Patientenabgeleitete Xenograft-Modelle und primäre Zelllinien werden zu einem integralen Bestandteil der Arzneimittelentwicklung und der Einleitung und Progression der Tumorbiologieforschung. Von Patienten abgeleitete Xenograft-Modelle bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten intratumorale Heterogenität bei und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung wider. Seine Modelle sind für genauere Darstellungen von menschlichem Krebs als traditionelle Krebszelllinien und haben das Potenzial, die präklinische Bewertung neuer Krebstherapien zu verbessern.
Darüber hinaus können diese Modelle nützlich sein, um molekulare Eigenschaften oder Tumorsignaturen zwischen verschiedenen Untergruppen von Krebspatienten zu vergleichen. NSG-Mäuse werden als immundefiziendes Mausmodell empfohlen. Aufgrund der schweren Immunschwäche der Mäuse muss die Sterilität in allen Experimenten aufrechterhalten werden.
Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen Zangen und Scheren, um das Tumorgewebe sorgfältig zu sezieren und in mehrere kleine Stücke zu schneiden. Nach der Anästhesisierung der Maus verwenden Sie eine sterile Schere, um einen ein Zentimeter großen Schnitt an beiden Rückenflanken zu machen. Verwenden Sie sterile Zangen, um das unterkutane Gewebe zu stören.
Schneiden Sie dann ein Stück des Tumorgewebes ab und legen Sie es in die tiefe Stelle. Schließen Sie den Implantatbereich durch subkutane Naht mit chirurgischen Nahtnadeln. Sterilisieren Sie die Wunde mit Jod.
Legen Sie die Mäuse danach vorsichtig in einen leeren Käfig, während Sie die Brustbelebung beibehalten. Achten Sie genau auf die Mäuse, wie sie aufwachen sollten und beginnen zu gehen nach etwa drei bis vier Minuten. Platzieren Sie Mäuse, die operiert werden, in einem neuen Käfig, getrennt von denen, die nicht operiert werden.
Bewerten Sie die Tumorgröße durch Palpation der Implantationsstelle und messen Sie sie zweimal pro Woche mit einem Vernier-Sättel. Nach der Einschlämung der Mäuse, verwenden Sie sterile Zangen und Schere, um langsam den Tumor von den Mäusen zu isolieren. Waschen Sie das Tumorgewebe in DPBS in einer 10-Zentimeter-Schale.
Sie zangen und Schere, um nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe zu sezieren und zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie eine Form, um das Tumorgewebe auf eine maximale Dicke von einem Millimeter zu schneiden. Waschen Sie die Tumorscheiben mit DPBS in einer 10-Zentimeter-Schale.
Um den Verglasungsprozess zu beginnen, verwenden Sie Zangen, um die Scheiben in Rohr V1 zu übertragen und bei vier Grad Celsius für vier Minuten zu brüten. Rollen und invertieren Sie die Röhre kurz und inkubieren Bei vier Grad Celsius für weitere vier Minuten. Als nächstes gießen Sie die V1-Lösung und scheibenen in eine 10-Zentimeter-Schale und verwenden Zangen, um die Scheiben in Rohr V2 zu übertragen. Vier Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren.
Rollen und invertieren Sie das Rohr kurz und inkubieren Sie es bei vier Grad Celsius für weitere vier Minuten. Danach die V2-Lösung und die Scheiben in eine 10-Zentimeter-Schale gießen. Die Scheiben in Tube V3 geben und bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang brüten.
Rollen und invertieren Sie die Röhre kurz und inkubieren bei vier Grad Celsius für weitere fünf Minuten. Stellen Sie sicher, dass alle Scheiben auf den Boden des Rohres sinken. Wenn mehrere Scheiben schweben, rollen und invertieren Sie das Rohr kurz und tauchen Sie bei vier Grad Celsius ein, bis alle Scheiben vollständig sinken.
Dann die V3-Lösung gießen und in eine 10-Zentimeter-Schale schneiden. Schneiden Sie die Gewebehalter auf die richtige Länge und legen Sie sie auf sterile Gaze. Übertragen Sie die Scheiben auf die Halter.
Wrap die Halter mit Gaze. Mit Zangen die Halter in flüssigen Stickstoff geben und fünf Minuten brüten lassen. Danach die kryogenen Durchstechflaschen mit den Gewebeinformationen beschriften.
Übertragen Sie die Halter mit Gewebescheiben in die Fläschchen, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Erstens, resektect Magenkrebsproben von resektierten Proben oder geernteten PDX-Geweben. Legen Sie das Gewebe auf Eis und übertragen Sie es in ein 10 Zentimeter steriles Kulturgericht.
Verwenden Sie Zangen und Scheren, um nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe zu entfernen. Waschen Sie das Tumorgewebe einmal mit DPBS, das Penicillin und Streptomycin in einer 10-Zentimeter-Schale enthält. Als nächstes schneiden Sie den Tumor in Stücke auf dem Deckel der Schale.
Die maximale Dicke jedes Stückes sollte einen Millimeter betragen. Übertragen Sie die Stücke in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit sieben Millilitern einer Typ-1-Kollagenase und Trypsinlösung. Wirbeln Sie die Mischung kurz.
In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten inkubieren, um sicherzustellen, dass die Mischung alle fünf Minuten wirbelt. Danach fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI-1640 Medium mit 10%FBS ergänzt und Wirbel die Mischung gründlich. Übertragen Sie dieses Gemisch durch langsame Filtration durch einen 40-Mikroliter-Filter in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.
Zentrifugieren Sie die Filtrate mit einer Geschwindigkeit zwischen 113 und 163 mal g für fünf bis sieben Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie diesen Überstand vorsichtig. Waschen Sie das Pellet mit fünf MilliliterPBS und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
Wenn das Pellet rot ist, enthält es Erythrozyten. Das Pellet mit 500 Mikrolitern roter Blutzelllysepuffer vorsichtig wieder aufhängen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang brüten. Fügen Sie dann fünf Milliliter PBS hinzu.
Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit zwischen 113 und 163 mal g für fünf bis sieben Minuten bei Raumtemperatur. Den Überstand vorsichtig entfernen und das Pellet mit Kulturmedium wieder aufhängen und in eine sterile 10-Zentimeter-Schale geben. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass das Medium alle zwei bis drei Tage durch serumhaltiges Medium ersetzt wird.
In dieser Studie werden Magenkrebs-PDX-Modelle und primäre Zelllinien ermittelt. Tumoren der ersten Generation wachsen langsamer als in späteren Generationen und dauern drei Wochen oder länger, um die entsprechende Größe zu erreichen. Die Erfolgsrate der subkutanen Tumorbildung der ersten Generation liegt bei über 80%Die Identität der Krebszellen aus PDX-Modellen wird aus PDX-Modellen durch H&E-Färbung bestätigt.
Die Erfolgsrate der Tumorbildung aus kryokonserviertem Tumorgewebe ist etwa 95%Tumorzellen können leicht durch Unterschiede in der Morphologie erkannt werden. Die Primärzellen werden unabhängig voneinander von zwei Pathologen unter dem Mikroskop authentifiziert. Zur weiteren Bestätigung wird H&E-Färbung verwendet, um die Morphologie von Krebszellen nach der Fixierung zu beobachten.
Die Rate der erfolgreichen Isolierung von primären Zelllinien beträgt ca. 40%Diese Modelle haben sich als prädiktiv für klinische Ergebnisse erwiesen und werden für die präklinische Arzneimittelbewertung durch eine Marker-Identifikation, biologische Studien und personalisierte Medizinstrategien verwendet.
