Das vorgestellte Protokoll ist eine hochflexible Methode zur Genommanipulation im Eileiter der Maus. Es ermöglicht die Bildung von sporadisch mutierten Zellen, die von uneditierten Zellen umgeben sind, in einer immunkompetenten Umgebung. Dies ist vorteilhaft, um die Krebsentstehung zu untersuchen.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre hohe Anpassungsfähigkeit, um ein Organ, einen Bereich, eine Region oder einen Zelltyp von Interesse mit leicht austauschbaren Sätzen von Mutationskombinationen anzusprechen, ohne dass eine Mauslinie unbedingt erforderlich ist. Diese Methode kann leicht für den Einsatz in Organen mit dem Lumen sowie im Organparenchym angepasst werden. Ziehen Sie zunächst ein Glaskapillarröhrchen mit einem Mikropipettenzieher an eine scharfe Spitze.
Schneiden Sie mit einer sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze das spitze Ende des gezogenen Kapillarrohrs unter einem Präpariermikroskop ab, um eine Öffnung zu schaffen. Achten Sie darauf, dass die Öffnung nicht zu groß ist, da dies den Eileiter beschädigt und eine langsame Injektion verhindert. Ordnen Sie als Nächstes die sterilen chirurgischen Geräte, das Mikroskop, den Mikromanipulator und den Elektroporator auf einer sauberen, sterilen Bank oder in der Biosicherheitswerkbank an.
Erhitzen Sie das Heizkissen auf einer Scheibe und legen Sie es unter einen sauberen, voll ausgestatteten Käfig. Gießen Sie steril 1X PBS in eine Petrischale. Schneiden Sie das saugfähige Papier mit einer sauberen Schere in Quadrate, die einen Zentimeter lang sind.
Geben Sie diese in PBS, um sie einzuweichen. Befestigen Sie als Nächstes die gezogene Kapillarnadel an dem Mikromanipulator mit Klemmhalterung, der durch eine magnetische Halterung stabilisiert wird. Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Injektionslösung auf eine sterile Petrischale.
Nehmen Sie während der Beobachtung unter dem Mikroskop langsam ein bis zwei Mikroliter der Injektionslösung mit der am Mikromanipulator angebrachten Luftdruckspritze in die Mikroinjektionsnadel auf. Vermeiden Sie es, Blasen in der Nadel aufzunehmen. Nachdem Sie eine sechs bis acht Wochen alte weibliche Maus betäubt und Carprofen subkutan verabreicht haben, legen Sie die Maus mit der Rückenseite nach oben auf das erhitzte saugfähige Papier.
Tragen Sie Augengleitmittel auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern. Nachdem Sie den Narkosestopp bestätigt haben, indem Sie den Zeh mit einer Pinzette zusammengedrückt haben, entfernen Sie das Rückenfell um die voraussichtliche Einschnittstelle und wischen Sie die nackte Haut mit einem Antiseptikum ab. Verwenden Sie eine gerade, stumpfe Pinzette, um die nackte Haut zu kneifen und mit einer sterilen Schere einen einen einen Zentimeter langen Schnitt entlang der Körpermittellinie zu machen.
Drücke eine Seite der Schnittstelle zusammen und halte sie mit einer sterilen Adson-Pinzette hoch. Trennen Sie dann mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette die Haut vorsichtig von der Körperwand, beginnend am Mittellinienschnitt und seitlich bewegend. Nachdem Sie das Fettpolster unter der Niere lokalisiert haben, verwenden Sie eine sterile, gerade, stumpfe Pinzette, um die Körperwand direkt über dem Fettpolster einzuklemmen.
Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Körperwand mit einer sterilen, scharfen, spitzen Präparierschere und achten Sie darauf, Blutgefäße zu vermeiden. Während Sie die Körperwand noch mit einer geraden, stumpfen Pinzette einklemmen, führen Sie eine sterile, stumpfe, gebogene Pinzette in den Einschnitt ein und erweitern Sie den in der Körperwand entstandenen Einschnitt. Fassen Sie das sichtbare Fettpolster mit der stumpfen, gebogenen Pinzette und ziehen Sie es aus dem Loch, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutter freizulegen.
Halten Sie die Fortpflanzungsspur frei, indem Sie das Fettpolster mit einer sterilen Bulldoggenklemme festklemmen. Legen Sie die betäubte Maus vorsichtig mit freiliegender Fortpflanzungsspur auf den Tisch eines Präpariermikroskops. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Injektionsnadel mit der Lösung unter dem Mikroskop beobachtet wird.
Manipulieren Sie dann das Mikroskop, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutter leicht zu beobachten. Halten Sie mit einer sterilen, sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze den Bereich des Eileiters fest, der injiziert werden soll. Der Bereich muss mit der Richtung der Mikroinjektionsnadel übereinstimmen.
Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass der Eileiter mit der Mikroinjektionsnadel punktiert wird, während Sie gleichzeitig den Eileiter mit der sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze auf die Nadel führen. Bewegen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig, um zu bestätigen, dass sie in den Eileiter eingeführt wurde. Injizieren Sie langsam einen Mikroliter der Injektionslösung und 5%iges gefiltertes Trypanblau in den Eileiter, während Sie die Bewegung der blauen Lösung und die Ausdehnung des Eileiterlumens beobachten.
Vermeiden Sie es, Blasen in das Lumen einzuführen. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel aus dem Eileiter und decken Sie den Zielbereich mit einem in PBS getränkten Stück saugfähigem Papier ab. Fassen Sie das eingeweichte Papier und den Bereich, auf den Sie zielen möchten, mit einer Elektrodenpinzette und ziehen Sie ihn vom Körper weg.
Elektroporieren Sie den Zielbereich mit drei unipolaren Impulsen bei 30 Volt für 50 Millisekunden in Intervallen von einer Sekunde. Entfernen Sie nach der Elektroporation das saugfähige Papier und legen Sie die Maus wieder auf das Heizkissen. Lösen Sie die Bulldoggenklemme und schieben Sie die freiliegende Fortpflanzungsspur vorsichtig wieder unter die Körperwand.
Nachdem beide Eileiter elektroporiert und wieder unter die Körperwand gelegt wurden, greifen Sie die Nadel mit einem Nadelhalter. Drücken Sie eine Seite der Schnittstelle zusammen und halten Sie sie mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette hoch. Verwenden Sie dann den Nadelhalter, um das Nahtmaterial zu manipulieren und die Wunde zu schließen.
Bewegen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der auf einem Heizkissen platziert ist, und überwachen Sie, bis die Maus aktiv ist. Nach der Elektroporation mit drei oder einem Millimeter großen Pinzettenelektroden wurde der mit TdTomato markierte Zielbereich auf das distale Eileiterepithel beschränkt. Mit drei Millimeter großen Pinzettenelektroden wurde ein viel größerer Bereich der Ampullen anvisiert, verglichen mit Ein-Millimeter-Pinzettenelektroden, die nur auf die distale oberste Spitze, das Infundibulum, abzielten.
In der Zielregion wurden elektroporierte Zellen, die durch TdTomato markiert wurden, zufällig auf nicht-elektroporierte Zellen verteilt. Darüber hinaus waren elektroporierte Zellen auf das Schleimhautepithel beschränkt und wurden nicht in der darunter liegenden Stroma- oder Muskelschicht beobachtet. Um die CRISPR-vermittelte Genom-Editierung zu bestätigen, können fluoreszierende Zellen durch FACS-Sortierung für die DNA-Isolierung und -Sequenzierung isoliert werden.
Dies ermöglicht es uns, die Häufigkeit der Zielallele zu quantifizieren und die einzigartige Kommunikation zwischen der Probe zu verfolgen, um die koronale Evolution des Primärtumors in vivo zu verfolgen, und die Metastasierung in einer immunkompetenten Umgebung.
