Het gepresenteerde protocol is een zeer flexibele methode voor genoommanipulatie in de eileider van de muis. Het maakt de vorming mogelijk van sporadisch gemuteerde cellen omringd door onbewerkte cellen in een immunocompetente omgeving. Dit is voordelig om kankerinitiatie te bestuderen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het hoge aanpassingsvermogen bij het richten van een orgaan, gebied, regio of celtype met gemakkelijk uitwisselbare sets mutatiecombinaties, allemaal zonder de absolute noodzaak van een muislijn. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik in organen met het lumen en orgaanparenchym. Trek om te beginnen een glazen capillaire buis in een scherpe punt met behulp van een micropipettrekker.
Knip met behulp van een taps toelopende tang met ultrafijne punt het puntige uiteinde van de getrokken capillaire buis onder een ontleedmicroscoop om een opening te maken. Zorg ervoor dat de opening niet te groot is, omdat dit de eileider beschadigt en langzame injectie voorkomt. Schik vervolgens de steriele operatieapparatuur, microscoop, micromanipulator en elektroporator op een schone, steriele bank of in de bioveiligheidskast.
Verwarm het verwarmingskussen op een schijf en plaats het onder een schone, volledig uitgeruste kooi. Giet steriel 1X PBS in een petrischaaltje. Knip met een schone schaar het absorberende papier in vierkanten van één bij één centimeter.
Laat deze in PBS vallen om ze te laten weken. Bevestig vervolgens de getrokken capillaire naald aan de micromanipulator voor klemmontage, gestabiliseerd door een magnetische houder. Pipetteer twee microliter van de injectieoplossing op een steriele petrischaal.
Terwijl u onder de microscoop observeert, neemt u langzaam één tot twee microliter van de injectieoplossing op in de microinjectienaald met behulp van de spuit onder luchtdruk die aan de micromanipulator is bevestigd. Vermijd het opnemen van bubbels in de naald. Na het verdoven van een zes tot acht weken oude vrouwelijke muis en het subcutaan toedienen van carprofen, plaatst u de muis op het verwarmde absorberende papier met de dorsale kant naar boven gericht.
Breng oogglijmiddel aan op elk oog om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen. Na bevestiging van de verdovingsstilstand door de teen met een tang te knijpen, verwijdert u de dorsale vacht rond de potentiële incisieplaats en veegt u de blote huid af met een antisepticum. Gebruik een rechte, stompe tang om de blote huid te knijpen en maak een centimeter lange incisie langs de middellijn van het lichaam met behulp van een steriele schaar.
Knijp en houd een kant van de snijplaats omhoog met een steriele Adson-tang. Scheid vervolgens met behulp van een steriele, gebogen, gekartelde tang voorzichtig de huid van de lichaamswand, beginnend bij de middellijnincisie en lateraal bewegend. Nadat u het vetkussen onder de nier hebt gevonden, gebruikt u een steriele, rechte, stompe tang om de lichaamswand direct boven het vetkussen te knijpen.
Maak een kleine incisie in de lichaamswand met behulp van een steriele, scherpe, puntige ontleedschaar, waarbij u ervoor zorgt dat bloedvaten worden vermeden. Terwijl u nog steeds de lichaamswand knijpt met een rechte, stompe tang, steekt u een paar steriele, stompe, gebogen tangen in de incisie en verbreedt u de incisie die in de lichaamswand is gemaakt. Pak het zichtbare vetkussen met de stompe, gebogen tang en trek het uit het gat om de eierstok, eileider en baarmoeder bloot te leggen.
Houd het voortplantingsspoor bloot door het vetkussen vast te klemmen met een steriele bulldogklem. Plaats de verdoofde muis voorzichtig met het voortplantingsspoor bloot op het podium van een ontleedmicroscoop. Stel de micromanipulator zo in dat de injectienaald met de oplossing onder de microscoop wordt waargenomen.
Manipuleer vervolgens de microscoop om gemakkelijk de eierstok, eileider en baarmoeder te observeren. Houd met behulp van een steriele, taps toelopende tang met ultrafijne punt het gebied van de eileider vast dat moet worden geïnjecteerd. Het gebied moet in lijn zijn met de richting van de micro-injectienaald.
Stel de micromanipulator in om de eileider te doorboren met de micro-injectienaald, terwijl u tegelijkertijd de eileider op de naald voert met behulp van de taps toelopende tang met ultrafijne punt. Beweeg de microinjectienaald voorzichtig om te bevestigen dat deze in de eileider is ingebracht. Injecteer langzaam een microliter van de injectieoplossing en 5% gefilterd trypanblauw in de eileider, terwijl u de beweging van de blauwe oplossing en de uitzetting van het eileiderlumen observeert.
Vermijd het introduceren van bubbels in het lumen. Verwijder na injectie de naald uit de eileider en bedek het te richten gebied met een stuk absorberend papier dat vooraf is gedrenkt in PBS. Pak het voorgeweekte papier en het te richten gebied vast met een elektrodepincet en trek weg van het lichaam.
Elektroporate het doelgebied met behulp van drie unipolaire pulsen op 30 volt gedurende 50 milliseconden met intervallen van één seconde. Verwijder na elektroporatie het absorberende papier en plaats de muis terug op het verwarmingskussen. Maak de bulldogklem los en duw het blootgestelde voortplantingsspoor voorzichtig terug onder de lichaamswand.
Nadat beide eileiders zijn geëlektropereerd en terug onder de lichaamswand zijn geplaatst, gebruikt u een naaldhouder om de naald vast te pakken. Knijp en houd een kant van de snijplaats omhoog met behulp van een steriele, gebogen, gekartelde tang. Gebruik vervolgens de naaldhouder om de hechting te manipuleren en de wond te sluiten.
Beweeg de muis in een schone kooi bovenop een verwarmingskussen en controleer totdat de muis actief is. Bij elektroporatie met behulp van drie- of één millimeter pincet-type elektroden, was het beoogde gebied gelabeld met TdTomato beperkt tot het distale eileiderepitheel. Met elektroden van het pincettype van drie millimeter werd een veel groter gebied van de ampullen gericht in vergelijking met alleen de distale meest punt, het infundibulum, met behulp van elektroden van het pincet van één millimeter.
In het doelgebied werden geëlektroporeerde cellen gemarkeerd door TdTomato willekeurig verdeeld over niet-geëlektroporeerde cellen. Bovendien waren geëlektroporeerde cellen beperkt tot het mucosale epitheel en niet waargenomen in de onderliggende stromale of spierlaag. Om crispr-gemedieerde genoombewerking te bevestigen, kunnen fluorescerende cellen worden geïsoleerd door FACS-sortering voor DNA-isolatie en sequencing.
Dit stelt ons in staat om de frequentie van gerichte allelen te kwantificeren, de unieke communicatie tussen monsters te volgen om de in vivo coronale evolutie van primaire tumor en metastase in immunocompetente omgeving te volgen.
