क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन सेलुलर तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। क्रायो-ईएम ग्रिड पर प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए बाध्य सजातीय सूक्ष्मनलिकाएं तैयार करना सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल सरल, सस्ता है, और यह क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता में नियंत्रित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के साथ सूक्ष्मनलिकाएं तैयार करने की अनुमति देता है।
सूक्ष्मनलिकाएं बहुत तापमान-संवेदनशील होती हैं। इसलिए डीपोलीमराइजेशन को रोकने के लिए सूक्ष्मनलिका युक्त समाधानों को गर्म रखना महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, डीएमईएम सेल कल्चर माध्यम में आनुवंशिक रूप से संशोधित एचसीटी 116 सेल लाइन को तब तक कल्चर करें जब तक कि छह से 12 कंफ्लुएंट प्लेटें प्राप्त न हो जाएं।
किसी भी सेल कल्चर माध्यम को हटाने के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं। कोशिकाओं को प्लेटों से अलग करके कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए तीन मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ पांच-मिलीमोलर ईडीटीए के साथ पूरक किया जाता है, और बाद में, सेल स्क्रैपर का उपयोग करके। बर्फ पर 50-मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 10 मिनट के लिए 250 ग्राम पर घुमाएं।
ट्यूब पर वॉल्यूमेट्रिक पैमाने के साथ काटी गई कोशिकाओं की मात्रा पर ध्यान दें। सोनिकेशन द्वारा लाइसिस बफर और लाइसे कोशिकाओं की समान मात्रा में काटी गई सेल गोली को पुन: निलंबित करें। सोनिकेशन के बाद, एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए, 18 माइक्रोलीटर पानी और 5 एक्स एसडीएस नमूना बफर के पांच माइक्रोलीटर युक्त ट्यूब में लाइसेट के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।
शेष लाइसेड कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें और लाइसेट को साफ करने के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज रोटर में चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 100,000 जी पर घूमें। एक सिरिंज का उपयोग करके, शीर्ष पर गोली और फ्लोटिंग परत को परेशान किए बिना साफ किए गए लाइसेट को हटा दें। 18 माइक्रोलीटर पानी और 5एक्स एसडीएस नमूना बफर के पांच माइक्रोलीटर युक्त ट्यूब में दो माइक्रोलीटर साफ लाइसेट जोड़ें।
गोली को सावधानी से धोएं और पेलेट के माध्यम से पी -10 पिपेट टिप को घुमाकर गोली का थोड़ा सा हिस्सा निकालें। फिर, 200 माइक्रोलीटर पानी और 50 माइक्रोलीटर एसडीएस बफर जोड़ें। सूक्ष्मनलिकाएं को बहुलक बनाने के लिए एक एकत्रित सुपरनैटेंट में एक-मिलीमोलर जीटीपी और 20 माइक्रोमोलर पैक्लिटैक्सेल जोड़ें और सूक्ष्मनलिकाएं इकट्ठा करने की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
400 माइक्रोलीटर लाइसिस बफर में 600 माइक्रोलीटर ग्लिसरॉल जोड़कर कुशन बफर तैयार करें और मिश्रण को 20 माइक्रोमोलर पैक्लिटैक्सेल के साथ पूरक करें। बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 800 माइक्रोलीटर कुशन बफर जोड़ें।
फिर, कुशन बफर के शीर्ष पर जीटीपी-पैक्लिटैक्सेल-पूरक लाइसेट को सावधानी पूर्वक पिपेट करें। ट्यूब को 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 100, 000 जी पर घूमने के लिए एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज रोटर में रखें। ट्यूब के बाहरी चेहरे के किनारे को आसानी से पहचानने के लिए चिह्नित करें कि सूक्ष्मनलिका गोली कहां बननी चाहिए।
सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, गोली को परेशान किए बिना पिपेट का उपयोग करके कुशन बफर को सावधानीसे हटा दें। सावधानी से गोली के बगल में लाइसिस बफर जोड़ें, गोली और ट्यूब की दीवारों से जितना संभव हो उतना ग्लिसरॉल निकालने के लिए ट्यूब को कुछ बार घुमाएं, और फिर एस्पिरेट करें और धोने के चरण को तीन बार दोहराएं। धुले हुए छर्रों को 50 माइक्रोलीटर प्रीवार्म्ड रिसस्पेंशन बफर में कट टिप के साथ धीरे से पुन: निलंबित करें और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
18 माइक्रोलीटर पानी में दो माइक्रोलीटर पुन: निलंबित गोली अंश और 5 एक्स एसडीएस नमूना बफर के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। ब्लोटिंग पेपर स्थापित करके डुबकी फ्रीजर डिवाइस तैयार करें। डिवाइस के तापमान को 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और आर्द्रता को 100% तक सेट करें, डिवाइस को 30 मिनट के लिए बराबर करने की अनुमति दें।
दो अनुप्रयोगों के लिए डुबकी फ्रीजर की सेटिंग्स तैयार करें। पहले आवेदन के लिए, बल को 10, दो सेकंड ब्लॉट समय और शून्य सेकंड प्रतीक्षा समय पर सेट करें। दूसरे एप्लिकेशन के लिए, बल को 10, 6.5 सेकंड ब्लॉट टाइम और 10 सेकंड प्रतीक्षा समय पर सेट करें।
ग्रिड को उनके कार्बन साइड के साथ धातु चमक डिस्चार्जर वाहन में रखें। 60 सेकंड के लिए 30 मिलीमीटर पर क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या ईएम ग्रिड को चमक दें। तरल नाइट्रोजन के साथ पॉलीस्टाइनिन कंटेनर असेंबली को ठंडा करें और एक ठंडे धातु कप में ईथेन गैस को संघनित करके धातु के कप में तरल ईथेन तैयार करें।
सेल एकाग्रता को कम करने के लिए ग्रिड पर लागू करने से पहले कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ समान मात्रा में सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन को पतला करें। मिक्सर को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। यदि डुबकी फ्रीजिंग डिवाइस के पास कोई हीटिंग ब्लॉक नहीं है तो एक इन्सुलेट पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में एक गर्म धातु ब्लॉक का उपयोग करें।
प्लंज ट्वीज़र्स के साथ एक चमक डिस्चार्ज ग्रिड पकड़ें और उन्हें डुबकी फ्रीजर में क्लिक करें। पॉलीस्टाइनिन कंटेनर को तरल ईथेन के साथ डुबकी फ्रीजर में रखें और तैयार कार्यक्रम के माध्यम से चलाएं। सबसे पहले, ग्रिड पर 3.5 माइक्रोलीटर सूक्ष्मनलिका समाधान लागू करें।
डुबकी फ्रीजर को ग्रिड को धब्बा करने दें। फिर, तुरंत पतला प्रोटीन के 3.5 माइक्रोलीटर लागू करें। और अंत में, प्लंजर ब्लॉट को छोड़ दें और तरल ईथेन में ग्रिड को फ्रीज कर दें।
ग्रिड को ग्रिड स्टोरेज बॉक्स में स्थानांतरित करें और इमेजिंग तक उन्हें तरल नाइट्रोजन देवर में स्टोर करें। निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं की गुणवत्ता और एकाग्रता का मूल्यांकन कूमासी-दाग वाले एसडीएस जेल द्वारा किया गया था। बीएसए वक्र के साथ पी 2 लेन में लगभग 50 किलोडाल्टन सूक्ष्मनलिका बैंड के प्रक्षेप से प्राप्त सापेक्ष बीएसए मात्राओं की एक नॉनलाइनर प्रतिगमन रेखा, 1.42 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता को इंगित करती है।
यह दो लोगों द्वारा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ मापी गई संख्या के साथ अच्छी तरह से सहमत है। ताजा निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं क्रायो-ईएम नमूने बनाने के लिए उपयोग की गई थीं। माइक्रोट्यूबुल्स माइक्रोग्राफ पर बरकरार और प्रचुर मात्रा में दिखते हैं।
सूक्ष्मनलिकाएं प्रति माइक्रोट्यूबुल्स घनत्व एक-दूसरे पर पार करने से बचने के लिए बहुत अधिक नहीं होना चाहिए। टूटे हुए सूक्ष्मनलिकाएं इंगित करती हैं कि सूक्ष्मनलिकाएं डीपॉलीमराइज्ड हैं, या यह कि सूक्ष्मनलिकाएं की एकाग्रता बहुत घनी थी। मैटकैप से बंधे सूक्ष्मनलिकाएं सूक्ष्मनलिकाएं सतह पर इलेक्ट्रॉन-घने बिंदुओं की विशेषता वाले खुरदरे किनारे थे।
गणना की गई 2 डी कक्षाओं में मैटकैप-बाउंड और मैटकैप-अनबाउंड सूक्ष्मनलिकाएं भी अलग की जा सकती हैं। इस विधि के साथ क्रायो-ईएम ग्रिड बनाने से एक विशिष्ट अंतःक्रियात्मक प्रोटीन से बंधे सूक्ष्मनलिकाएं की संरचना का अध्ययन करने की अनुमति मिल सकती है। इससे संरचनात्मक कोशिका जीव विज्ञान में तंत्र की बेहतर समझ हो सकती है।