Name: Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers at JoVE.com

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального научного фонда выдающихся молодых ученых (82125018).

Человеческая пуповина была получена из пекинской больницы Цинхуа Чангэн. Все процедуры и протоколы, касающиеся получения, выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (ВЦМСК), проводились с информированного согласия и с одобрения Комитета по этике Пе...

Closed System Production of Adherent Cells Based on Dissolvable Microcarriers

<ol>
	<li>Golchin, A., Farahany, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+products:+Cellular+therapy+and+FDA+approved+products.">Biological products: Cellular therapy and FDA approved products.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).</li><li>Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+cell+and+gene+therapy+potential+patient+and+financial+impact:+US+projections+of+product+approvals,+patients+treated,+and+product+revenues.">Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues.</a> Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).</li><li>Elverum, K., Whitman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+cellular+and+gene+therapies+to+patients:+solutions+for+realizing+the+potential+of+the+next+generation+of+medicine.">Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine.</a> Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).</li><li>Blache, U., Popp, G., D&#252;nkel, A., Koehl, U., Fricke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+solutions+for+manufacture+of+CAR+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy.</a> Nature Communications. 13 (1), 5225 (2022).</li><li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+process+scale-up+challenges+for+commercial-scale+manufacturing+of+allogeneic+pluripotent+stem+cell+products.">Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products.</a> Bioengineering. 9 (3), 92 (2022).</li><li>Emerson, J., Glassey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocess+monitoring+and+control:+Challenges+in+cell+and+gene+therapy.">Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722 (2021).</li><li>Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+therapy:+progress+in+manufacturing+and+assessments+of+potency.">Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency.</a> Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).</li><li>Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+MSC-Are+we+there+yet.">Peak MSC-Are we there yet.</a> Frontiers in Medicine. 5, 178 (2018).</li><li>. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030 Available from: <a target="_blank" href="https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html">https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html</a> (2019)</li><li>Elseberg, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier-based+expansion+process+for+hMSCs+with+high+vitality+and+undifferentiated+characteristics.">Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics.</a> The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).</li><li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, d. a., L, C., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+microcarrier+screening+and+agitated+culture+conditions+improves+human+mesenchymal+stem+cell+yield+in+bioreactors.">Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).</li><li>Tavassoli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+stem+cells+utilizing+microcarriers:+A+biomaterials+engineering+perspective+from+academic+research+to+commercialized+products.">Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products.</a> Biomaterials. 181, 333-346 (2018).</li><li>Mizukami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+large-scale+umbilical+cord-derived+MSC+expansion:+Experimental+performance+and+cost+of+goods+analysis.">Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis.</a> Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersible+and+dissolvable+porous+microcarrier+tablets+enable+efficient+large-scale+human+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).</li><li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture.">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 17-39 (2011).</li><li>Loh, Q. L., Choong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+scaffolds+for+tissue+engineering+applications:+Role+of+porosity+and+pore+size.">Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMP-grade+microcarrier+and+automated+closed+industrial+scale+cell+production+platform+for+culture+of+MSCs.">GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).</li><li>NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation Available from: <a target="_blank" href="https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e">https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e</a> (2023)</li><li>List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs">https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs</a> (2023)</li><li>Beeravolu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+umbilical+cord+and+fetal+placenta.">Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quality+evaluation+system+establishment+of+mesenchymal+stromal+cells+for+cell-based+therapy+products.">The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 176 (2020).</li><li>Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+by+design+to+define+critical+process+parameters+for+mesenchymal+stem+cell+expansion.">Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion.</a> Biotechnology Advances. 50, 107765 (2021).</li><li>Silva Couto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+mesenchymal+stem/stromal+cells+(hMSCs)+in+bioreactors+using+microcarriers:+Lessons+learnt+and+what+the+future+holds.">Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds.</a> Biotechnology Advances. 45, 107636 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+bead-to-bead+cell-transfer+method+for+serial+subculture+and+large-scale+expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+bioreactors.">Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors.</a> Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).</li><li>Tsai, A. C., Pacak, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocessing+of+human+mesenchymal+stem+cells:+From+planar+culture+to+microcarrier-based+bioreactors.">Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors.</a> Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).</li><li>Hewitt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+microcarriers.">Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers.</a> Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).</li><li>Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+downstream+separation+processes+for+mesenchymal+stromal+cells+cultured+in+microcarrier-based+stirred+suspension+bioreactors.">Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).</li><li>Schirmaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+production+in+stirred+single-use+bioreactors+under+low-serum+conditions.">Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions.</a> Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).</li><li>Lawson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+for+expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+in+a+50L+single-use+stirred+tank+bioreactor.">Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microcarrier+culture+of+HEK293T+cells+and+Vero+cells+in+single-use+bioreactors.">Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors.</a> AMB Express. 9 (1), 70 (2019).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+scalable+vaccinia+virus-based+vector+production+process+using+dissolvable+porous+microcarriers.">Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers.</a> 25th Annual Meeting of the American Society of Gene &amp; Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).</li></ol>

Как иммунотерапия, так и терапия стволовыми клетками используют живые клетки в качестве лекарств; Однако их конечные продукты не должны очищаться или стерилизоваться так же, как малые молекулы или вирусы. Таким образом, принцип качества по проектированию (QbD) всегда должен иметь в виду ?...

За последние два десятилетия индустрия CGT стала свидетелем экспоненциального роста. Ожидается, что эволюция лекарственных средств нового поколения позволит лечить и излечивать многочисленные рефрактерные заболевания1. С момента первого одобрения Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) продукта CGT Kymriah в 2017 году исследования и разработки, связанные с CGT, в мире продолжали расти быстрыми темпами, при этом FDA отмечает, что количество активных заявок на новые экспериментальные препараты для CGT увеличилось до 500 в 2018году. Прогнозировалось, что к 2030 году количество одобренных продуктов CGT, вероятно, составит 54-74 в СоединенныхШтатах.
Несмотря на то, что быстрый рост исследований и инноваций в области CGT является захватывающим, все еще существует большой технологический разрыв между лабораторными исследованиями и производством в промышленных масштабах, который мог бы доставить эти перспективные лекарства для охвата такого количества пациентов, которое необходимо, по доступным ценам. Нынешние процессы, принятые для этих клинических испытаний, были разработаны в лабораториях для проведения небольших экспериментов, и необходимы значительные усилия для совершенствования и внедрения инновацийв производство CGT. Существует множество типов продуктов CGT, большинство из которых основаны на живых клетках, которые могут быть аллогенными, аутологичными, инженерными или натуральными. Эти живые лекарства намного сложнее, чем мелкомолекулярные соединения или биологические препараты, что делает крупномасштабное производство серьезной проблемой 4,5,6. В этой работе мы демонстрируем крупномасштабный протокол производства клеток для трех якорно-зависимых клеток, которые широко применяются в CGT. К ним относятся мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (МСК), которые используются для клеточной терапии, а также клетки HEK293T и Vero, которые используются для производства вирусов для генной инженерии конечного терапевтического клеточного продукта. Клетки, зависящие от якорения, обычно культивируются на планарных системах, которые требуют ручной обработки. Однако ручные методы культивирования требуют значительного количества труда и подвержены загрязнению, что может поставить под угрозу качество конечного продукта. Кроме того, отсутствует поточный контроль процесса, что приводит к существенной вариабельности качества между партиями7. Если взять в качестве примера терапию стволовыми клетками, то с многообещающим портфелем из более чем 200 кандидатов на терапию стволовыми клетками, по оценкам, для удовлетворения потребностей клинического применения потребуется 300 триллионов МСКв год8. Таким образом, крупномасштабное производство терапевтических клеток стало необходимым условием для проведения этих терапевтических вмешательств с такойвысокой потребностью в клетках.
Чтобы избежать неудач планарных систем, были предприняты усилия по разработке крупномасштабных производственных процессов в биореакторах с перемешиванием с обычными нерастворимыми микроносителями 10,11,12,13, но они страдают от сложных процедур подготовки и низкой эффективности сбора клеток 14. Недавно мы разработали инновационный растворимый микроноситель для экспансии стволовых клеток, стремясь обойти проблемы, связанные с забором клеток из обычных нерастворимых коммерческих микроносителей15. Этот новый, коммерчески доступный 3D-растворимый пористый микроноситель 3D-класса GMP, 3D TableTrix, продемонстрировал большой потенциал для крупномасштабного производства клеток. Действительно, 3D-культура, основанная на этих пористых микроносителях, потенциально может воссоздать благоприятную биомиметическую микросреду для стимулирования клеточной адгезии, пролиферации, миграциии активации. Пористые структуры и взаимосвязанные пористые сети микроносителей могут создавать большую площадь клеточной адгезии и способствовать обмену кислорода, питательных веществ и метаболитов, тем самым создавая оптимальный субстрат для клеточной экспансии in vitro 17. Высокая пористость этих растворимых пористых микроносителей 3D-класса GMP позволяет крупномасштабно расширять хМСК, а способность клеток полностью растворяться позволяет эффективно собирать эти расширенные клетки18. Он также является продуктом класса GMP и был зарегистрирован в качестве фармацевтического вспомогательного вещества в Китайском центре оценки лекарственных средств (регистрационные номера: F20210000003 и F20200000496)19 и FDA Соединенных Штатов (FDA, США; Номер главного дела о наркотиках: 35481)20.
Здесь мы проиллюстрируем автоматизированную систему производства ячеек закрытого промышленного масштаба (ACISCP)18, использующую эти диспергируемые и растворимые пористые микроносители для hMSC, HEK293T cell и расширения клеток Vero. Мы добились успешного двухуровневого расширения МСК (128 кумулятивных расширений за 9 дней) из биореактора объемом 5 л в биореактор объемом 15 л и, наконец, получили до 1,1 x 1010 МСК из одной партии продукции. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. Кроме того, мы оценили качество продуктов hMSC для подтверждения соответствия. Мы также продемонстрировали применение этих растворимых микроносителей для масштабного производства двух других типов ячеек крепления, ячеек HEK293T и клеток Vero, которые широко применяются в отрасли CGT. Пиковая плотность клеток HEK293T клеток достигала 1,68 x 10 7 клеток/мл, тогда как пиковая плотность клеток Vero достигала 1,08 x 107 клеток/мл. Система ACISCP может быть адаптирована для культивирования различных адгезивных клеток, и потенциально она может стать мощной платформой, способствующей ускорению индустриализации CGT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% trypsin EDTA</td>
			<td >BasalMedia</td>
			<td >S310JV</td>
			<td >Used for 2D cell harvest.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Digest</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R001-500</td>
			<td >This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix MSC Serum Free Medium</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >RMZ112</td>
			<td >This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Filtration Module</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-10</td>
			<td >This module contains 0.22 &#956;m capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-03</td>
			<td >Used as feed bag for 5 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-01</td>
			<td >Used as cell seeding or transfer bags.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-00-04</td>
			<td >Used as feed bag for 15 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&#38;Finish Consumable Kit</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >PACK-01-01</td>
			<td >This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >vivaPACK</td>
			<td >This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >vivaPREP PLUS</td>
			<td >This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >PREP-PLUS-00</td>
			<td >This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN&#160; bioreactor 15 L</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >FTVS15</td>
			<td >This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN&#160; bioreactor 5 L</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >FTVS05</td>
			<td >This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-10-10</td>
			<td >This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >R020-05-10</td>
			<td >This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D TableTrix microcarriers G02</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >G02-10-10g</td>
			<td >These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D TableTrix microcarriers V01</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >V01-100-10g</td>
			<td >These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3D TableTrix microcarriers W01</td>
			<td >CytoNiche Biotech</td>
			<td >W01-10-10g (single-use packaging); 
			W01-200 (tablets)</td>
			<td >These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC anti-human CD45 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >368512</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcein-AM/PI Double Staining Kit</td>
			<td >Dojindo</td>
			<td >C542</td>
			<td >Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td>CAP-38</td>
			<td >Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td >374-250-3</td>
			<td >Used for tube welding and disconnection.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CryoMACS Freezing Bag 50</td>
			<td >Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td >200-074-400</td>
			<td >Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&#38;Finish Consumable Kit.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulfate (DMSO)&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650-100mL</td>
			<td >Used for preparation of cryopreservation solution.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >BasalMedia</td>
			<td >L120KJ</td>
			<td >Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >218016357</td>
			<td >Used for waste collection from the 5 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >218017353</td>
			<td >Used for waste collection from the 15 L bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >218014459</td>
			<td >Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td>EZ500 ML-38-2</td>
			<td >Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS) superior quality</td>
			<td >Wisent</td>
			<td >086-150</td>
			<td >Used for cultivation of HEK293T cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC anti-human CD14 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >301804</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC anti-human CD34 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >343504</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >328108</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow cytometry</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >CytoFLEX</td>
			<td >Used for cell identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Cell Analyzer</td>
			<td >Alit life science</td>
			<td >Countstar Rigel S2</td>
			<td >Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports&#160;</td>
			<td >DWK life sciences</td>
			<td >292632806</td>
			<td >Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose Meter</td>
			<td >Sinocare</td>
			<td >6243578</td>
			<td >Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025092</td>
			<td >Used for preparation of digest solution.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human Albumin 20% Behring (HSA)</td>
			<td >CSL Behring</td>
			<td >N/A</td>
			<td >Used for preparation of wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted fluorescent microscope</td>
			<td >OLYMBUS</td>
			<td >CKX53SF</td>
			<td >Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3662-0500PK</td>
			<td >Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Newborn calf serum (NBS) superfine</td>
			<td >MINHAI BIO</td>
			<td >SC101.02</td>
			<td >Used for cultivation of Vero cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit</td>
			<td >Cyagen</td>
			<td >HUXUC-90031</td>
			<td >Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit</td>
			<td >Cyagen</td>
			<td >HUXUC-90041</td>
			<td >Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit</td>
			<td >Cyagen</td>
			<td >HUXUC-90021</td>
			<td >Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human CD105 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >800504</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human CD19 Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >302208</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human CD73 (Ecto-5&#39;-nucleotidase) Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >344004</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PE anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >307605</td>
			<td >Used in flow cytometry for MSC identity assessment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Wisent</td>
			<td >311-010-CL</td>
			<td >Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td >ULTRA-C-125-2F</td>
			<td >Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Saline</td>
			<td >Hopebiol</td>
			<td >HBPP008-500</td>
			<td >Used for preparation of wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypzyme Recombinant Trypsin</td>
			<td >BasalMedia</td>
			<td >S342JV</td>
			<td >This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube Sealer</td>
			<td >Yingqi Biotech</td>
			<td >Tube Sealer I</td>
			<td >This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube Welder for PVC tubing</td>
			<td >Chu Biotech</td>
			<td >Tube Welder Micro I</td>
			<td >Used for welding of PVC tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tube Welder for TPE tubing</td>
			<td >Yingqi Biotech</td>
			<td >Tube Welder I-V2</td>
			<td >Used for welding of TPE tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ViaStain AO / PI Viability Stains</td>
			<td >Nexcelom</td>
			<td >CS2-0106-25mL</td>
			<td >Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale cell production based on gmp-grade dissolvable porous microcarriers

Исследователи в области клеточной и генной терапии (ВКТ) уже давно сталкиваются с серьезной проблемой эффективного и крупномасштабного размножения клеток. Чтобы устранить основные недостатки двумерной (2D) планарной системы культивирования, мы разработали инновационную платформу автоматизированного закрытого промышленного производства клеток (ACISCP) на основе растворимого и пористого микроносителя GMP-класса для 3D-культивирования адгезивных клеток, включая мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (hMSCs), HEK293T клетки и клетки Vero. Для достижения крупномасштабного расширения было проведено двухступенчатое расширение с помощью биореакторов с перемешиванием объемом 5 л и 15 л с получением 1,1 x10 10 гМСК с общим расширением в 128 раз в течение 9 дней. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. По сравнению с 2D планарной культурой нет существенных различий в качестве МСК, собранных из 3D-культуры. Мы также применили эти растворимые пористые микроносители к другим популярным типам клеток в секторе CGT; В частности, HEK293T клетки и клетки Vero культивировались до пиковой плотности клеток 1,68 x 10 7 клеток/мл и 1,08 x 107 клеток/мл соответственно. В этом исследовании представлен протокол использования платформы биотехнологической инженерии, использующей характеристики растворимых микроносителей класса GMP и передового закрытого оборудования для производства адгезивных клеток в промышленных масштабах.

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Платформа ACISCP представляет собой полностью закрытую систему, в которой используется ряд биореакторов с перемешиванием для расширения масштабирования, система обработки клеток для автоматизированного сбора и составления клеточных формулировок, а также система наполнения клеток (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers at JoVE.com

Advancing Cell Therapy Manufacturing with Dissolvable Microcarriers (Video) | JoVE

Здесь мы представляем протокол для достижения крупномасштабного производства адгезивных клеток с помощью полностью закрытой системы на основе растворимых микроносителей GMP-класса. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека, клеток HEK293T и клеток Vero было валидировано и соответствовало как количественным требованиям, так и критериям качества для индустрии клеточной и генной терапии.

Крупномасштабное производство клеток на основе растворимых пористых микроносителей GMP-класса

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

За последние два десятилетия индустрия клеточной и генной терапии стала свидетелем экспоненциального роста. Тем не менее, существует большой технологический разрыв между лабораторными исследованиями и производством промышленных навыков. В соответствии с нормативной политикой и для удовлетворения экологических требований отрасли CGT для производства клеточной терапии были внедрены автоматизированные закрытые системы.Для адгезивных клеток перспективным является культивирование с использованием микроносителей в масштабируемых биореакторах с перемешиванием. Как правило, коммерциализированные микроносители нежелательны. Забор клеток с помощью трипсинизации и сохранения микроносителей по размеру не только неэффективен и сложен, но и влияет на качество клеток и вызывает проблемы с безопасностью.В этом исследовании мы успешно добились крупномасштабного производства клеток на основе растворимых микроносителей 3D TableTrix GMP-класса в автоматизированной и закрытой системе. Более 11 миллиардов мезенхимальных стволовых клеток человека были получены в результате двухступенчатого расширения в течение девяти дней. Мы также продемонстрировали высокую плотность культивирования клеток HEK293T и Vero, в которых обе плотности достигали более 10 миллионов клеток на миллилитр.Эта передовая биопроизводственная платформа позволяет эффективно расширять и полностью собирать клетки адгезии автоматизированным и закрытым способом. Наш протокол дает возможность повысить эффективность производства и усовершенствовать контроль качества при промышленном производстве продукции CGT.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of the Stirred-Tank Bioreactor for Large-Scale Production of Human Mesenchymal Stem Cells

Подготовка биореактора с перемешиванием для крупномасштабного производства мезенхимальных стволовых клеток человека

Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor

Two-Tiered Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells from 5-Liter to 15-Liter Bioreactors and Automated Cell Formulation from a 15-Liter Bioreactor (Video) | JoVE 

Двухуровневое расширение мезенхимальных стволовых клеток человека с 5-литровых до 15-литровых биореакторов и автоматизированная клеточная формулировка из 15-литрового биореактора