Name: מחבר באור הזרקורים: זיהוי איזומר Histone PTM משופר באמצעות LC-TIMS-ToF MS/MS ו-PASEF
Uploaded: 2024-01-12T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry at JoVE.com

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. HRD-1547798 ומענק מס' HRD-2111661. מענקי NSF אלה הוענקו לאוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה כחלק מתוכנית המרכז למצוינות במחקר במדע וטכנולוגיה (CREST). זוהי תרומה מספר 1672 מהמכון לסביבה, תוכנית בולטת באוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה. תמיכה נוספת ניתנה על ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת מענק מס '. R21AI135469 לפרנסיסקו פרננדז-לימה וגרנט לא. R01HD106051 לבנג'מין א. גרסיה, כמו גם על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. CHE-2127882 לבנג'מין א. גרסיה. המחברים רוצים להודות על התמיכה הראשונית של ד"ר מריו גומז הרננדז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים.

הערה: דגימות היסטון חולצו בשיטה שאומצה מ- Bhanu et al. (2020)12.
1. הכנת מדגם
<ol><li>קצירת תאים בתרבית<ol><li>כאשר התאים נפגשים ב-80%, ודא שהם בני קיימא באמצעות הרחקת טריפאן כחול. הערה: קו תאי HeLa S3 שימש לניסויים אלה, אך ניתן ליישם שיטה זו על כל תא בתרבית.</li>
		<li>יש לשאוף את...

ניתוח היסטון פרוטאומי ואפיון שינויים לאחר תרגום

<ol>
	<li>Zhao, Z., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modifications+of+histones+in+cancer.">Epigenetic modifications of histones in cancer.</a> Genome Biology. 20, 245 (2019).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+16+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 &#197; resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).</li><li>Kornberg, R. D., Thomas, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+Oligomers+of+the+histones:+The+histones+comprise+an+(F2A1)2(F3)2+tetramer,+a+different+oligomer+of+F2A2+and+F2B,+and+monomer+of+F1.">Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1.</a> Science. 184 (4139), 865-868 (1974).</li><li>Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+modifications+in+atherosclerosis:+From+the+past+to+the+future.">DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future.</a> Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).</li><li>Jeanne Dit Fouque, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Double-Down&amp;#34;+mass+spectrometry+of+histone+H4+proteoforms:+Tandem+ultraviolet-photon+and+mobility/mass-selected+electron+capture+dissociations.">34;Double-Down&amp;#34; mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations.</a> Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).</li><li>Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+thinking:+How+histone+modifications+regulate+gene+expression.">Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression.</a> Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF):+Multiplying+sequencing+speed+and+sensitivity+by+synchronized+scans+in+a+trapped+ion+mobility+device.">Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).</li><li>Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometry.">An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).</li><li>Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+characteristics+of+a+new+hybrid+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometer+(TripleTOF+5600).">Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600).</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).</li><li>Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Workflow+for+ultra-rapid+analysis+of+histone+posttranslational+modifications+with+direct-injection+mass+spectrometry.">A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry.</a> Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).</li><li>Xue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+serum+biomarkers+for+pancreatic+adenocarcinoma+using+proteomic+analysis.">Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis.</a> British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10S+cells.">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+posttranslational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Romson, J., Emmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+calibration+options+for+accurate+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).</li><li>Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+review+of+bottom-up+proteomics:+The+good,+the+bad,+and+the+future+of+this+field.">A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field.</a> Proteomes. 8 (3), 14 (2020).</li><li>Ho, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+structural+proteomics:+cryoEM+of+protein+complexes+enriched+from+the+cellular+milieu.">Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu.</a> Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).</li><li>Eickbush, T., Moudrianakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+core+complex:+an+octamer+assembled+by+two+sets+of+protein-protein+interactions.">The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions.</a> Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).</li><li>Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+view+of+the+epigenetic+landscape.+Part+II:+Histone+posttranslational+modification,+nucleosome+level,+and+chromatin+regulation+by+ncRNAs.">A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs.</a> Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).</li><li>Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+autoantibodies+as+biomarkers+for+early+cancer+detection.">Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection.</a> The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).</li><li>Huang, R. X., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+pathways+and+targets+for+radiotherapy+sensitization+in+cancer.">DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).</li><li>Dantuma, N. P., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+posttranslational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response.</a> The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).</li><li>Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestrictive+identification+of+posttranslational+modifications+through+peptide+mass+spectrometry.">Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).</li><li>Dolan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC+column+problems+everywhere+1.">LC column problems everywhere 1.</a> LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).</li><li>Brusniak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+current+bioinformatic+solutions+for+analyzing+LC-MS+data+acquired+by+selected+reaction+monitoring+technology.">An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology.</a> Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).</li><li>Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+computational+resources+for+designing+selected+reaction+monitoring+transitions.">Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions.</a> Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).</li><li>Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+software+tools+for+design+and+analysis+of+large+scale+MRM+proteomic+datasets.">Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets.</a> Methods. 61, 287-298 (2013).</li></ol>

היסטונים הם חלבונים בסיסיים המווסתים את מבנה הכרומטין על ידי אינטראקציה עם דנ"א בצורה של אוקטמרים המורכבים מארבעת אבני הליבה (שניים כל אחד מ-H2A, H2B, H3 ו-H4)20. היסטונים מכילים שאריות ליזין וארגינין רבות, אשר משתנות בקלות, מה שמוביל ל-PTM נרחב המשנה את הכימיה של הכרומטין על ידי השפעה ע...

בתאים איקריוטים, דנ"א ארוז ככרומטין ליחידות פונקציונליות הנקראות נוקלאוזומים. יחידות אלה מורכבות מאוקטמר של ארבעה אבני ליבה (שניים כל אחד מ-H2A, H2B, H3 ו-H4)1,2,3,4. היסטונים הם בין החלבונים הנפוצים והשמורים ביותר באיקריוטים, האחראים במידה רבה לבקרת גנים5. שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון (PTM) ממלאים תפקיד גדול בוויסות הדינמיקה של הכרומטין ובתהליכים ביולוגיים שונים כגון שעתוק DNA, שכפול ותיקון6. PTMs מתרחשים בעיקר על פני השטח הנגישים של אזורי N-terminal של היסטונים הבאים במגע עם DNA 3,7. עם זאת, שינויים בזנב ובליבה משפיעים על מבנה הכרומטין, משנים אינטראקציות בין נוקלאוזומים ומגייסים חלבונים ספציפיים 3,8.
אתגר עכשווי במהלך פרוטאומטריה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) מבוססת פרוטאומיקה הוא שיתוף הפעולה הפוטנציאלי של אנליטים בעלי עניין. במקרה של ניתוחים תלויי נתונים (DDA), זה מתורגם לאובדן פוטנציאלי של מספר יונים מקדימים במהלך תהליך רכישת MS/MS9. מכשירי זמן טיסה (ToF) רוכשים ספקטרום בתדר גבוה מאוד 9,10 (עד עשרות קילוהרץ)11; זה הופך אותם למסוגלים לסרוק במהירות את סך כל היונים המקדימים בתוך מדגם מורכב (MS1), ובכך להבטיח רגישות אופטימלית וקצבי ריצוף MS/MS (עד 100 הרץ)9 ולהפוך אותם לאידיאליים לניתוח דגימה ביולוגית10. עם זאת, הרגישות הזמינה בקצבי סריקה גבוהים אלה מוגבלת על ידי קצב MS/MS9. התוספת של ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים (TIMS) בשילוב עם ספקטרומטר מסות זמן טיסה מרובע אורתוגונלי (qToF) שימשה למיתון מגבלות אלה. ב-TIMS, כל היונים המקדימים נצברים יחד ומדוללים כפונקציה של הניידות שלהם, במקום לבחור מסות מקדימות בודדות עם9 מרובע. פיצול טורי מצטבר מקבילי (PASEF) מאפשר מאות אירועי MS/MS בשנייה ללא כל אובדן רגישות9.
המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להראות את ההתפתחויות האחרונות של DDA באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). PTMs היסטון הוקצו בביטחון בהתבסס על זמני השמירה שלהם (RTs), ניידות ודפוסי פיצול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Animal Origin-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060710</td>
			<td>Finntip Flex 1000 &#956;L, nonsterile, nonfiltered, racked tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060100</td>
			<td>Finntip Flex, 10 &#956;L, nonsterile, non-filtered, racked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Dulbecco&#8217;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>(Mediatech)</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td>Falcon Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-138</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Gel-Loading Tips, 1&#8211;200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060310</td>
			<td>Finntip Flex 200&#956;L, nonsterile, nonfiltered, racked tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>Falcon Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate, V-Bottom 600 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-500-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998</td>
			<td>HPLC, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LS120</td>
			<td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>328110500</td>
			<td>AEBSF hydrochloride, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate, NH4HCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td>BioUltra, &#8805;99.5% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution, NH4OH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1303</td>
			<td>Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon (Ar)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AR HP 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH C18 HPLC column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td>XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 &#197;, 5 &#181;m, 4.6 mm X 250 mm, 1K&#8211;15K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic scoring wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass DataAnalysis 6.0</td>
			<td>Bruker Datonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass HyStar 6.2</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass IsotopePattern</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass timsControl 4.1</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89237526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Lifters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;08100240</td>
			<td>Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary 75 &#956;m ID x 363 &#956;m OD</td>
			<td>(Molex (Polymicro)</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BR747725-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatograph</td>
			<td>&#160;Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>ACS reagent, 37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb 30-40 &#956;m Carbon 150&#8211;300 &#197;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60106-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersep cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60109-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1969-85000</td>
			<td>TuningMix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Anhydrous, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, for HPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td>Optima for HPLC, Fisher Chemical&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Adapters</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>501021514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-200-8727</td>
			<td>Enzo Life Sciences&#160;Microcystin-LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm</td>
			<td>LEAP PAL Parts</td>
			<td>LAP.11190933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: ND3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (N2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI UHP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio X+</td>
			<td>Bioinformatic Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips, Instachek</td>
			<td>Micro Essential Lab</td>
			<td>JR-113</td>
			<td>Model: Hydrion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS reagent, 99.0%&#8211;100.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injection Cell</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>&#160;model: PC77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Anhydride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.00608</td>
			<td>For synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge (700&#8211;18,000 x g)</td>
			<td>NuAire, model: Nuwind</td>
			<td>NU-C200V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 &#956;m, 3 g</td>
			<td>ESI Source Solutions</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4569035</td>
			<td>Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm &#215; 6.7 cm (W &#215; L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11079.06</td>
			<td>98+%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE disk, C18</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76333-134</td>
			<td>Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor</td>
			<td>Savant</td>
			<td>model: SC210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.07651</td>
			<td>suitable for microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid, H2SO4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td>99.999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMS-ToF Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>model Tims tof ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid solution, TCA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td>6.1&#160;N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>Suitable for HPLC, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triversa Nanomate</td>
			<td>Advion</td>
			<td>model: TR263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypsinProtease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LS118</td>
			<td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histone modification screening using liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry

חלבוני היסטון נפוצים מאוד ונשמרים בקרב האיקריוטים וממלאים תפקיד גדול בבקרת גנים כתוצאה ממבנים הידועים כשינויים פוסט-תרגומיים (PTM). זיהוי המיקום והאופי של כל PTM או תבנית של PTM ביחס לגורמים חיצוניים או גנטיים מאפשר למידע זה להיות מתואם סטטיסטית עם תגובות ביולוגיות כגון שעתוק DNA, שכפול או תיקון. בעבודה הנוכחית מתואר פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לזיהוי PTM היסטון מדגימות ביולוגיות. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסות זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) מאפשר הפרדה והקצאה של PTM של השינויים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית באנליזה יחידה. הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישת נתונים תלויים (DDA) באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות, ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. רכיבי Histone PTM מוקצים בבטחה בהתבסס על זמן השמירה, הניידות ודפוס הפיצול שלהם.

In eukaryotic cells, DNA is packaged as chromatin into functional units called nucleosomes. These units are composed of an octamer of four core histones (two each of H2A, H2B, H3, and H4)1,2,3,4. Histones are amongst the most abundant and highly conserved proteins in eukaryotes, which are largely responsible for gene regulation5. Histone posttranslational modifications (PTMs) play a large role in the regulation of chromatin dynamics and rigger various biological processes such as DNA transcription, replication, and repair6. PTMs occur primarily on the accessible surface of the N-terminal regions of histones that are in contact with DNA3,7. However, tail and core modifications influence chromatin structure, altering inter-nucleosome interactions and recruiting specific proteins3,8.
A current challenge during liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based proteomics is the potential co-elution of analytes of interest. In the case of data-dependent analyses (DDA), this translates into the potential loss of several precursor ions during the MS/MS acquisition process9. Time-of-flight (ToF) instruments acquire spectra at very high frequency9,10 (up to tens of kHz)11; this makes them capable of rapidly scanning the total precursor ions within a complex sample (MS1), thus promising optimal sensitivity and MS/MS sequencing rates (up to 100 Hz)9 and making them ideal for biological sample analysis10. Nevertheless, the sensitivity available at these high scan rates is limited by the MS/MS rate9. The addition of trapped ion mobility spectrometry (TIMS) in combination with an orthogonal quadrupole time-of-flight (qToF) mass spectrometer was used to mitigate these limitations. In TIMS, all precursor ions are accumulated in tandem and eluted as a function of their mobility, rather than selecting single precursor masses with a quadrupole9. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) allows for hundreds of MS/MS events per second without any loss of sensitivity9.
The principal aim of this work was to show the recent developments of DDA using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation (CID). Histone PTMs were confidently assigned based on their retention times (RTs), mobilities, and fragmentation patterns.

מחבר באור הזרקורים: זיהוי איזומר Histone PTM משופר באמצעות LC-TIMS-ToF MS/MS ו-PASEF

בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

A method is proposed using histone extraction protocol with 95%efficiency. Together with LC-TIMS-ToF MS/MS, in a short time, it is possible to obtain a screening for those PTMs present in the histone. And above all, the possibility of separating isomers.The separation of isomeric peptides though possible using tandem mass spectrometry alone is often difficult. By incorporating TIMS, we introduce an extra dimension of separation, simplifying many positional isomer identifications. In addition, passive technology increases the sensitivity of these experiments, further improving our ability to analyze epigenetic variations.With the increased ability to identify PTM positions, there comes the ability to further determine the correlation between various environmental or biological factors, and their effects on the epigenome. Methods that improve and facilitate analysis of histones can be applied to several research areas, including medical and environmental chemistry. The dynamics of protein confirmation in native or damaged states will be established from the implementation of TIMS MS/MS with HDX.Through LC-TIMS-ToF MS/MS and Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, the differences in PTM existing in various biological sample will be charted.

תהליך עבודה פרוטאומי מלמטה למעלה (איור 7) כולל בדרך כלל את הדברים הבאים: מיצוי חלבוני המטרה מדגימה גולמית, ולאחר מכן כימות ריכוז החלבונים, ולאחר מכן שבירה, בדרך כלל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל או כרומטוגרפיה נוזלית. לאחר השבירה, החלבונים מתעכלים באמצעות אנזים פרוטאוליטי (לעתים...

Watch this Scientific Journal Video about Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry at JoVE.com

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

שיטה מוצעת באמצעות פרוטוקול מיצוי היסטון עם יעילות של 95%. יחד עם LC-TIMS-ToF MS/MS, תוך זמן קצר, ניתן לקבל סינון עבור אותם PTMs הנמצאים בהיסטון. ומעל לכל, את האפשרות של הפרדת איזומרים.ההפרדה של פפטידים איזומריים, למרות שהיא אפשרית באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם בלבד, היא לעתים קרובות קשה. על ידי שילוב TIMS, אנו מציגים ממד נוסף של הפרדה, ומפשטים זיהויים רבים של איזומרים מיקום. בנוסף, טכנולוגיה פסיבית מגבירה את הרגישות של ניסויים אלה, ומשפרת עוד יותר את יכולתנו לנתח וריאציות אפיגנטיות.עם היכולת המוגברת לזהות עמדות PTM, מגיעה היכולת לקבוע עוד יותר את הקשר בין גורמים סביבתיים או ביולוגיים שונים, ואת השפעתם על האפיגנום. שיטות המשפרות ומקלות על ניתוח היסטונים יכולות להיות מיושמות במספר תחומי מחקר, כולל כימיה רפואית וסביבתית. הדינמיקה של אישור חלבון במצבים טבעיים או פגומים תיקבע מיישום TIMS MS/MS עם HDX.באמצעות LC-TIMS-ToF MS/MS ו-Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, ימופו ההבדלים ב-PTM הקיימים בדגימות ביולוגיות שונות.

histone-modification-screening-using-liquid-chromatography-trapped

Research

JoVE Journal

Chemistry

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [m/z] ratio).