Name: Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers at JoVE.com

इस काम को प्रतिष्ठित युवा विद्वानों के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (82125018) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

मानव गर्भनाल बीजिंग सिंघुआ चांगगेंग अस्पताल से प्राप्त किया गया था। मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (यूसीएमएससी) के अधिग्रहण, अलगाव और संस्कृति के बारे में सभी प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल को सू?...

Closed System Production of Adherent Cells Based on Dissolvable Microcarriers

<ol>
	<li>Golchin, A., Farahany, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+products:+Cellular+therapy+and+FDA+approved+products.">Biological products: Cellular therapy and FDA approved products.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).</li><li>Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. 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P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+therapy:+progress+in+manufacturing+and+assessments+of+potency.">Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency.</a> Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).</li><li>Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+MSC-Are+we+there+yet.">Peak MSC-Are we there yet.</a> Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).</li><li>. Roots Analysis. 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US Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs">https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs</a> (2023)</li><li>Beeravolu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+umbilical+cord+and+fetal+placenta.">Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quality+evaluation+system+establishment+of+mesenchymal+stromal+cells+for+cell-based+therapy+products.">The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 176 (2020).</li><li>Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+by+design+to+define+critical+process+parameters+for+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion.</a> Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).</li><li>Silva Couto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+mesenchymal+stem/stromal+cells+(hMSCs)+in+bioreactors+using+microcarriers:+Lessons+learnt+and+what+the+future+holds.">Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds.</a> Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+bead-to-bead+cell-transfer+method+for+serial+subculture+and+large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+bioreactors.">Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors.</a> Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).</li><li>Tsai, A. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Hewitt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+microcarriers.">Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers.</a> Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).</li><li>Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+downstream+separation+processes+for+mesenchymal+stromal+cells+cultured+in+microcarrier-based+stirred+suspension+bioreactors.">Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).</li><li>Schirmaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+production+in+stirred+single-use+bioreactors+under+low-serum+conditions.">Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions.</a> Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).</li><li>Lawson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+for+expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+in+a+50L+single-use+stirred+tank+bioreactor.">Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microcarrier+culture+of+HEK293T+cells+and+Vero+cells+in+single-use+bioreactors.">Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors.</a> AMB Express. 9 (1), 70 (2019).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+scalable+vaccinia+virus-based+vector+production+process+using+dissolvable+porous+microcarriers.">Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers.</a> 25th Annual Meeting of the American Society of Gene &amp; Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).</li></ol>

इम्यूनोथेरेपी और स्टेम सेल थेरेपी दोनों दवाओं के रूप में जीवित कोशिकाओं का उपयोग करते हैं; हालांकि, उनके अंतिम उत्पादों को छोटे अणुओं या वायरस के समान शुद्ध या निष्फल नहीं किया जाना चाहिए। इसलिए, डिजा?...

सीजीटी उद्योग ने पिछले दो दशकों में तेजी से विस्तार देखा है। अगली पीढ़ी की दवाओं का विकास कई दुर्दम्यरोगों के इलाज और इलाज के लिए प्रत्याशित है। 2017 में सीजीटी उत्पाद, किम्रिया के पहले खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदन के बाद से, दुनिया में सीजीटी से संबंधित अनुसंधान और विकास तेजी से बढ़ रहा है, एफडीए ने सीजीटी के लिए सक्रिय जांच नई दवा अनुप्रयोगों को 2018 में 500 तक बढ़ा दियाहै। यह भविष्यवाणी की गई थी कि 2030 तक संयुक्त राज्य अमेरिका में सीजीटी उत्पादों के अनुमोदन की संख्या 54-74होगी।
जबकि सीजीटी अनुसंधान और नवाचार में तेजी से वृद्धि रोमांचक है, फिर भी प्रयोगशाला अनुसंधान और औद्योगिक पैमाने पर विनिर्माण के बीच एक बड़ा तकनीकी अंतर है जो इन आशाजनक दवाओं को सस्ती लागत पर आवश्यकतानुसार अधिक से अधिक रोगियों तक पहुंचा सकता है। इन नैदानिक परीक्षणों के लिए अपनाई गई वर्तमान प्रक्रियाओं को छोटे पैमाने पर प्रयोगों के लिए प्रयोगशालाओं में स्थापित किया गया था, और सीजीटी विनिर्माण3 पर सुधार और नवाचार के लिए महत्वपूर्ण प्रयासों की आवश्यकता है। सीजीटी उत्पादों के कई प्रकार हैं, उनमें से अधिकांश जीवित कोशिकाओं पर आधारित हैं, जो एलोजेनिक, ऑटोलॉगस, इंजीनियर या प्राकृतिक हो सकते हैं। ये जीवित दवाएं छोटे आणविक संस्थाओं या जीवविज्ञान की तुलना में बहुत अधिक जटिल हैं, इसलिए बड़े पैमाने पर विनिर्माण को एक महत्वपूर्ण चुनौतीबनाते हैं 4,5,6. इस काम में, हम तीन एंकरेज-निर्भर कोशिकाओं के लिए एक बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं जो सीजीटी में व्यापक रूप से लागू होते हैं। स्ट्रोमल कोशिकाएं (एचएमएससी) शामिल हैं, जिनका उपयोग सेल-आधारित चिकित्सा के लिए किया गया है, और HEK293T कोशिकाएं और वेरो कोशिकाएं, जिनमें से दोनों का उपयोग अंतिम चिकित्सीय सेल उत्पाद की आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए वायरस का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। एंकोरेज-निर्भर कोशिकाओं को आमतौर पर प्लानर सिस्टम पर सुसंस्कृत किया जाता है, जिन्हें मैन्युअल प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। हालांकि, मैनुअल संस्कृति विधियों को श्रम की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है और संदूषण का खतरा होता है, जो अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता से समझौता कर सकता है। इसके अलावा, कोई इन-लाइन प्रक्रिया नियंत्रण नहीं है, जिससे बैच7 के बीच गुणवत्ता में पर्याप्त परिवर्तनशीलता होती है। एक उदाहरण के रूप में स्टेम सेल थेरेपी लेते हुए, 200 से अधिक स्टेम-सेल थेरेपी उम्मीदवारों की एक आशाजनक पाइपलाइन के साथ, यह अनुमान लगाया गया है किनैदानिक अनुप्रयोगों की मांगों को पूरा करने के लिए प्रति वर्ष 300 ट्रिलियन एचएमएससी की आवश्यकता होगी। इसलिए, चिकित्सीय कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर निर्माण इस तरह की उच्च सेल मांग के साथ इन चिकित्सीय हस्तक्षेपों को करने के लिए एक शर्त बन गयाहै।
प्लानर प्रणालियों के असफलताओं को दूर करने के लिए, पारंपरिक गैर-विघटित माइक्रोकैरियर10,11,12,13 के साथ हलचल-टैंक बायोरिएक्टरों में बड़े पैमाने पर विनिर्माण प्रक्रियाओं को विकसित करने के प्रयास किए गए हैं, लेकिन ये जटिल तैयारी प्रक्रियाओं और कम सेल-कटाईदक्षता से ग्रस्त हैं।. हाल ही में, हमने स्टेम सेल विस्तार के लिए एक विघटित माइक्रोकैरियर का नवाचार किया है, जिसका उद्देश्य पारंपरिक गैर-विघटित वाणिज्यिक माइक्रोकैरियर15 से सेल कटाई की चुनौतियों को दरकिनार करना है। यह उपन्यास, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीएमपी-ग्रेड 3 डी घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर, 3 डी टेबलट्रिक्स ने बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन के लिए बड़ी क्षमता दिखाई है। दरअसल, इन छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स पर आधारित 3 डी संस्कृति संभावित रूप से सेल आसंजन, प्रसार, प्रवासन और सक्रियण को बढ़ावा देने के लिए अनुकूल बायोमिमेटिक माइक्रोएन्वायरमेंटको फिर से बना सकती है। माइक्रोकैरियर्स की छिद्रपूर्ण संरचनाएं और परस्पर छिद्र नेटवर्क एक बड़ा सेल आसंजन क्षेत्र बना सकते हैं और ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और मेटाबोलाइट्स के आदान-प्रदान को बढ़ावा दे सकते हैं, इस प्रकार इन विट्रो सेल विस्तारके लिए एक इष्टतम सब्सट्रेट बना सकते हैं। इन जीएमपी-ग्रेड 3 डी घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स की उच्च छिद्रता एचएमएससी के बड़े पैमाने पर विस्तार को सक्षम बनाती है, और कोशिकाओं को पूरी तरह से भंग करने की क्षमता इनविस्तारित कोशिकाओं की कुशल कटाई की अनुमति देती है। यह एक जीएमपी-ग्रेड उत्पाद भी है और इसे चाइनीज सेंटर फॉर ड्रग इवैल्यूएशन (फाइलिंग नंबर: F20210000003 और F20200000496) 19 और संयुक्त राज्य अमेरिका के एफडीए (एफडीए, यूएसए) के साथ एक फार्मास्युटिकल एक्सिपिएंट के रूप में पंजीकृत किया गया है। ड्रग मास्टर फ़ाइल नंबर: 35481)20.
यहां, हम एचएमएससी, HEK293T सेल और वेरो सेल विस्तार के लिए इन फैलाने योग्य और विघटित छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स का उपयोग करके एक स्वचालित बंद औद्योगिक पैमाने सेल उत्पादन (एसीआईएससीपी) सिस्टम18 का वर्णन करते हैं। हमने 5 एल बायोरिएक्टर से 15 एल बायोरिएक्टर तक एचएमएससी (9 दिनों में 128 संचयी गुना विस्तार) का सफल दो-स्तरीय विस्तार हासिल किया और अंत में उत्पादन के एक बैच से 1.1 x 1010 एचएमएससी तक प्राप्त किया। कोशिकाओं को माइक्रोकैरियर्स को पूरी तरह से भंग करके काटा गया था, एक निरंतर प्रवाह सेंट्रीफ्यूज-आधारित सेल प्रोसेसिंग सिस्टम के साथ केंद्रित, धोया और तैयार किया गया था, और फिर सेल भरने की प्रणाली के साथ अलीकोट किया गया था। इसके अलावा, हमने अनुपालन की पुष्टि करने के लिए एचएमएससी उत्पादों की गुणवत्ता का आकलन किया। हमने दो अन्य प्रकार की एंकरेज कोशिकाओं, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं के स्केल-अप उत्पादन के लिए इन विघटित माइक्रोकैरियर्स के आवेदन का भी प्रदर्शन किया, जो सीजीटी उद्योग में बड़े पैमाने पर लागू होते हैं। HEK293T कोशिकाओं का पीक सेल घनत्व 1.68 x 10 7 सेल / एमएल तक पहुंच गया, जबकि वेरो कोशिकाओं का चरम घनत्व 1.08 x 107 सेल / एमएल तक पहुंच गया। एसीआईएससीपी प्रणाली को विभिन्न प्रकार के अनुयायी कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और यह संभावित रूप से सीजीटी के औद्योगिकीकरण में तेजी लाने में योगदान देने वाला एक शक्तिशाली मंच बन सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin EDTA</td>
			<td >BasalMedia</td>
			<td >S310JV</td>
			<td >Used for 2D cell harvest.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Digest</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R001-500</td>
			<td >This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix MSC Serum Free Medium</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >RMZ112</td>
			<td >This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Filtration Module</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-10</td>
			<td >This module contains 0.22 &#956;m capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-03</td>
			<td >Used as feed bag for 5 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-01</td>
			<td >Used as cell seeding or transfer bags.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-04</td>
			<td >Used as feed bag for 15 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&#38;Finish Consumable Kit</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >PACK-01-01</td>
			<td >This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >vivaPACK</td>
			<td >This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >vivaPREP PLUS</td>
			<td >This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >PREP-PLUS-00</td>
			<td >This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN&#160; bioreactor 15 L</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >FTVS15</td>
			<td >This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN&#160; bioreactor 5 L</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >FTVS05</td>
			<td >This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-10-10</td>
			<td >This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-05-10</td>
			<td >This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D TableTrix microcarriers G02</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >G02-10-10g</td>
			<td >These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D TableTrix microcarriers V01</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >V01-100-10g</td>
			<td >These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D TableTrix microcarriers W01</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >W01-10-10g (single-use packaging); 
			W01-200 (tablets)</td>
			<td >These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >368512</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcein-AM/PI Double Staining Kit</td>
			<td >Dojindo</td>
			<td >C542</td>
			<td >Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td>CAP-38</td>
			<td >Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td >374-250-3</td>
			<td >Used for tube welding and disconnection.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CryoMACS Freezing Bag 50</td>
			<td >Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td >200-074-400</td>
			<td >Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&#38;Finish Consumable Kit.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulfate (DMSO)&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650-100mL</td>
			<td >Used for preparation of cryopreservation solution.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >BasalMedia</td>
			<td >L120KJ</td>
			<td >Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >218016357</td>
			<td >Used for waste collection from the 5 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >218017353</td>
			<td >Used for waste collection from the 15 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >218014459</td>
			<td >Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td>EZ500 ML-38-2</td>
			<td >Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS) superior quality</td>
			<td >Wisent</td>
			<td >086-150</td>
			<td >Used for cultivation of HEK293T cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >301804</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC anti-human CD34 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >343504</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >328108</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow cytometry</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >CytoFLEX</td>
			<td >Used for cell identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Cell Analyzer</td>
			<td >Alit life science</td>
			<td >Countstar Rigel S2</td>
			<td >Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports&#160;</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >292632806</td>
			<td >Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Meter</td>
			<td >Sinocare</td>
			<td >6243578</td>
			<td >Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025092</td>
			<td >Used for preparation of digest solution.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human Albumin 20% Behring (HSA)</td>
			<td >CSL Behring</td>
			<td >N/A</td>
			<td >Used for preparation of wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted fluorescent microscope</td>
			<td >OLYMBUS</td>
			<td >CKX53SF</td>
			<td >Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3662-0500PK</td>
			<td >Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Newborn calf serum (NBS) superfine</td>
			<td >MINHAI BIO</td>
			<td >SC101.02</td>
			<td >Used for cultivation of Vero cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit</td>
			<td >Cyagen</td>
			<td >HUXUC-90031</td>
			<td >Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit</td>
			<td >Cyagen</td>
			<td >HUXUC-90041</td>
			<td >Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit</td>
			<td >Cyagen</td>
			<td >HUXUC-90021</td>
			<td >Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human CD105 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >800504</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human CD19 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >302208</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human CD73 (Ecto-5&#39;-nucleotidase) Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >344004</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >307605</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Wisent</td>
			<td >311-010-CL</td>
			<td >Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td >ULTRA-C-125-2F</td>
			<td >Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Saline</td>
			<td >Hopebiol</td>
			<td >HBPP008-500</td>
			<td >Used for preparation of wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypzyme Recombinant Trypsin</td>
			<td >BasalMedia</td>
			<td >S342JV</td>
			<td >This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube Sealer</td>
			<td >Yingqi Biotech</td>
			<td >Tube Sealer I</td>
			<td >This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube Welder for PVC tubing</td>
			<td >Chu Biotech</td>
			<td >Tube Welder Micro I</td>
			<td >Used for welding of PVC tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube Welder for TPE tubing</td>
			<td >Yingqi Biotech</td>
			<td >Tube Welder I-V2</td>
			<td >Used for welding of TPE tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ViaStain AO / PI Viability Stains</td>
			<td >Nexcelom</td>
			<td >CS2-0106-25mL</td>
			<td >Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale cell production based on gmp-grade dissolvable porous microcarriers

सेल और जीन थेरेपी (सीजीटी) उद्योग में शोधकर्ताओं को लंबे समय से कोशिकाओं के कुशल और बड़े पैमाने पर विस्तार में एक दुर्जेय चुनौती का सामना करना पड़ा है। दो-आयामी (2 डी) प्लानर संवर्धन प्रणाली की प्राथमिक कमियों को दूर करने के लिए, हमने मानव मेसेनकाइमल स्टेम / स्ट्रोमल कोशिकाओं (एचएमएससी), HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं सहित अनुयायी कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति के लिए जीएमपी-ग्रेड, विघटित और छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर पर आधारित एक स्वचालित बंद औद्योगिक पैमाने सेल उत्पादन (एसीआईएससीपी) मंच विकसित किया है। बड़े पैमाने पर विस्तार प्राप्त करने के लिए, 5 एल और 15 एल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर के साथ दो-चरण विस्तार आयोजित किया गया था ताकि 9 दिनों के भीतर कुल 128 गुना विस्तार के साथ 1.1 x 1010 एचएमएससी का उत्पादन किया जा सके। कोशिकाओं को माइक्रोकैरियर्स को पूरी तरह से भंग करके काटा गया था, एक निरंतर-प्रवाह सेंट्रीफ्यूज-आधारित सेल प्रोसेसिंग सिस्टम के साथ केंद्रित, धोया और तैयार किया गया था, और फिर सेल भरने की प्रणाली के साथ एलिकोट किया गया था। 2 डी प्लानर संस्कृति की तुलना में, 3 डी संस्कृति से काटे गए एचएमएससी की गुणवत्ता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। हमने सीजीटी क्षेत्र में अन्य लोकप्रिय सेल प्रकारों के लिए इन घुलने योग्य छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स को भी लागू किया है; विशेष रूप से, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं को क्रमशः 1.68 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल और 1.08 x 107 कोशिकाओं / एमएल के चरम सेल घनत्व के लिए खेती की गई है। यह अध्ययन एक बायोप्रोसेस इंजीनियरिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो जीएमपी-ग्रेड घुलने योग्य माइक्रोकैरियर ्स और उन्नत बंद उपकरणों की विशेषताओं का उपयोग करता है ताकि अनुयायी कोशिकाओं के औद्योगिक पैमाने पर निर्माण को प्राप्त किया जा सके।

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

एसीआईएससीपी प्लेटफॉर्म एक पूरी तरह से बंद प्रणाली है जो स्केल-अप विस्तार के लिए हलचल-टैंक बायोरिएक्टर की एक श्रृंखला, स्वचालित सेल कटाई और सूत्रीकरण के लिए एक सेल प्रोसेसिंग सिस्टम और एक सेल फिलिंग सि...

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Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers (Video) | JoVE

यहां, हम जीएमपी-ग्रेड विघटित माइक्रोकैरियर ्स पर आधारित पूरी तरह से बंद प्रणाली के माध्यम से अनुयायी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर निर्माण को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं, HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं की खेती को मान्य किया गया था और सेल और जीन थेरेपी उद्योग के लिए मात्रा की मांग और गुणवत्ता मानदंड दोनों को पूरा किया गया था।

जीएमपी-ग्रेड विघटित छिद्रपूर्ण माइक्रोकैरियर्स पर आधारित बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

सेल और जीन थेरेपी उद्योग ने पिछले दो दशकों में एक घातीय विस्तार देखा है। हालांकि, प्रयोगशाला अनुसंधान और औद्योगिक कौशल विनिर्माण के बीच एक बड़ा तकनीकी अंतर मौजूद है। नियामक नीतियों के अनुरूप, और सीजीटी उद्योग की हरी मांगों को पूरा करने के लिए, सेल चिकित्सीय का उत्पादन करने के लिए स्वचालित बंद प्रणालियों को अपनाया गया है।अनुयायी कोशिकाओं के लिए, स्केलेबल हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में माइक्रोकैरियर का उपयोग करके खेती, एक आशाजनक तरीका है। परंपरागत रूप से, वाणिज्यिक माइक्रोकैरियर गैर-वांछनीय हैं। ट्रिप्सिनाइजेशन का उपयोग करके सेल कटाई और आकार से माइक्रोकैरियर को बचाने न केवल अक्षम और चुनौतीपूर्ण है, बल्कि सेल की गुणवत्ता को भी प्रभावित करता है और सुरक्षा चिंताओं का कारण बनता है।इस अध्ययन में, हमने एक स्वचालित और बंद प्रणाली में जीएमपी-ग्रेड 3 डी टेबलट्रिक्स विघटित माइक्रोकैरियर के आधार पर बड़े पैमाने पर सेल उत्पादन सफलतापूर्वक हासिल किया है। नौ दिनों के भीतर दो-चरण विस्तार में 11 बिलियन से अधिक मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन किया गया था। हमने HEK293T कोशिकाओं और वेरो कोशिकाओं की उच्च घनत्व संस्कृति का भी प्रदर्शन किया, जिसमें दोनों घनत्व प्रति मिलीलीटर 10 मिलियन कोशिकाओं से ऊपर पहुंच गए।यह उन्नत बायोमैन्युफैक्चरिंग प्लेटफॉर्म पालन कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से विस्तारित करने और पूरी तरह से स्वचालित और बंद तरीके से कटाई करने की अनुमति देता है। हमारा प्रोटोकॉल सीजीटी उत्पादों के औद्योगिक पैमाने पर विनिर्माण में उत्पादन दक्षता बढ़ाने और गुणवत्ता नियंत्रण को परिष्कृत करने का अवसर प्रदान करता है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of the Stirred-Tank Bioreactor for Large-Scale Production of Human Mesenchymal Stem Cells

मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए हलचल-टैंक बायोरिएक्टर की तैयारी

Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor

Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor (Video) | JoVE 