés et, en fin de compte, faire la lumière sur les interactions complexes en jeu.
La stimulation électrique22 est l’une des techniques de neuromodulation les plus établies, avec une longue histoire d’applications réussies dans les milieux cliniques et de recherche. En revanche, la FUS et l’optogénétique23 sont des modalités relativement nouvelles qui ont attiré l’attention ces dernières années. Les principaux avantages du FUS sont son caractère non invasif et sa capacité à stimuler les neurones à des profondeurs qui peuvent être difficiles à atteindre avec d’autres techniques, y compris la stimulation électrique et l’optogénétique. Cependant, comme l’optogénétique24, FUS présente certaines limites liées à la modélisation de la propagation des ondes et des réponses neuronales associées. Saisir la complexité des propriétés acoustiques hétérogènes des tissus in vivo peut être difficile, ce qui entraîne des incertitudes dans le champ de pression et, par conséquent, dans les réponses neuronales. Cette difficulté à modéliser avec précision ces propriétés représente un défi lors de l’optimisation de la technique pour des applications spécifiques dans le monde réel. Les complexités inhérentes soulignent l’importance des systèmes in vitro comme celui de cette étude, car ils permettent l’étude directe des réponses dans des conditions d’intensité acoustique contrôlée.
En conclusion, ce système fournit une plate-forme in vitro à haut débit pour étudier les effets neuro-modulateurs de FUS sur les neurones humains. Avec ce système, les mécanismes d’action de FUS peuvent être explorés en mesurant les réponses électriques des neurones humains lorsqu’ils sont exposés à différents niveaux et types de stimulation dans un environnement contrôlé. Il s’agit donc d’un outil complémentaire précieux aux modèles humains et animaux couramment utilisés sur le terrain.

Les ultrasons focalisés (FUS) sont une modalité de neuromodulation prometteuse qui permet une stimulation non invasive à des profondeurs centimétriques avec une résolution submillimétrique 1,2,3. Malgré ces atouts, l’impact clinique de la FUS est limité, en partie en raison d’un manque de connaissances sur son mécanisme d’action. En l’absence d’une base théorique solide, les chercheurs et les cliniciens ont du mal à adapter la thérapie pour répondre aux besoins spécifiques de chaque patient dans des conditions variables. Une théorie importante proposée par Yoo et al.4 suggère que les canaux ioniques mécanosensibles sont responsables de l’activation des neurones. Cependant, cette théorie ne parvient pas à expliquer l’activation de FUS dans les neurones cérébraux humains, qui sont dépourvus de ces canaux5. Cette ambiguïté limite l’utilisation de FUS en clinique, car elle empêche le réglage des paramètres FUS pour optimiser les résultats du traitement.
Des études antérieures connexes ont utilisé une gamme d’approches pour étudier les mécanismes physiologiques sous-jacents à la FUS et pour déterminer les paramètres de stimulation optimaux. Une étape cruciale de ce processus consiste à surveiller les réponses neuronales sous forme de rétroaction, ce qui peut être réalisé grâce à des méthodes impliquant la surveillance de la porte ionique, telles que l’imagerie ioniquecalcium 4, l’imagerie optique1 et l’enregistrement électrophysiologique ex vivo (par exemple, l’électromyographie6 ou l’électrophysiologie peau-nerf7). Cependant, la plupart de ces études utilisent des neurones non humains ou des approches in vivo, ce qui peut introduire des variances supplémentaires en raison de contrôles sous-optimaux. En revanche, l’utilisation d’électrodes pour mesurer les signaux neuronaux dans les neurones des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSC) in vitro offre des mesures plus sensibles et un meilleur contrôle de l’environnement expérimental. Dans ce travail, un système in vitro a été développé à l’aide de réseaux de micro-électrodes (MEA) pour mesurer les réponses électriques des neurones HiPSC après une stimulation FUS, comme le montre la figure 1. Ce système permet aux chercheurs de la communauté de surveiller les réponses neuronales lorsqu’ils font varier les paramètres de l’échographie (p. ex., fréquence, durée de la rafale, intensité). De plus, ce système permet un haut niveau de contrôle de la sensibilité neuronale aux stimuli physiques (par exemple, la température, la pression et la cavitation)8,9, car la fonctionnalité des canaux ioniques des neurones peut être manipulée génétiquement et pharmaceutiquement (par exemple, en utilisant du gadolinium pour inhiber les canaux ioniques)10,11,12. Ce contrôle au niveau moléculaire peut aider à élucider les mécanismes à l’origine des effets neuromodulateurs du FUS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEA System</td>
			<td>Axion Biosystem Inc.</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td>Sampling Rate: 11500 Hz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA Plate</td>
			<td>Axion Biosystem Inc.</td>
			<td>CytoView MEA</td>
			<td>Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate Interface</td>
			<td>Amcor Inc.</td>
			<td>Parafilm PM996; P7793</td>
			<td>Thickness: 127 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tank and Regulator for culture</td>
			<td>AirGas Inc./ Harris Inc.</td>
			<td>9296NC</td>
			<td>Concentration: 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher Inc.</td>
			<td>Laminin; 23017-015</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPSC Neurons</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>CIPS and GM01582 Derived; 450-10</td>
			<td>Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>CTX250; 008</td>
			<td>Center Frequency: 250 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matching Network</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>CTX250; NFS102v2</td>
			<td>Impedance: 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer Power Output (TPO)</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>Version 4.1; 020</td>
			<td>Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>McMaster Inc.</td>
			<td>Silicone Rubber; 5542N115</td>
			<td>Thickness: 0.0127 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Gel</td>
			<td>Parker Laboratory Inc.</td>
			<td>Aquasonic 100; B08DDWG GXB</td>
			<td>Viscosity: 130,000&#8211;185,000 cops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connection to Probe holder</td>
			<td>McMaster Inc.</td>
			<td>Steal Threaded Rod; 90322A661</td>
			<td>Length: 1&#8211;1/2&#34; Long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Inc.</td>
			<td>Sorvall Legend X1R; 75004261</td>
			<td>Max acceleration: 10&#8211;25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>Y-104; 009</td>
			<td>Range: 50 kHz&#8211;1.9 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Tank</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>WT</td>
			<td>Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Conditioning Unit</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>WCU; SN006</td>
			<td>Flow Velocity: 50 mL/s maximum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Rohde-Schwarz Inc.</td>
			<td>RTC1002</td>
			<td>Sampling rate: Up to 50 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>MicroStage; 2</td>
			<td>Accuracy: 1 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermochromic sheet</td>
			<td>TIPTEMP Inc.</td>
			<td>Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337</td>
			<td>Range: 22&#8211;24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Microsoft Surface</td>
			<td>Surface Pro</td>
			<td>CPU i5 1035G4: 3.7 GHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Transfer Software</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Version 2021b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing Software</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td>Python</td>
			<td>Version 3.7.10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound neuromodulation of human in vitro neural cultures in multi-well microelectrode arrays

Les effets neuromodulateurs des ultrasons focalisés (FUS) ont été démontrés dans des modèles animaux, et FUS a été utilisé avec succès pour traiter les troubles du mouvement et psychiatriques chez l’homme. Cependant, malgré le succès de la FUS, le mécanisme sous-jacent à ses effets sur les neurones reste mal compris, ce qui rend difficile l’optimisation du traitement par l’ajustement des paramètres FUS. Pour combler cette lacune dans les connaissances, nous avons étudié des neurones humains in vitro à l’aide de neurones cultivés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSC). L’utilisation des HiPSC permet d’étudier les comportements neuronaux spécifiques à l’homme dans les états physiologiques et pathologiques. Ce rapport présente un protocole d’utilisation d’un système à haut débit qui permet de surveiller et de quantifier les effets neuromodulateurs de FUS sur les neurones HiPSC. En faisant varier les paramètres FUS et en manipulant les neurones HiPSC par des modifications pharmaceutiques et génétiques, les chercheurs peuvent évaluer les réponses neuronales et élucider les effets neuromodulateurs de FUS sur les neurones HiPSC. Cette recherche pourrait avoir des implications importantes pour le développement de thérapies sûres et efficaces à base de FUS pour une gamme de troubles neurologiques et psychiatriques.

En résumé, nous présentons un protocole qui permet le suivi in vitro de la neuromodulation FUS à l’aide de neurones cultivés à partir de HiPSCs. La figure 1 présente la plate-forme globale du système permettant de stimuler les neurones induits par HiPSC et d’enregistrer les réponses électriques correspondantes à des fins d’analyse. Cette étude se concentre sur la stimulation FUS des neurones et l’enregistrement des réponses électriques dans un système MEA, comme le montre la figure 2. Les composants périphériques des systèmes FUS et MEA et leurs connexions sont illustrés à la figure 3.
La caractérisation du point focal est effectuée avant les expériences neuronales pour s’assurer que le fond du puits est entièrement recouvert par le point focal FUS. La visualisation de la tache focale sur des feuilles thermochromiques, comme le montre la figure 4, doit être effectuée pour évaluer le système FUS. Après la caractérisation des points focaux, les étapes de post-traitement, y compris le filtrage, le seuillage et le calcul de la cadence de tir, doivent être effectuées, et elles sont résumées dans les figures 5 et 6. Ces étapes sont essentielles pour récupérer des signaux utiles en filtrant le bruit de l’environnement et, ainsi, pour mieux comprendre les changements d’activité neuronale causés par le FUS. Les diagrammes raster de la figure 6A-B montrent les pics détectés dans chaque canal. Comme tout le fond du puits se trouve à l’intérieur du point focal du transducteur FUS, on s’attend à ce que le FUS modifie la cadence de mise à feu de toutes les électrodes. Ce changement de cadence de déclenchement est visualisé dans le graphique de la cadence de tir de la figure 6C, qui montre que les paramètres de stimulation choisis ont entraîné une augmentation de la cadence de déclenchement neuronal. Plus précisément, la cadence de tir pré-FUS (c’est-à-dire de base) était de 140 Hz ± 116,7 Hz, tandis que la cadence de tir post-FUS était de 786 Hz ± 419,4 Hz avec FUS à ondes continues. De plus, la figure 6C montre comment la modification des paramètres FUS (par exemple, en utilisant un FUS à ondes pulsées au lieu d’ondes continues) peut modifier l’ampleur du changement de la fréquence de déclenchement, ainsi que le temps avant que les neurones ne reviennent à leur état de base. Les ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) ne provoquent pas de réchauffement significatif des cultures, en particulier par rapport aux ultrasons focalisés de haute intensité, qui visent à obtenir une lésion thermique. L’absence de changement de température ayant un impact clinique est étayée par des calculs théoriques et des simulations (figure supplémentaire 2). Même dans les cas extrêmes des paramètres FUS expérimentaux énumérés dans le tableau 1, seule une augmentation minime de la température a pu être observée d’environ 0,04 °C.
L’utilisation d’un diagramme de fréquence de tir permet de quantifier les effets neuromodulateurs de FUS et peut être utilisé pour différencier les réponses excitatrices et inhibitrices. Un avantage significatif de la plaque MEA multi-puits est qu’elle peut être réutilisée plusieurs fois pour étudier différents états neuronaux et paramètres de stimulation à haut débit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la plateforme in vitro pour la neuromodulation par ultrasons focalisés (FUS) des neurones dans un puits et la mesure de leur activité neuronale à l’aide d’un réseau de microélectrodes. Chaque électrode (lignes rouges, vertes et bleues) enregistre à partir d’une population de neurones à l’intérieur d’un seul puits. Un pipeline de traitement est mis en œuvre pour convertir les enregistrements électriques neuronaux bruts en la détection de modèles de décharge neuronale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig02.jpg"> Figure 2 : Neuromodulation FUS avec un réseau de microélectrodes multi-puits (MEA). (A) Schéma de la configuration de la neuromodulation FUS avec un MEA multi-puits. Les ondes acoustiques générées par le transducteur FUS se propagent à travers un cône FUS rempli d’eau dégazée et sont couplées à l’aide d’un gel à ultrasons. Le parafilm est fixé au puits à l’aide d’un élastique pour éviter toute contamination. La plaque MEA envoie des enregistrements électriques des neurones au système MEA. (B) Une photographie du transducteur FUS sur la plaque multipuits contenue dans le système MEA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig03.jpg"> Figure 3 : Configuration de la plate-forme in vitro. (A) L’avant de la configuration de la plate-forme in vitro. La puissance de sortie du transducteur (TPO ; gauche) est utilisée pour programmer les paramètres FUS. Le système MEA (à droite) enregistre l’activité électrique des neurones de la plaque du puits, qui sont neuromodulés par le transducteur FUS. (B) L’arrière de la plate-forme in vitro avec des connexions du réseau correspondant (1) au TPO et (2) au transducteur. (3) La connexion du système MEA au TPO synchronise l’acquisition des données. (4) La connexion du système MEA à l’ordinateur pour le transfert de données. (5) La connexion d’alimentation au système MEA. (6) La connexion d’alimentation au système FUS. (7) Le bouton de sonication. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig04v2.jpg"> Figure 4 : Caractérisation du transducteur FUS. (A) Une carte de pression du point focal à l’aide des paramètres FUS détaillés dans le tableau 1 mesurés par le système AMPLITUDE15. (B) Pré- et post-sonication d’une feuille thermochromique placée au fond d’un puits à l’aide du dispositif expérimental représenté à la figure 3. La feuille thermochromique change de couleur en réponse aux changements de température, ce qui fournit une validation visuelle de la stimulation réussie à l’emplacement des neurones. L’intensité moyenne maximale de l’impulsion de crête spatiale (ISPPA) de 30 W/cm2 et la sonication continue de 3 min ont été ajustées pour modifier radicalement la température locale afin de mieux visualiser un tel point focal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig05.jpg"> Figure 5 : Pipeline de traitement. Étape 1 : Les enregistrements électriques bruts sont capturés à partir de N = 16 canaux. Les étapes suivantes montrent le processus à l’aide du canal 16 (encadré en rouge). Étape 2 : Pour chaque canal, un filtre passe-bande de Butterworth (passe-bande de 5 Hz à 3 kHz) est appliqué, suivi d’un filtre gaussien (σ = 3). Un seuil est fixé à cinq fois l’écart-type du signal dans une fenêtre de 2 s centrée au début de la sonication. Étape 3 : Les signaux au-dessus ou au-dessous du seuil sont caractérisés comme des pics. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig06.jpg"> Figure 6 : Tracés de trame et de cadence de tir. (A) Tracé matriciel des pics détectés à chaque canal en fonction du temps de sonication. L’heure de la stimulation FUS est annotée à l’aide d’une ligne rouge. (B) Tracé matriciel de neurones sous différents paramètres FUS avec FUS continu à des fins de comparaison. (C) La cadence de tir a été calculée à l’aide d’une fenêtre glissante de 50 ms. Les taux moyens de déclenchement avant et après les neuromodulations FUS étaient respectivement de 140 Hz et 786 Hz. Avec le FUS pulsé, les cadences moyennes de tir étaient de 230 Hz et 540 Hz. On a observé qu’une activation plus courte et un changement de vitesse moindre étaient induits par cet ensemble de stimulations FUS variables. Le processus de calcul de la cadence de tir est détaillé dans la figure supplémentaire 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Paramètre</td>
			<td>Valeur</td>
		</tr><tr><td>Puissance max.</td>
			<td>1.200 W</td>
		</tr><tr><td>Préel</td>
			<td>0,749 W/canal.</td>
		</tr><tr><td>J’ai SPPA</td>
			<td>10,79 W/cm2</td>
		</tr><tr><td>ISPTA</td>
			<td>0,05 W/cm2</td>
		</tr><tr><td>Longueur de rafale</td>
			<td>0,100 ms</td>
		</tr><tr><td>Fréquence</td>
			<td>250.00 kHz</td>
		</tr><tr><td>Foyer</td>
			<td>39.800 millimètre</td>
		</tr><tr><td>Période</td>
			<td>20 000 ms</td>
		</tr><tr><td>Minuteur</td>
			<td>60.000 s</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Paramètres des ultrasons focalisés (FUS) réglés sur le TPO pour l’étude présentée à la figure 4.
Figure supplémentaire 1 : Traitement du tracé raster à la cadence de tir. Étape 1 : Comptez les pointes parmi tous les canaux pour obtenir le nombre de comptages dans une fenêtre coulissante donnée. Remarque : Ici, une fenêtre coulissante plus grande (réglée sur 0,1 s) a été choisie pour une meilleure illustration. Étape 2 : Convertissez les pics par longueur de fenêtre en pics par seconde (par exemple, ici, multipliez les nombres par 10 pour les convertir en hertz [Hz], puis divisez-les par 1 000 pour obtenir la valeur en kilohertz [kHz]). Etape 3 : La courbe de cadence de tir acquise en conséquence. Une boîte à outils open source, ainsi que des exemples de données, sont disponibles sur GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Profil de température du résultat de la simulation de l’onde K du LIFU16. Sur la base de la carte d’intensité acoustique présentée à la figure 4, le résultat de la simulation de l’onde K suggère une augmentation maximale de la température de 0,04 °C dans la région centrale de la zone focale (rayon : 2 mm) en utilisant le cas extrême des paramètres FUS expérimentaux énumérés dans le tableau 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

Nous présentons ici un protocole d’utilisation d’un système à haut débit qui permet de surveiller et de quantifier les effets neuromodulateurs des ultrasons focalisés sur les neurones des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSC).

Neuromodulation par ultrasons focalisés de cultures neuronales humaines in vitro dans des réseaux de microélectrodes multipuits

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

Neuromodulation par ultrasons focalisés. Ce domaine passionnant en plein essor fait l’objet d’études en cours Dans le domaine des ultrasons focalisés, les paramètres de stimulation optimaux pour une application particulière sont souvent inconnus. Cette étude vise à une détermination systématique de ces paramètres par des tests empiriques in vitro sur les neurones.Cette méthode permet d’explorer le mécanisme neuronal sous-jacent à la neuromodulation par sons en permettant aux chercheurs d’analyser les réponses des neurones génétiquement et pharmaceutiquement modifiés. Pour commencer, aspirer le milieu de culture pour remplir un seul puits dans une plaque de culture de neurones à 24 puits, ayant des réseaux de micro-électrodes intégrés ou MEA. Après avoir préparé 300 millilitres d’eau dégazée et déminéralisée, remplissez-la soigneusement dans le cône à ultrasons focalisés ou à transducteur FUS.À l’aide d’une tige filetée personnalisée, fixez le support imprimé en 3D à un cadre. Positionnez le cadre de manière à ce que la tête du transducteur FUS soit au-dessus du puits qui sera stimulé. À l’aide d’un élastique, fixer le paraforme au-dessus du puits sur la plaque MEA à 24 puits contenant le milieu et les cellules souches pluripotentes induites humaines ou HIPSC.Réglez les paramètres FUS sur la sortie de puissance du transducteur ou sur le panneau de commande TPO. Les valeurs des différents paramètres sont mentionnées à l’écran. Ensuite, appliquez le gel de couplage sur le dessus du paraforme sur le puits et abaissez le transducteur FUS dans le gel de couplage en assurant le contact avec le gel avec un minimum de bulles d’air.Démarrez la sonication FUS en appuyant sur le bouton inférieur droit du TPO et attendez au moins cinq minutes entre chaque tour de sonication pour permettre aux neurones de revenir à un état de base. Si la connexion est appropriée, l’impulsion de déclenchement générée par le système FUS alignera automatiquement la séquence de stimulation FUS avec l’enregistrement MEA. Analysez le signal en lisant le temps de sonication FUS avec les données de transfert en fonction de la variation de la cadence de tir associée au FUS.Le point focal FUS a été caractérisé à la fois par sa visualisation sur des feuilles thermochromatiques et par balayage d’hydrophone d’eau. Les étapes de post-traitement, y compris le filtrage, le seuillage et le calcul de la cadence de déclenchement, ont filtré le bruit de l’environnement pour révéler les changements d’activité neuronale causés par FUS. Les diagrammes matriciels ont montré les pics détectés dans chaque canal.Le tracé de la fréquence de déclenchement a montré que les paramètres de stimulation choisis augmentaient la cadence de déclenchement neuronal. La cadence de tir avant FUS était de 140 hertz, tandis que la cadence de tir après FUS était de 786 hertz avec FUS à onde continue. La modification du mode de sonication FUS a également modifié le temps avant que les neurones ne reviennent à leur état de base.Il est crucial de minimiser soigneusement la formation de bulles lors du placement du transducteur sur l’interface du paraforme. Un autre élément à prendre en compte est la puissance électrique fournie au transducteur. La puissance doit être suffisamment élevée pour induire un effet, mais doit être suffisamment faible pour ne pas endommager le transducteur ou la cellule.Cette technique pourrait identifier le paramètre de stimulation optimal pour traiter la maladie de Parkinson et d’autres troubles neurologiques, éliminant ainsi le risque associé à la chirurgie invasive, y compris les dommages irréversibles, la longue récupération et le temps de rééducation. Des efforts supplémentaires pour découvrir son mécanisme et contrôler l’optimisation préclinique sont nécessaires pour garantir la sécurité dans les études futures, y compris les essais cliniques.

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Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

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