Name: लेखक स्पॉटलाइट: LC-TIMS-ToF MS/MS और PASEF के माध्यम से बढ़ी हुई हिस्टोन PTM आइसोमर पहचान
Uploaded: 2024-01-12T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry at JoVE.com

यह सामग्री राष्ट्रीय विज्ञान प्रतिष्ठान द्वारा अनुदान सं 10/2005-स्थाई के अंतर्गत समथत कार्य पर आधारित है। एचआरडी-1547798 और अनुदान सं. एचआरडी-2111661। ये एनएसएफ अनुदान फ्लोरिडा इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी को विज्ञान और प्रौद्योगिकी (सीआरईएसटी) कार्यक्रम में अनुसंधान उत्कृष्टता केंद्र के हिस्से के रूप में प्रदान किए गए थे। यह पर्यावरण संस्थान से योगदान संख्या 1672 है, जो फ्लोरिडा इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी में एक प्रमुख कार्यक्रम है। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुदान संख्या 10 के अंतर्गत अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी। R21AI135469 फ्रांसिस्को फर्नांडीज-लीमा और ग्रांट नं। बेंजामिन ए गार्सिया के साथ-साथ राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा अनुदान संख्या के तहत R01HD106051। CHE-2127882 बेंजामिन ए. गार्सिया को। लेखक प्रारंभिक विधि विकास के दौरान डॉ मारियो गोमेज़ हर्नांडेज़ के प्रारंभिक समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

नोट: हिस्टोन के नमूने भानु एट अल (2020)12से अनुकूलित विधि का उपयोग करके निकाले गए थे।
1. नमूना तैयार करना
<ol><li>संवर्धित कोशिकाओं की कटाई<ol><li>जब कोशिकाएं 80% संगम होती हैं, तो सुनिश्चित कर...

हिस्टोन प्रोटिओमिक विश्लेषण और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन लक्षण वर्णन

<ol>
	<li>Zhao, Z., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modifications+of+histones+in+cancer.">Epigenetic modifications of histones in cancer.</a> Genome Biology. 20, 245 (2019).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+16+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 &#197; resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).</li><li>Kornberg, R. D., Thomas, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+Oligomers+of+the+histones:+The+histones+comprise+an+(F2A1)2(F3)2+tetramer,+a+different+oligomer+of+F2A2+and+F2B,+and+monomer+of+F1.">Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1.</a> Science. 184 (4139), 865-868 (1974).</li><li>Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+modifications+in+atherosclerosis:+From+the+past+to+the+future.">DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future.</a> Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).</li><li>Jeanne Dit Fouque, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Double-Down&amp;#34;+mass+spectrometry+of+histone+H4+proteoforms:+Tandem+ultraviolet-photon+and+mobility/mass-selected+electron+capture+dissociations.">34;Double-Down&amp;#34; mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations.</a> Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).</li><li>Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+thinking:+How+histone+modifications+regulate+gene+expression.">Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression.</a> Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF):+Multiplying+sequencing+speed+and+sensitivity+by+synchronized+scans+in+a+trapped+ion+mobility+device.">Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).</li><li>Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. 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V., Sidoli, S., Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Workflow+for+ultra-rapid+analysis+of+histone+posttranslational+modifications+with+direct-injection+mass+spectrometry.">A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry.</a> Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).</li><li>Xue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+serum+biomarkers+for+pancreatic+adenocarcinoma+using+proteomic+analysis.">Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis.</a> British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10S+cells.">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li><li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+proteomic+analysis+of+posttranslational+modifications+by+serial+enrichment.">Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Romson, J., Emmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+calibration+options+for+accurate+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).</li><li>Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+review+of+bottom-up+proteomics:+The+good,+the+bad,+and+the+future+of+this+field.">A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field.</a> Proteomes. 8 (3), 14 (2020).</li><li>Ho, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+structural+proteomics:+cryoEM+of+protein+complexes+enriched+from+the+cellular+milieu.">Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu.</a> Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).</li><li>Eickbush, T., Moudrianakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+core+complex:+an+octamer+assembled+by+two+sets+of+protein-protein+interactions.">The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions.</a> Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).</li><li>Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+view+of+the+epigenetic+landscape.+Part+II:+Histone+posttranslational+modification,+nucleosome+level,+and+chromatin+regulation+by+ncRNAs.">A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs.</a> Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).</li><li>Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+autoantibodies+as+biomarkers+for+early+cancer+detection.">Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection.</a> The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).</li><li>Huang, R. X., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+pathways+and+targets+for+radiotherapy+sensitization+in+cancer.">DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).</li><li>Dantuma, N. P., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+posttranslational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response.</a> The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).</li><li>Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestrictive+identification+of+posttranslational+modifications+through+peptide+mass+spectrometry.">Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).</li><li>Dolan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC+column+problems+everywhere+1.">LC column problems everywhere 1.</a> LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).</li><li>Brusniak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+current+bioinformatic+solutions+for+analyzing+LC-MS+data+acquired+by+selected+reaction+monitoring+technology.">An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology.</a> Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).</li><li>Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+computational+resources+for+designing+selected+reaction+monitoring+transitions.">Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions.</a> Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).</li><li>Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+software+tools+for+design+and+analysis+of+large+scale+MRM+proteomic+datasets.">Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets.</a> Methods. 61, 287-298 (2013).</li></ol>

हिस्टोन बुनियादी प्रोटीन होते हैं जो ऑक्टेमर के रूप में डीएनए के साथ बातचीत करके क्रोमैटिन संरचना को नियंत्रित करते हैं जिसमें चार कोर हिस्टोन (एच 2 ए, एच 2 बी, एच 3 और एच 4 में से दो) 20 होते हैं। हिस्...

यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, डीएनए को क्रोमैटिन के रूप में कार्यात्मक इकाइयों में पैक किया जाता है जिन्हें न्यूक्लियोसोम कहा जाता है। ये इकाइयाँ चार कोर हिस्टोन (H2A, H2B, H3 और H4 में से प्रत्येक में दो)1,2,3,4के एक ऑक्टेमर से बनी होती हैं। हिस्टोन यूकेरियोट्स में सबसे प्रचुर मात्रा में और अत्यधिक संरक्षित प्रोटीनों में से हैं, जो जीन विनियमन5 के लिए काफी हद तक जिम्मेदार हैं। हिस्टोन पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) क्रोमैटिन गतिशीलता के नियमन में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं और डीएनए प्रतिलेखन, प्रतिकृति और मरम्मत जैसे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को कठोर करतेहैं। पीटीएम मुख्य रूप से हिस्टोन के एन-टर्मिनल क्षेत्रों की सुलभ सतह पर होते हैं जो डीएनए 3,7 के संपर्क में होते हैं। हालांकि, पूंछ और कोर संशोधनों क्रोमैटिन संरचना को प्रभावित, अंतर-न्यूक्लियोसोम बातचीत को बदलने और विशिष्ट प्रोटीन 3,8 की भर्ती.
तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स के दौरान एक वर्तमान चुनौती ब्याज के विश्लेषणों का संभावित सह-क्षालन है। डेटा-निर्भर विश्लेषण (डीडीए) के मामले में, यह एमएस/एमएस अधिग्रहण प्रक्रिया9के दौरान कई अग्रदूत आयनों के संभावित नुकसान में अनुवाद करता है। उड़ान का समय (टीओएफ) उपकरण बहुत उच्च आवृत्ति 9,10 (दसियों किलोहर्ट्ज़ तक)11पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं; यह उन्हें एक जटिल नमूने (एमएस 1) के भीतर कुल अग्रदूत आयनों को तेजी से स्कैन करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार इष्टतम संवेदनशीलता और एमएस / एमएस अनुक्रमण दर (100 हर्ट्ज तक)9 का वादा करता है और उन्हें जैविक नमूना विश्लेषण10 के लिए आदर्श बनाता है। फिर भी, इन उच्च स्कैन दरों पर उपलब्ध संवेदनशीलता एमएस / एमएस दर9 द्वारा सीमित है। इन सीमाओं को कम करने के लिए ऑर्थोगोनल क्वाड्रूपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट (qToF) मास स्पेक्ट्रोमीटर के संयोजन में फंसे आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री (TIMS) के अलावा इस्तेमाल किया गया था। TIMS में, सभी अग्रदूत आयनों अग्रानुक्रम में जमा कर रहे हैं और एक चौगुनी9 के साथ एकल अग्रदूत जनता का चयन करने के बजाय, उनकी गतिशीलता का एक समारोह के रूप में eluted. समानांतर संचय-सीरियल विखंडन (पीएएसईएफ) संवेदनशीलता के किसी भी नुकसान के बिना प्रति सेकंड सैकड़ों एमएस / एमएस घटनाओं की अनुमति देताहै 9.
इस कार्य का मुख्य उद्देश्य गतिशीलता जाल में समानांतर संचय का उपयोग करके डीडीए के हाल के विकास को दिखाना था, जिसके बाद अनुक्रमिक विखंडन और टक्कर-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) था। हिस्टोन पीटीएम को आत्मविश्वास से उनके प्रतिधारण समय (आरटी), गतिशीलता और विखंडन पैटर्न के आधार पर सौंपा गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Animal Origin-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060710</td>
			<td>Finntip Flex 1000 &#956;L, nonsterile, nonfiltered, racked tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060100</td>
			<td>Finntip Flex, 10 &#956;L, nonsterile, non-filtered, racked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Dulbecco&#8217;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>(Mediatech)</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td>Falcon Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-138</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Gel-Loading Tips, 1&#8211;200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060310</td>
			<td>Finntip Flex 200&#956;L, nonsterile, nonfiltered, racked tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>Falcon Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate, V-Bottom 600 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-500-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998</td>
			<td>HPLC, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LS120</td>
			<td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>328110500</td>
			<td>AEBSF hydrochloride, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate, NH4HCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td>BioUltra, &#8805;99.5% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution, NH4OH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1303</td>
			<td>Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon (Ar)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AR HP 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH C18 HPLC column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td>XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 &#197;, 5 &#181;m, 4.6 mm X 250 mm, 1K&#8211;15K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic scoring wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass DataAnalysis 6.0</td>
			<td>Bruker Datonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass HyStar 6.2</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass IsotopePattern</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass timsControl 4.1</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89237526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Lifters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;08100240</td>
			<td>Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary 75 &#956;m ID x 363 &#956;m OD</td>
			<td>(Molex (Polymicro)</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BR747725-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatograph</td>
			<td>&#160;Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>ACS reagent, 37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb 30-40 &#956;m Carbon 150&#8211;300 &#197;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60106-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersep cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60109-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1969-85000</td>
			<td>TuningMix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Anhydrous, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, for HPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td>Optima for HPLC, Fisher Chemical&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Adapters</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>501021514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-200-8727</td>
			<td>Enzo Life Sciences&#160;Microcystin-LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm</td>
			<td>LEAP PAL Parts</td>
			<td>LAP.11190933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: ND3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (N2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI UHP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio X+</td>
			<td>Bioinformatic Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips, Instachek</td>
			<td>Micro Essential Lab</td>
			<td>JR-113</td>
			<td>Model: Hydrion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS reagent, 99.0%&#8211;100.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injection Cell</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>&#160;model: PC77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Anhydride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.00608</td>
			<td>For synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge (700&#8211;18,000 x g)</td>
			<td>NuAire, model: Nuwind</td>
			<td>NU-C200V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 &#956;m, 3 g</td>
			<td>ESI Source Solutions</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4569035</td>
			<td>Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm &#215; 6.7 cm (W &#215; L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11079.06</td>
			<td>98+%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE disk, C18</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76333-134</td>
			<td>Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor</td>
			<td>Savant</td>
			<td>model: SC210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.07651</td>
			<td>suitable for microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid, H2SO4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td>99.999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMS-ToF Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>model Tims tof ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid solution, TCA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td>6.1&#160;N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>Suitable for HPLC, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triversa Nanomate</td>
			<td>Advion</td>
			<td>model: TR263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypsinProtease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LS118</td>
			<td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histone modification screening using liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry

हिस्टोन प्रोटीन यूकेरियोट्स के बीच अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और संरक्षित होते हैं और पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के रूप में जानी जाने वाली संरचनाओं के परिणामस्वरूप जीन विनियमन में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं। बाहरी या आनुवंशिक कारकों के संदर्भ में प्रत्येक पीटीएम या पीटीएम के पैटर्न की स्थिति और प्रकृति की पहचान करने से यह जानकारी डीएनए प्रतिलेखन, प्रतिकृति या मरम्मत जैसे जैविक प्रतिक्रियाओं के साथ सांख्यिकीय रूप से सहसंबद्ध हो सकती है। वर्तमान कार्य में, जैविक नमूनों से हिस्टोन पीटीएम का पता लगाने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। पूरक तरल क्रोमैटोग्राफी, फंसे आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री, और टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-टीआईएमएस-टीओएफ एमएस / एमएस) का उपयोग एकल विश्लेषण में सबसे जैविक रूप से प्रासंगिक संशोधनों के पृथक्करण और पीटीएम असाइनमेंट को सक्षम बनाता है। वर्णित दृष्टिकोण गतिशीलता जाल में समानांतर संचय का उपयोग करके निर्भर डेटा अधिग्रहण (डीडीए) में हाल के विकास का लाभ उठाता है, इसके बाद अनुक्रमिक विखंडन और टक्कर-प्रेरित पृथक्करण होता है। हिस्टोन पीटीएम को आत्मविश्वास से उनके प्रतिधारण समय, गतिशीलता और विखंडन पैटर्न के आधार पर सौंपा गया है।

In eukaryotic cells, DNA is packaged as chromatin into functional units called nucleosomes. These units are composed of an octamer of four core histones (two each of H2A, H2B, H3, and H4)1,2,3,4. Histones are amongst the most abundant and highly conserved proteins in eukaryotes, which are largely responsible for gene regulation5. Histone posttranslational modifications (PTMs) play a large role in the regulation of chromatin dynamics and rigger various biological processes such as DNA transcription, replication, and repair6. PTMs occur primarily on the accessible surface of the N-terminal regions of histones that are in contact with DNA3,7. However, tail and core modifications influence chromatin structure, altering inter-nucleosome interactions and recruiting specific proteins3,8.
A current challenge during liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based proteomics is the potential co-elution of analytes of interest. In the case of data-dependent analyses (DDA), this translates into the potential loss of several precursor ions during the MS/MS acquisition process9. Time-of-flight (ToF) instruments acquire spectra at very high frequency9,10 (up to tens of kHz)11; this makes them capable of rapidly scanning the total precursor ions within a complex sample (MS1), thus promising optimal sensitivity and MS/MS sequencing rates (up to 100 Hz)9 and making them ideal for biological sample analysis10. Nevertheless, the sensitivity available at these high scan rates is limited by the MS/MS rate9. The addition of trapped ion mobility spectrometry (TIMS) in combination with an orthogonal quadrupole time-of-flight (qToF) mass spectrometer was used to mitigate these limitations. In TIMS, all precursor ions are accumulated in tandem and eluted as a function of their mobility, rather than selecting single precursor masses with a quadrupole9. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) allows for hundreds of MS/MS events per second without any loss of sensitivity9.
The principal aim of this work was to show the recent developments of DDA using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation (CID). Histone PTMs were confidently assigned based on their retention times (RTs), mobilities, and fragmentation patterns.

लेखक स्पॉटलाइट: LC-TIMS-ToF MS/MS और PASEF के माध्यम से बढ़ी हुई हिस्टोन PTM आइसोमर पहचान

तरल क्रोमैटोग्राफी, ट्रैप्ड आयन मोबिलिटी स्पेक्ट्रोमेट्री, और टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके हिस्टोन संशोधन स्क्रीनिंग

A method is proposed using histone extraction protocol with 95%efficiency. Together with LC-TIMS-ToF MS/MS, in a short time, it is possible to obtain a screening for those PTMs present in the histone. And above all, the possibility of separating isomers.The separation of isomeric peptides though possible using tandem mass spectrometry alone is often difficult. By incorporating TIMS, we introduce an extra dimension of separation, simplifying many positional isomer identifications. In addition, passive technology increases the sensitivity of these experiments, further improving our ability to analyze epigenetic variations.With the increased ability to identify PTM positions, there comes the ability to further determine the correlation between various environmental or biological factors, and their effects on the epigenome. Methods that improve and facilitate analysis of histones can be applied to several research areas, including medical and environmental chemistry. The dynamics of protein confirmation in native or damaged states will be established from the implementation of TIMS MS/MS with HDX.Through LC-TIMS-ToF MS/MS and Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, the differences in PTM existing in various biological sample will be charted.

एक नीचे-अप प्रोटिओमिक वर्कफ़्लो (चित्रा 7) में आम तौर पर निम्नलिखित शामिल होते हैं: एक कच्चे नमूने से लक्ष्य प्रोटीन (ओं) का निष्कर्षण, इसके बाद प्रोटीन (ओं) की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करन?...

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तरल क्रोमैटोग्राफी, फंसे आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री, और समय-की-उड़ान द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-टीआईएमएस-टीओएफ एमएस / एमएस) के आधार पर उच्च आत्मविश्वास और हिस्टोन संशोधनों और पहचान के अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य "नीचे-ऊपर" विश्लेषण के लिए प्रमुख मापदंडों (प्रतिधारण समय [आरटी], टक्कर क्रॉस सेक्शन [सीसीएस], और सटीक द्रव्यमान-से-चार्ज [एम/जेड] अनुपात) के आधार पर एक विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो।

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

95% दक्षता के साथ हिस्टोन निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक विधि प्रस्तावित है। LC-TIMS-ToF MS/MS के साथ, थोड़े समय में, हिस्टोन में मौजूद उन PTM के लिए स्क्रीनिंग प्राप्त करना संभव है। और सबसे बढ़कर, आइसोमर्स को अलग करने की संभावना।आइसोमेरिक पेप्टाइड्स का पृथक्करण, हालांकि संभव है, अकेले अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करना अक्सर मुश्किल होता है। TIMS को शामिल करके, हम जुदाई का एक अतिरिक्त आयाम पेश करते हैं, कई स्थितीय आइसोमर पहचानों को सरल बनाते हैं। इसके अलावा, निष्क्रिय तकनीक इन प्रयोगों की संवेदनशीलता को बढ़ाती है, जिससे एपिजेनेटिक विविधताओं का विश्लेषण करने की हमारी क्षमता में और सुधार होता है।पीटीएम पदों की पहचान करने की बढ़ी हुई क्षमता के साथ, विभिन्न पर्यावरणीय या जैविक कारकों और एपिजेनोम पर उनके प्रभावों के बीच संबंध को और निर्धारित करने की क्षमता आती है। हिस्टोन के विश्लेषण में सुधार और सुविधा प्रदान करने वाले तरीकों को चिकित्सा और पर्यावरण रसायन विज्ञान सहित कई अनुसंधान क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है। देशी या क्षतिग्रस्त राज्यों में प्रोटीन की पुष्टि की गतिशीलता एचडीएक्स के साथ टीआईएमएस एमएस / एमएस के कार्यान्वयन से स्थापित की जाएगी।LC-TIMS-ToF MS/MS और Nano LC-TIMS-ToF MS/MS के माध्यम से, विभिन्न जैविक नमूने में मौजूद PTM में अंतर को चार्ट किया जाएगा।

histone-modification-screening-using-liquid-chromatography-trapped

Research

JoVE Journal

Chemistry

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [m/z] ratio).