Name: focused ultrasound neuromodulation of human in vitro neural cultures in multi-well microelectrode arrays
Uploaded: 2024-05-03T12:40:00
Duration: 4 min
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अमीर मनबाची और नीतीश ठाकोर ने डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी, डीएआरपीए, अवार्ड कॉन्ट्रैक्ट: N660012024075 से फंडिंग सपोर्ट स्वीकार किया। इसके अलावा, आमिर मनबाची जॉन्स हॉपकिन्स इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल रिसर्च (ICTR) के क्लिनिकल रिसर्च स्कॉलर्स प्रोग्राम (KL2) से फंडिंग सपोर्ट को स्वीकार करते हैं, जो नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज (NCATS), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) द्वारा प्रशासित है। नीतीश ठाकोर ने राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से वित्त पोषण सहायता को स्वीकार किया: R01 HL139158-01A1 और R01 HL071568-15।

1. सामग्री की तैयारी
<ol><li>संस्कृति माध्यम महाप्राण, और एम्बेडेड विदेश मंत्रालय(चित्रा 2ए)के साथ एक 24 अच्छी तरह से न्यूरॉन संस्कृति प्लेट में एक भी अच्छी तरह से भरने के लिए इसका इस्तेमाल करें. संस्कृति और Taga एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद न्यूरॉन्स प्रेरित.13.</li>
	<li>पैराफिल्म इंटरफ़ेस, रबर बैंड, और FUS शंकु को 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करके अपनी रबर झिल्ली के साथ जीवरश्लेषित करें, और उन्हें बाद में असेंबली के लिए धूआं हुड में रखें।</li>
	<li>Degas 300 एमएल विआयनीकृत पानी और 50 एमएल युग्मन जेल। युग्मन माध्यम के भीतर गुहिकायन उत्प्रेरण से बचने के लिए 5 मिनट के लिए 160 x ग्राम पर पानी और जेल अपकेंद्रित्र. नोट: HiPSCs का मूल स्रोत GM01582 और CIPS सेल लाइनों से है। औसतन, 5 x 104 मोटर न्यूरॉन्स और 2.5 x 104 एस्ट्रोसाइट्स प्रति अच्छी तरह सेघनत्व 14 प्राप्त किया जा सकता है।</li>
</ol>2. बाह्य उपकरणों का कनेक्शन और सेटअप
<ol><li>शिकंजा का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर के लिए FUS शंकु को सुरक्षित करें, और शंकु को हवादार बाँझ हुड में एक लचीली रबर झिल्ली के साथ सील करें। चरण 1.3 से degassed और deionized (DG-DI) पानी के साथ शंकु भरें, और cavitation से बचने के लिए शंकु में बुलबुले की अनुपस्थिति सुनिश्चित करें.</li>
	<li>3 डी-मुद्रित धारक को एक फ्रेम(चित्रा 2बी)को सुरक्षित करने के लिए एक अनुकूलित थ्रेडेड रॉड का उपयोग करें। फ्रेम को इस तरह रखें कि FUS ट्रांसड्यूसर का सिर उस कुएं के ऊपर हो जो उत्तेजित हो जाएगा।</li>
	<li>मध्यम और HiPSCs युक्त 24 अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय प्लेट पर अच्छी तरह से अच्छी तरह से parafilm सुरक्षित करने के लिए एक रबर बैंड का प्रयोग करें.</li>
	<li>अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के बैक-एंड ड्राइवर इलेक्ट्रॉनिक्स को जोड़कर एफयूएस सिस्टम तैयार करें, इस मामले में, ट्रांसड्यूसर पावर आउटपुट (टीपीओ; चित्रा 3 ए), एक 100-240 वी पावर आउटलेट (चित्रा 3 बी, कनेक्शन 6) के लिए और टीपीओ और एफयूएस ट्रांसड्यूसर (चित्रा 3 बी, कनेक्शन 1 और कनेक्शन 2, क्रमशः) से मिलान नेटवर्क को जोड़ना। मिलान नेटवर्क ट्रांसड्यूसर और टीपीओ के बीच कुशल विद्युत युग्मन सुनिश्चित करता है।</li>
	<li>विदेश मंत्रालय प्रणाली को पावर आउटलेट (100-240 वी) (चित्र 3बी, कनेक्शन 5) से कनेक्ट करें। विदेश मंत्रालय प्रणाली तुल्यकाकरण पोर्ट को टीपीओ से कनेक्ट करें (चित्र 3बी, कनेक्शन 3)। यह कनेक्शन विदेश मंत्रालय प्रणाली द्वारा डेटा अधिग्रहण को FUS उत्तेजना के साथ सिंक्रनाइज़ करेगा।</li>
	<li>विदेश मंत्रालय प्रणाली में 24-अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय प्लेट रखें, और ट्रांसड्यूसर और कुएं के बीच सीधे संपर्क को सक्षम करने के लिए ढक्कन को हटा दें। चरण 3.2(चित्रा 3ए और चित्रा 2बी)में वर्णित के रूप में, अच्छी तरह से प्लेट के ऊपर ट्रांसड्यूसर 5-10 मिमी रखें, degassed युग्मन जेल के लिए कमरे की अनुमति देने के लिए.</li>
</ol>3. उत्तेजना और न्यूरोनल संकेत अधिग्रहण
<ol><li>TPO नियंत्रण कक्ष (तालिका 1) पर FUS पैरामीटर सेट करें।</li>
	<li>पैराफिल्म के शीर्ष पर युग्मन जेल लागू करें, और युग्मन जेल में एफयूएस ट्रांसड्यूसर को कम करें, न्यूनतम हवा के बुलबुले(चित्रा 2ए)के साथ जेल के साथ संपर्क सुनिश्चित करें।</li>
	<li>यूजर इंटरफेस पर स्टार्ट बटन पर क्लिक करके एमईए सिस्टम रिकॉर्डिंग शुरू करें।</li>
	<li>टीपीओ (चित्रा 3 ए, लेबल 7) पर नीचे दाएं बटन दबाकर एफयूएस सोनिकेशन शुरू करें, और न्यूरॉन्स को आधारभूत स्थिति में लौटने की अनुमति देने के लिए सोनिकेशन के प्रत्येक दौर के बीच कम से कम 5 मिनट प्रतीक्षा करें।</li>
	<li>विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग(चित्रा 3बी, कनेक्शन 3)के लिए FUS उत्तेजना अनुक्रम संरेखित करने के लिए FUS प्रणाली द्वारा उत्पन्न ट्रिगर पल्स का उपयोग करें.</li>
</ol>4. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण
<ol><li>USB कनेक्शन (चित्र 3B, कनेक्शन 4) का उपयोग करके विदेश मंत्रालय प्रणाली से डेटा को कंप्यूटर में स्थानांतरित करें। प्रयोग सेट अप पैनल पर क्लिक करके इसे शुरू करें। इसके बाद, वह डेटा प्रकार चुनें जिसे कोई रिकॉर्ड करना चाहता है। इस मामले में, कच्चे स्पाइक्स की सिफारिश की जाती है। अंत में, फ़ाइल को नाम दें, और स्थानांतरण को पूरा करने के लिए डिस्क ड्राइव के भीतर वांछित स्थान का चयन करें। नोट: https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod में जारी पायथन स्क्रिप्ट चलाकर निम्न चरणों का पालन किया जा सकता है।</li>
	<li>16 इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक से डेटा में पढ़ें.</li>
	<li>बटरवर्थ बैंडपास फ़िल्टर को 5 हर्ट्ज से 3 किलोहर्ट्ज़ बैंडविड्थ के साथ बटरवर्थ ऑर्डर के साथ 8 के बटरवर्थ ऑर्डर के साथ लागू करें। नोट: इन मूल्यों को अनुकूलित करने के लिए, विशिष्ट कोशिकाओं की फायरिंग दर और शामिल कोशिकाओं की संख्या को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। इन 2 मूल्यों को गुणा करके, एक प्रयोग में सेल आबादी के समग्र फायरिंग दर का अनुमान लगा सकते हैं.</li>
	<li>सिग्नल को सुचारू करने के लिए σ = 3 के साथ एक गाऊसी फ़िल्टर लागू करें। नोट: पैरामीटर को विदेश मंत्रालय प्रणाली से अनुशंसित मूल्यों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, क्योंकि अत्यधिक चौरसाई के परिणामस्वरूप अधिग्रहण के बाद डेटा विरूपण हो सकता है, और बहुत कम चौरसाई अवांछित शोर का परिचय देगी।</li>
	<li>गाऊसी-चिकने सिग्नल के मानक विचलन के 5 गुना के रूप में संभावित स्पाइक्स का पता लगाने के लिए एक सीमा निर्धारित करें।</li>
	<li>खिड़की की लंबाई (यानी, 50 एमएस) द्वारा सभी 16 चैनलों में 50 एमएस विंडो में पंजीकृत स्पाइक्स की संख्या को विभाजित करके फायरिंग दर की गणना करें। अगले फ्रेम के लिए संकेत के साथ खिड़की पाली, और फायरिंग दर गणना (अनुपूरक चित्रा 1) दोहराएँ.</li>
	<li>FUS से जुड़ी फायरिंग दर में परिवर्तन के आधार पर स्थानांतरित डेटा से FUS सोनिकेशन समय पढ़कर सिग्नल का विश्लेषण करें।</li>
</ol>5. बहु-अच्छी तरह से एमईए प्लेट की सफाई और पुन: उपयोग
<ol><li>एक बार प्रयोगों पूरा कर रहे हैं, ध्यान से इलेक्ट्रोड सतह से बचने के लिए ध्यान रखना, बहु अच्छी तरह से थाली में कुओं से माध्यम को हटाने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें.</li>
	<li>प्रति कुएं में 2 एमएल डीजी-डीआई पानी डालें। महाप्राण और एक बार दोहराएं।</li>
	<li>किसी भी कोशिकाओं और मलबे को नापसंद करने के लिए, प्लेट में बाँझ डीजी-डीआई पानी (0.3 एमएल प्रति कुआं) के 10 एमएल के साथ एंजाइमी डिटर्जेंट टेर्ग-ए-जाइम के 1 ग्राम का मिश्रण जोड़ें। इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर सेते रहने दें।</li>
	<li>अगले दिन, कुओं से समाधान को हटा दें, और उन्हें बाँझ डीजी-डीआई पानी के 1 एमएल के साथ कुल्ला।</li>
	<li>5-7 मिनट के लिए बहु अच्छी तरह से थाली सेते हैं, और महाप्राण. इस चरण को 5 बार दोहराएं।</li>
	<li>प्रति कुएं बाँझ डीजी-डीआई पानी के 0.5 एमएल जोड़ें। साफ बहु अच्छी तरह से थाली की आधार रेखा रिकॉर्ड करने के लिए मान्य है कि विदेश मंत्रालय थाली साफ है. एक साफ प्लेट कम तीव्रता मूल्यों के साथ गाऊसी शोर पैटर्न प्रदर्शित करना चाहिए.</li>
	<li>साफ बहु अच्छी तरह से थाली 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक यह फिर से इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. विदेश मंत्रालय में प्रति माह कम से कम एक बार संग्रहीत पानी को बदलें।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+neuromodulation:+Mechanisms+and+the+potential+of+multimodal+stimulation+for+neuronal+function+assessment.">Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment.</a> Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).</li><li>Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , (2022).</li><li>. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics &amp; Medical Ultrasound Applications. 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लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है। अमीर मनबाची बीके मेडिकल (जीई हेल्थकेयर) और न्यूरोसोनिक्स मेडिकल के लिए सिखाता है और परामर्श करता है और कई पेटेंट-लंबित एफयूएस प्रौद्योगिकियों पर एक आविष्कारक है। बेट्टी टायलर के पास एनआईएच से अनुसंधान निधि है और त्वरित संयोजन चिकित्सा (इक्विटी या विकल्प सहित) का सह-मालिक है। अश्वत्था थेरेप्यूटिक्स इंक ने अपने एक पेटेंट को लाइसेंस दिया है और वह पीबॉडी फार्मास्यूटिकल्स के लिए एक शेयरधारक है।

यह पांडुलिपि एक उपन्यास विधि का वर्णन करती है जिसका उपयोग एफयूएस न्यूरोमॉड्यूलेशन के दौरान हिपीएससी में न्यूरोनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न FUS ट्रांसड्यूसर और MEA सिस्टम के लिए सामान्य है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ देखे गए परिणामों को दोहराने के लिए, शोधकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ट्रांसड्यूसर का केंद्र बिंदु विदेश मंत्रालय के नीचे के क्षेत्र से अधिक है। इसके अलावा, यदि विभिन्न न्यूरोनल सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो फिल्टर मापदंडों को अच्छी तरह से कोशिकाओं के लिए अपेक्षित आवृत्ति प्रतिक्रिया के लिए ट्यून किया जाना चाहिए। यदि प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं, तो किसी को उपरोक्त मापदंडों (जैसे, फट लंबाई, तीव्रता, कर्तव्य चक्र, आदि) को संशोधित करने पर विचार करना चाहिए।
हालांकि इस काम ने एफयूएस उत्तेजना के बाद फायरिंग दर में वृद्धि का प्रदर्शन किया, लेकिन किसी भी निष्कर्ष को निकालने से पहले इस खोज की पुनरावृत्ति को प्रदर्शित करने के लिए अधिक डेटा एकत्र किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल विदेश मंत्रालय प्रणालियों की सीमाओं को विरासत में मिला है, जिसमें आमतौर पर प्रत्यक्ष माइक्रोइलेक्ट्रोड वर्तमान सिग्नल रिकॉर्डिंग से उत्पन्न कमजोरियां होती हैं। हालांकि न्यूरॉन के साथ सीधा संपर्क बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है, यह सेल को बदल सकता है और माप सटीकता को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, कुओं के छोटे आकार के कारण, हमारी प्रणाली में परिधीय ऊतक शामिल नहीं है, जो न्यूरोमॉड्यूलेशन17में भी भूमिका निभा सकता है। यह इस सेटअप से निकाले गए निष्कर्षों की प्रयोज्यता को विवो वातावरण में सीमित कर सकता है। अधिक जटिल नेटवर्क प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, एक उच्च चैनल घनत्व विदेश मंत्रालय प्रणाली अपनी संवेदनशीलता18 में सुधार करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. इस प्रस्तावित प्रणाली के लिए कई भविष्य दिशाओं की पहचान की गई है, जिसमें ट्रांसड्यूसर को पकड़ने और सटीक प्लेसमेंट19 सुनिश्चित करने के लिए 3 डी गैन्ट्री का उपयोग करना शामिल है। पोस्ट-प्रोसेसिंग एल्गोरिथ्म के संबंध में अतिरिक्त सुधार किए जा सकते हैं, जिसमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को वर्गीकृत करने के लिए स्पाइकिंग सॉर्टिंग एल्गोरिदम20 का उपयोग करना शामिल है। यह प्रक्रिया FUS के तंत्र पर भविष्य के अध्ययनों में बहु-इकाई न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए फायदेमंद होगी। सबसे महत्वपूर्ण बात, अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक, विद्युत और ऑप्टिकल उत्तेजनाओं जैसे उत्तेजना के अतिरिक्त तौर-तरीकों को शामिल करना आवश्यक है। इन तरीकों न्यूरोनल गुणों और व्यवहार बदल सकते हैं, इस तरह के विशिष्ट आयन चैनलों15 को बाधित या झिल्ली विशेषताओं21 को संशोधित करके जैसे. परिकल्पित सिग्नलिंग मार्ग के भीतर मुख्य कारकों को संशोधित करके, शोधकर्ता नियंत्रित वातावरण में प्रत्येक कारक के योगदान की पहचान कर सकते हैं और अंततः, खेल में जटिल बातचीत पर प्रकाश डाल सकते हैं।
विद्युत उत्तेजना22 न्यूरोमॉड्यूलेशन के लिए सबसे स्थापित तकनीकों में से एक है, जिसमें नैदानिक और अनुसंधान सेटिंग्स में सफल अनुप्रयोगों का एक लंबा इतिहास है। इसके विपरीत, FUS और ऑप्टोजेनेटिक्स23 अपेक्षाकृत नए तौर-तरीके हैं जिन्होंने हाल के वर्षों में ध्यान आकर्षित किया है। FUS के प्रमुख लाभ इसकी गैर-इनवेसिवनेस और गहराई पर न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने की क्षमता है जो विद्युत उत्तेजना और ऑप्टोजेनेटिक्स सहित अन्य तकनीकों तक पहुंचना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक्स24 की तरह, एफयूएस में तरंग प्रसार और संबंधित न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के मॉडलिंग से संबंधित कुछ सीमाएं हैं। विवो में ऊतक के विषम ध्वनिक गुणों की जटिलता को पकड़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो दबाव क्षेत्र में अनिश्चितताओं की ओर जाता है और, परिणामस्वरूप, न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं में। इन गुणों को सटीक रूप से मॉडलिंग करने में यह कठिनाई विशिष्ट वास्तविक दुनिया के अनुप्रयोगों के लिए तकनीक का अनुकूलन करते समय एक चुनौती प्रस्तुत करती है। अंतर्निहित जटिलताएं इस अध्ययन में एक की तरह इन विट्रो सिस्टम के महत्व पर जोर देती हैं, क्योंकि वे नियंत्रित ध्वनिक तीव्रता स्थितियों के तहत प्रतिक्रियाओं के प्रत्यक्ष अध्ययन को सक्षम करते हैं।
अंत में, यह प्रणाली मानव न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म में एक उच्च-थ्रूपुट प्रदान करती है। इस प्रणाली के साथ, एफयूएस की कार्रवाई के तंत्र को मानव न्यूरॉन्स से विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापकर पता लगाया जा सकता है जब एक नियंत्रित वातावरण में विभिन्न स्तरों और उत्तेजना के प्रकारों के संपर्क में आता है। इसलिए, यह आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले मानव और पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान पूरक उपकरण प्रदान करता है।

फोकस्ड अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) एक आशाजनक न्यूरोमॉड्यूलेशन मोडेलिटी है जो उप-मिलीमीटर रिज़ॉल्यूशन 1,2,3 के साथ सेंटीमीटर-स्तर की गहराई पर गैर-इनवेसिव उत्तेजना को सक्षम बनाता है। इन शक्तियों के बावजूद, FUS का नैदानिक प्रभाव सीमित है, आंशिक रूप से इसकी क्रिया के तंत्र के बारे में ज्ञान की कमी के कारण। एक ठोस सैद्धांतिक नींव के बिना, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों को अलग-अलग परिस्थितियों में व्यक्तिगत रोगियों की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए चिकित्सा को तैयार करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। यू एट अल 4 द्वारा प्रस्तावित एक प्रमुख सिद्धांत से पता चलता है कि न्यूरॉन सक्रियण के लिए मैकेनोसेंसिटिव आयन चैनल जिम्मेदार हैं। हालांकि, यह सिद्धांत मानव मस्तिष्क न्यूरॉन्स में एफयूएस सक्रियण की व्याख्या करने में विफल रहता है, जिसमें इन चैनलोंकी कमी होती है। यह अस्पष्टता क्लिनिक में FUS के उपयोग को सीमित करती है, क्योंकि यह उपचार परिणामों को अनुकूलित करने के लिए FUS मापदंडों की ट्यूनिंग को रोकती है।
पूर्व संबंधित अध्ययनों ने एफयूएस को कम करने वाले शारीरिक तंत्र की जांच करने और इष्टतम उत्तेजना मापदंडों को निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया है। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम प्रतिक्रिया के रूप में न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की निगरानी शामिल है, जो आयन-गेट निगरानी से जुड़े तरीकों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कैल्शियम आयन इमेजिंग4, ऑप्टिकल इमेजिंग1, और पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (जैसे, इलेक्ट्रोमोग्राफी6 या त्वचा-तंत्रिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी7)। हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययन गैर-मानव न्यूरॉन्स या विवो दृष्टिकोण में उपयोग करते हैं, जो उप-इष्टतम नियंत्रणों के कारण अतिरिक्त विचरण पेश कर सकते हैं। इसके विपरीत, इलेक्ट्रोड का उपयोग इन विट्रो मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में न्यूरोनल संकेतों को मापने के लिए (HiPSC) न्यूरॉन्स अधिक संवेदनशील माप और प्रयोगात्मक वातावरण पर अधिक से अधिक नियंत्रण प्रदान करता है. इस काम में, एक इन विट्रो प्रणाली सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों (विदेश मंत्रालयों) का उपयोग कर विकसित किया गया है FUS उत्तेजना के बाद HiPSC न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है. यह प्रणाली अल्ट्रासाउंड मापदंडों (जैसे, आवृत्ति, फट लंबाई, तीव्रता) को बदलते समय न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए समुदाय में शोधकर्ताओं को सशक्त बनाती है। इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली शारीरिक उत्तेजनाओं (जैसे, तापमान, दबाव, और गुहिकायन)8,9, के लिए न्यूरोनल संवेदनशीलता के नियंत्रण के एक उच्च स्तर को सक्षम बनाता है, के रूप में न्यूरॉन्स आयन चैनल कार्यक्षमता आनुवंशिक और औषधीय (जैसे, गैडोलीनियम का उपयोग आयन चैनलों को बाधित करने के लिए)10,11,12 हेरफेर किया जा सकता है. यह आणविक-स्तर नियंत्रण FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों के पीछे के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>MEA System</td>
			<td>Axion Biosystem Inc.</td>
			<td>Maestro Edge</td>
			<td>Sampling Rate: 11500 Hz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA Plate</td>
			<td>Axion Biosystem Inc.</td>
			<td>CytoView MEA</td>
			<td>Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate Interface</td>
			<td>Amcor Inc.</td>
			<td>Parafilm PM996; P7793</td>
			<td>Thickness: 127 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tank and Regulator for culture</td>
			<td>AirGas Inc./ Harris Inc.</td>
			<td>9296NC</td>
			<td>Concentration: 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher Inc.</td>
			<td>Laminin; 23017-015</td>
			<td>Concentration: 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPSC Neurons</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>CIPS and GM01582 Derived; 450-10</td>
			<td>Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>CTX250; 008</td>
			<td>Center Frequency: 250 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matching Network</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>CTX250; NFS102v2</td>
			<td>Impedance: 50 &#937;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer Power Output (TPO)</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>Version 4.1; 020</td>
			<td>Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>McMaster Inc.</td>
			<td>Silicone Rubber; 5542N115</td>
			<td>Thickness: 0.0127 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Gel</td>
			<td>Parker Laboratory Inc.</td>
			<td>Aquasonic 100; B08DDWG GXB</td>
			<td>Viscosity: 130,000&#8211;185,000 cops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connection to Probe holder</td>
			<td>McMaster Inc.</td>
			<td>Steal Threaded Rod; 90322A661</td>
			<td>Length: 1&#8211;1/2&#34; Long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Inc.</td>
			<td>Sorvall Legend X1R; 75004261</td>
			<td>Max acceleration: 10&#8211;25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>Y-104; 009</td>
			<td>Range: 50 kHz&#8211;1.9 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Tank</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>WT</td>
			<td>Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Conditioning Unit</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>WCU; SN006</td>
			<td>Flow Velocity: 50 mL/s maximum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Rohde-Schwarz Inc.</td>
			<td>RTC1002</td>
			<td>Sampling rate: Up to 50 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Sonic Concepts Inc.</td>
			<td>MicroStage; 2</td>
			<td>Accuracy: 1 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermochromic sheet</td>
			<td>TIPTEMP Inc.</td>
			<td>Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337</td>
			<td>Range: 22&#8211;24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Microsoft Surface</td>
			<td>Surface Pro</td>
			<td>CPU i5 1035G4: 3.7 GHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Transfer Software</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Version 2021b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing Software</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td>Python</td>
			<td>Version 3.7.10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focused ultrasound neuromodulation of human in vitro neural cultures in multi-well microelectrode arrays

केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों को पशु मॉडल में प्रदर्शित किया गया है, और मनुष्यों में आंदोलन और मनोरोग विकारों के इलाज के लिए एफयूएस का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हालांकि, एफयूएस की सफलता के बावजूद, न्यूरॉन्स पर इसके प्रभावों को अंतर्निहित तंत्र खराब समझा जाता है, जिससे एफयूएस मापदंडों को ट्यून करके उपचार अनुकूलन मुश्किल हो जाता है। ज्ञान में इस अंतर को दूर करने के लिए, हमने मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से सुसंस्कृत न्यूरॉन्स का उपयोग करके इन विट्रो में मानव न्यूरॉन्स का अध्ययन किया। HiPSCs का उपयोग दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में मानव विशिष्ट neuronal व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह रिपोर्ट एक उच्च-थ्रूपुट प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है जो HiPSC न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की निगरानी और मात्रा का ठहराव को सक्षम बनाती है। FUS मापदंडों अलग-अलग और दवा और आनुवंशिक संशोधनों के माध्यम से HiPSC न्यूरॉन्स में हेरफेर करके, शोधकर्ता तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कर सकते हैं और HiPSC न्यूरॉन्स पर FUS के न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभावों को स्पष्ट कर सकते हैं। इस शोध में न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों की एक श्रृंखला के लिए सुरक्षित और प्रभावी एफयूएस-आधारित उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकते हैं।

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Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

यहां, हम एक उच्च-थ्रूपुट सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (HiPSC) न्यूरॉन्स पर केंद्रित अल्ट्रासाउंड के न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों की निगरानी और मात्रा का ठहराव को सक्षम बनाता है।

मल्टी-वेल माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों में मानव इन विट्रो तंत्रिका संस्कृतियों का केंद्रित अल्ट्रासाउंड न्यूरोमॉड्यूलेशन

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

केंद्रित अल्ट्रासाउंड न्यूरोमॉड्यूलेशन। यह ऊपर और आने वाला रोमांचक क्षेत्र चल रहे अध्ययनों का विषय है केंद्रित अल्ट्रासाउंड के क्षेत्र में, किसी विशेष एप्लिकेशन के लिए इष्टतम उत्तेजना पैरामीटर अक्सर अज्ञात होते हैं। इस अध्ययन का उद्देश्य न्यूरॉन्स पर अनुभवजन्य इन विट्रो परीक्षण के माध्यम से इन मापदंडों का एक व्यवस्थित निर्धारण करना है।यह विधि आनुवंशिक और औषधीय रूप से संशोधित न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए शोधकर्ता को सक्षम करके रिसाउंड न्यूरोमॉड्यूलेशन के अंतर्निहित फोकस का पता लगा सकती है। संस्कृति माध्यम महाप्राण शुरू करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से न्यूरॉन संस्कृति प्लेट में एक एकल अच्छी तरह से भरने के लिए, एम्बेडेड माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों या विदेश मंत्रालय. 300 मिलीलीटर degassed और विआयनीकृत पानी तैयार करने के बाद, ध्यान से इसे केंद्रित अल्ट्रासाउंड या FUS ट्रांसड्यूसर शंकु में भरें।एक अनुकूलित थ्रेडेड रॉड का उपयोग करके, 3 डी प्रिंटेड धारक को एक फ्रेम में सुरक्षित करें। फ्रेम को इस तरह रखें कि FUS ट्रांसड्यूसर का सिर उस कुएं के ऊपर हो जो उत्तेजित हो जाएगा। मध्यम और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल या एचआईपीएससी युक्त 24 अच्छी तरह से एमईए प्लेट पर अच्छी तरह से पैराफॉर्म को सुरक्षित करने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें।ट्रान्सड्यूसर पॉवर आउटपुट किंवा TPO कंट्रोल पॅनेलवर FUS पॅरामीटर्स सेट करा. विभिन्न मापदंडों के मूल्यों का उल्लेख स्क्रीन पर किया गया है। अगला, अच्छी तरह से ऊपर paraform के शीर्ष पर युग्मन जेल लागू करें और कम से कम हवा बुलबुले के साथ जेल के साथ संपर्क सुनिश्चित युग्मन जेल में FUS ट्रांसड्यूसर कम.टीपीओ पर नीचे दाएं बटन दबाकर एफयूएस सोनिकेशन शुरू करें और न्यूरॉन्स को आधारभूत स्थिति में लौटने की अनुमति देने के लिए सोनिकेशन के प्रत्येक दौर के बीच कम से कम पांच मिनट प्रतीक्षा करें। यदि कनेक्शन उपयुक्त है, तो FUS सिस्टम द्वारा उत्पन्न ट्रिगर पल्स स्वचालित रूप से MEA रिकॉर्डिंग के साथ FUS उत्तेजना अनुक्रम को संरेखित करेगा। FUS से जुड़ी फायरिंग दर में परिवर्तन के आधार पर स्थानांतरण डेटा के साथ FUS sonication समय को पढ़कर सिग्नल का विश्लेषण करें।FUS फोकल स्पॉट को थर्मो क्रोमैटिक शीट्स पर और वाटर हाइड्रोफोन स्कैनिंग के माध्यम से विज़ुअलाइज़ करके दोनों की विशेषता थी। फ़िल्टरिंग, थ्रेसहोल्डिंग और फायरिंग दर की गणना सहित पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों ने FUS के कारण होने वाले न्यूरोनल गतिविधि परिवर्तनों को प्रकट करने के लिए पर्यावरण से शोर को फ़िल्टर किया। रेखापुंज भूखंडों ने प्रत्येक चैनल में पता लगाए गए स्पाइक्स दिखाए।फायरिंग दर प्लॉट से पता चला कि चुने हुए उत्तेजना मापदंडों ने न्यूरोनल फायरिंग दर में वृद्धि की। प्री एफयूएस फायरिंग रेट 140 हर्ट्ज था, जबकि पोस्ट एफयूएस फायरिंग रेट निरंतर वेव एफयूएस के साथ 786 हर्ट्ज था। FUS sonication मोड को बदलने से न्यूरॉन्स के बेसलाइन राज्य में लौटने से पहले समय की मात्रा भी बदल गई।पैराफॉर्म इंटरफ़ेस पर ट्रांसड्यूसर रखते समय बबल गठन को सावधानीपूर्वक कम करना महत्वपूर्ण है। एक अन्य विचार ट्रांसड्यूसर को दी गई विद्युत शक्ति है। प्रभाव को प्रेरित करने के लिए शक्ति पर्याप्त होनी चाहिए, लेकिन ट्रांसड्यूसर या सेल क्षति को प्रेरित नहीं करने के लिए पर्याप्त कम होना चाहिए।यह तकनीक पार्किंसंस रोग और अन्य न्यूरोलॉजिकल विकारों के इलाज के लिए इष्टतम उत्तेजना पैरामीटर की पहचान कर सकती है, जिससे इनवेसिव सर्जरी से जुड़े जोखिम को समाप्त किया जा सकता है, जिसमें अपरिवर्तनीय क्षति, लंबी वसूली और पुनर्वास का समय शामिल है। नैदानिक परीक्षणों सहित भविष्य के अध्ययनों में सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए इसके तंत्र को उजागर करने और प्रीक्लिनिकल अनुकूलन को नियंत्रित करने के आगे के प्रयास आवश्यक हैं।

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Research

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

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Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

समय चूक विकास Zebrafish अग्रमस्तिष्क में Clonally संबंधित तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

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से तंत्रिका Explant संस्कृति<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

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बहु इकाई रिकॉर्डिंग Locust में तंत्रिका गतिविधि विशेषताएँ तरीके (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) घ्राण सर्किट

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

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माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों के लिए 3 डी इंजीनियर Neuronal संस्कृति Interfacing: एक अभिनव<em&gt; इन विट्रो</em&gt; प्रयोगात्मक मॉडल

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Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

मल्टी इलेक्ट्रोड सारणियों पर हो Organotypic स्पाइनल कॉर्ड सह संस्कृतियों में कार्यात्मक उत्थान की जांच कर

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Microelectrode सरणियों के साथ मिलकर मूषक मस्तिष्क स्लाइस में रिकॉर्डिंग और Epileptiform गतिविधि का मॉडुलन

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...