Wir haben ein schnelles und effizientes Protokoll entwickelt, um Blasenkrebs-Organoide durch Ex-vivo-Gen-Editing von normalen Maus-Urothelzellen, die floxierte Allele in interessanten Genen tragen, zu erzeugen. Diese Ex-vivo-Methode hat einen ein- bis zweiwöchigen Workflow anstelle von jahrelanger Mauszucht und ist hocheffizient in der Adenovirus-Transduktion auf den Cre-vermittelten Gendeletionen. Bereiten Sie zunächst alle sterilen Instrumente und Reagenzien vor, einschließlich Schere, Pinzette, DPBS in 35-Milliliter-Kulturgeschirr, 70% Ethanol, Gaze und saubere Papierhandtücher.
Als nächstes reinigen Sie alle Oberflächen des Sezierbereichs und bedecken Sie den Dissektionsbereich mit einem sauberen Papiertuch. Legen Sie die eingeschläferte Maus auf die Gaze im Dissektionsbereich und sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch der Maus, dann mit einer sterilen Dissektionsschere, machen Sie einen Bauchschnitt in der unteren Mittellinie, um die Blase freizulegen. Verwenden Sie nun die Pinzette, um die Blase zu greifen und vorsichtig hochzuziehen, um die bilaterale ureterovesische Verbindung zu identifizieren.
Entfernen Sie mit einer Schere den Blasenfundus, folgen Sie der Grenzlinie zwischen den beiden Harnleiteröffnungen und geben Sie die Blase in eine sterile Schale mit 2 Millilitern DPBS, entfernen Sie dann das Fett- und Bindegewebe und geben Sie die Blase in eine neue Schale mit 2 Millilitern DPBS. Entfernen Sie auch das Adenovirus aus dem minus 80 Grad Celsius großen Speicher und halten Sie es auf Eis. Bereiten Sie für die Zelldissoziation alle sterilen Instrumente und Reagenzien wie im Manuskript beschrieben vor, geben Sie dann in einer Biosicherheitskabine die Blase in eine 35-Millimeter-Schüssel und waschen Sie sie mit 2 Millilitern sterilem DPBS.
Sammeln Sie das Blasengewebe von vier Mäusen in einer Schale mit einem Milliliter vollständigem Kulturmedium ohne kohlebefreites FBS. Als nächstes zerkleinern Sie mit einer chirurgischen Klinge jede Blase in vier gleiche Stücke, dann entfalten Sie mit einer Pinzette die Blase, um die Urotheloberfläche dem Medium auszusetzen. Blasenstücke und Medium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben.
Waschen Sie die Schüssel zweimal mit 2 Millilitern komplettem Kulturmedium ohne kohleabgestreiftes FBS und geben Sie die Wäsche in das Zentrifugenröhrchen, wodurch das Gesamtvolumen auf 5 Milliliter erhöht wird. Als nächstes fügen Sie eine Kollagenase- und Hyaluronidase-Mischung hinzu und legen Sie die Tube horizontal in einen 37-Grad-Celsius-Orbitalschüttler-Inkubator für 30 Minuten bei 200 U / min. Nach der Gewebeverdauung ein gleiches Volumen von 10% mit Holzkohle abgestreiftes FBS und DPBS in das Röhrchen geben und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 2 Milliliter Trypsinersatz in das Zellpellet hinzu und mischen Sie gut, dann inkubieren Sie die Tube bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 4 Minuten. Nach der Inkubation pipettieren Sie die Zellen 10 Mal mit einer Standard-P1000-Spitze auf und ab und fügen Sie 5 Milliliter 10% kohlebelichtetes FBS und DPBS hinzu. Belasten Sie die dissoziierten Zellen durch ein 100 Mikrometer langes steriles Zellsieb und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen.
Die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und 5 Minuten lang 200 mal g zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands das Pellet in 1 Milliliter komplettem Kulturmedium resuspendieren. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und einer Platte 0,5 mal 10 bis zu den 6. Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 0,5 Millilitern frischem Vollkulturmedium.
Als nächstes nehmen Sie die Matrixextrakte der Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen aus minus 20 Grad Celsius Speicher heraus und tauen sie auf Eis auf. Wärmen Sie auch eine 6-Well-Platte in einem 37-Grad-Celsius-Zellinkubator vor. Für die adenovirale Transduktion fügen Sie 2 Mikroliter Adenovirus in die 24-Well-Platte hinzu und mischen Sie gut mit den dissoziierten Urothelzellen.
Um die Transduktionseffizienz zu erhöhen, führen Sie die Spinokulation durch, indem Sie die Platte 30 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren und dann die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 1 Stunde inkubieren. Zellen und Medium aus der Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und Zentrifuge bei 200 mal g für 5 Minuten überführen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 50 Mikroliter komplettes Kulturmedium hinzu und mischen Sie gut mit den Zellen am Boden.
Als nächstes fügen Sie 140 Mikroliter Matrixextrakt hinzu und mischen Sie vorsichtig gut, um Luftblasen zu vermeiden, und erstellen Sie dann Kuppeln für Organoide, indem Sie schnell 50 Mikroliter der Lösung pro Kuppel in die vorgewärmte 6-Well-Platte geben. Inkubieren Sie die Platte und lassen Sie die Kuppeln für 5 Minuten erstarren. Nach 5 Minuten drehen Sie die 6-Well-Platte auf den Kopf und erstarren Sie weitere 25 Minuten.
Nach der Inkubation fügen Sie 2,5 Milliliter vollständiges Kulturmedium zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Platte in einen Inkubator für Organoidkultur. Das grün fluoreszierende Protein wurde in fast 100% der Zellen nachgewiesen, was auf eine hohe Effizienz der Adenovirus-Transduktion hindeutet. Hämatoxylin- und Eosinfärbung und Immunhistochemie von Triple-Knockout-Organoid-Tumoren zeigten die Morphologie hochgradiger Urothelkarzinome mit positiver Proteinexpression von basalen Subtypmarkern von CK5 und p63.
Die nicht rekombinierten floxierten Allele wurden in Urothelzellen nachgewiesen, die nicht mit Adenovirus behandelt wurden, während die rekombinierten Allele in den dreifachen Knockout-Organoiden beobachtet wurden. Im Allgemeinen wurden 2 bis 3 Wochen benötigt, um einen 2 Zentimeter großen subkutanen Tumor zu bilden. Die Immunhistochemie von Triple-Knockout-Organoiden, in vivo Xenotransplantaten, zeigte eine positive Expression von CK7-, CK5- und p63-Proteinen.
Negative Expression wurde für CK8- und Uroplakin-Proteine nachgewiesen. Der Mesenchymmarker Vimentin wurde nur in der Tumorkapsel oder im Stroma nachgewiesen. Die Dissoziation der Mausblase darf 30 Minuten nicht überschreiten.
Eine längere Dissoziationszeit kann den Prozentsatz der Stromazellen, wie Endothelzellen und die Fibroblasten, erhöhen Dieser Ansatz kann mit der Zellsortierung oder dem Zelltyp eines spezifischen Adenovirus kombiniert werden, um den Zelltyp spezifischer Organoide zu erzeugen, wie Lumen versus Basalorganoide.
