Name: Advancing Optogenetics Research Using Lustro (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-08-04T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Optogenetics Research Using Lustro at JoVE.com

この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R35GM128873と米国国立科学財団の助成金2045493(M.N.M.に授与)の支援を受けました。Megan Nicole McClean博士は、バロウズ・ウェルカム基金のサイエンティフィック・インターフェースでキャリア賞を受賞しています。Z.P.H.は、ゲノム科学トレーニングプログラム5T32HG002760へのNHGRIトレーニング助成金の支援を受けました。McClean研究室のメンバーとの実りある議論を認めており、特に、原稿にコメントを寄せてくださったKieran Sweeney氏に感謝します。

この研究で利用した酵母菌株は、 材料表に記載されています。これらの菌株は、22°C〜30°Cの温度範囲で強力な増殖を示し、さまざまな標準酵母培地で培養できます。
1. 自動化ワークステーションのセットアップ
<ol><li>マイクロウェルプレートを移動できるロボットグリッパーアーム(RGA、 材料表を参照)を自動ワークステーション?...

Yeast Optogenetic Response Analysis Using the Lustro Automation Technique

<ol>
	<li>P&#233;rez, A. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+strategies+for+the+control+of+gene+expression+in+yeasts.">Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts.</a> Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).</li><li>Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+for+transcriptional+programming+and+genetic+engineering.">Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering.</a> Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).</li><li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology.">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).</li><li>Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+in+vitro+and+in+vivo+Activities+of+Light+Inducible+Dimers:+a+Cellular+Optogenetics+Guide.">Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).</li><li>Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+signal+generators:+integrating+synthetic+biology+tools+and+in+silico+control.">Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control.</a> Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).</li><li>Harmer, Z. P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lustro:+High-throughput+optogenetic+experiments+enabled+by+automation+and+a+yeast+optogenetic+toolkit.">Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit.</a> ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>H&#246;hener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITOS:+a+versatile+LED+illumination+tool+for+optogenetic+stimulation.">LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation.</a> Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).</li><li>Gr&#248;dem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments.">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li><li>Dunlop, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).</li><li>Thomas, O. S., H&#246;rner, M., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graphical+user+interface+to+design+high-throughput+optogenetic+experiments+with+the+optoPlate-96.">A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96.</a> Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).</li><li>Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light+alters+yeast+metabolic+rhythms+by+inhibiting+respiration.">Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Complete+(SC)+Medium.">Synthetic Complete (SC) Medium.</a> 2016 (11), (2016).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li><li>Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+wavelengths+collide:+bias+in+cell+abundance+measurements+due+to+expressed+fluorescent+proteins.">When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YPD+media.">YPD media.</a> 2010 (9), (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).</li><li>Csibra, E., Stan, G. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parsley:+a+web+app+for+parsing+data+from+plate+readers.">Parsley: a web app for parsing data from plate readers.</a> Zenodo. , (2023).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).</li><li>Guti&#233;rrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cybergenetic+control+of+bacterial+co-culture+composition+via+optogenetic+feedback.">Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback.</a> Nature Communications. 13, 4808 (2022).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7, 12546 (2016).</li><li>Bertaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+bioreactor+arrays+for+automated+measurements+and+reactive+control+with+ReacSight.">Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight.</a> Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).</li><li>Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+closed-loop+feedback+control+of+the+unfolded+protein+response+optimizes+protein+production.">Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production.</a> Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).</li><li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures.">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feedback-enabled+optogenetic+stimulation+and+spectroscopy+in+microwell+plates.">High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+beta-carotene+bioproduction+in+yeast+across+multiple+lab-scales.">Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).</li><li>Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction:+dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments.">The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).</li></ol>

ここで紹介するLustroプロトコルは、培養、照明、測定プロセスを自動化し、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にします6。これは、照明装置、マイクロプレートリーダー、振とう装置をオートメーションワークステーションに統合することで実現されます。このプロトコルは、酵母 S.cerevisiae に統合されたさまざまな光遺伝学的?...

オプトジェネティクスは、光感受性タンパク質を利用して細胞の挙動を高精度に制御する強力な技術です1,2,3。しかし、オプトジェネティックコンストラクトのプロトタイピングと最適な照明条件の特定には時間がかかる場合があり、オプトジェネティックシステムの最適化は困難です4,5。オプトジェネティックシステムの活性を迅速にスクリーニングし、特性評価するハイスループットメソッドは、コンストラクトのプロトタイピングとその機能の調査のための設計、構築、テストのサイクルを加速させることができます。
Lustro プラットフォームは、光遺伝学的システムのハイスループットスクリーニングと特性評価のために設計されたラボラトリーオートメーション技術として開発されました。マイクロプレートリーダー、照明装置、振とう装置をオートメーションワークステーション6と統合しています。Lustro は、マイクロウェルプレート(図1および補足図1)で細胞の自動培養と光刺激を組み合わせており、さまざまなオプトジェネティックシステムの迅速なスクリーニングと比較を可能にします。Lustroプラットフォームは適応性が高く、他のラボラトリーオートメーションロボット、照明装置、プレートリーダー、細胞タイプ、およびさまざまな波長の光に応答するものを含む光遺伝学的システムで動作するように一般化できます。
このプロトコルは、光遺伝学的システムの特性評価のためのLustrroのセットアップと使用を示しています。酵母における分裂転写因子の光遺伝学的制御は、光入力と蛍光レポーター遺伝子mScarlet-I7の発現との関係を調べることにより、プラットフォームの機能と有用性を説明するための例として使用されています。このプロトコルに従うことで、研究者は光遺伝学的システムの最適化を合理化し、生物学的システムの動的制御のための新しい戦略の発見を加速することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plate with&#160; #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P96-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioShake 3000-T elm (heater shaker)</td>
			<td>QINSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluent Automation Workstation</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LITOS (alternative illumination device)</td>
			<td>Hohener, et al. Scientific Reports. 2022</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optoPlate-96 (illumination device)</td>
			<td>Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic Gripper Arm</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers &#8211; eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark (plate reader)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete media</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>Y1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Connect (user alert app)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1734 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1763 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1765 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optogenetics experiments in yeast using the automated platform lustro

オプトジェネティクスは、遺伝的にコードされた光感受性タンパク質を利用することで、細胞の挙動を正確に制御します。しかし、これらのシステムを最適化して目的の機能を実現するには、多くの場合、設計、構築、テストのサイクルを複数回必要とし、時間と労力がかかります。この課題に対処するために、光刺激とラボラトリーオートメーションを組み合わせたプラットフォームであるLustroを開発し、オプトジェネティックシステムの効率的なハイスループットスクリーニングと特性評価を可能にしました。
Lustro は、照明装置、振とう装置、プレートリーダーを備えた自動化ワークステーションを利用しています。Lustroは、ロボットアームを採用することで、これらのデバイス間のマイクロウェルプレートの移動を自動化し、光遺伝学的株の刺激とその応答の測定を可能にします。このプロトコルは出芽のイースト Saccharomycesのcerevisiaeの遺伝子発現制御のための光遺伝学システムを特徴付けるのにLustroの使用のステップバイステップガイドを提供する。このプロトコルは、照明装置とオートメーションワークステーションの統合など、Lustroのコンポーネントのセットアップをカバーしています。また、照明装置、プレートリーダー、ロボットのプログラミングに関する詳細な指示も提供し、実験プロセス全体を通してスムーズな操作とデータ取得を保証します。

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

図4A は、光誘導性スプリット転写因子によって制御される蛍光レポーターを発現するオプトジェネティック株の経時的な蛍光値を示しています。実験で使用されたさまざまな光条件は、光が点灯している時間の割合を表すデューティサイクルの変動によって反映されます。全体的な蛍光レベルは、光刺激のデューティサイクルに比例することが観察されます。 <strong clas...

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Advancing Optogenetics Research Using Lustro (Video) | JoVE

このプロトコルでは、自動化されたプラットフォーム Lustro を利用して、酵母の光遺伝学的システムのハイスループット特性評価を実行する手順を概説します。

自動化プラットフォームLustroを用いた酵母のハイスループット光遺伝学実験

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...

現在、バイオリアクターやマイクロウェルプレートイルミネーターなど、さまざまなデバイスが利用可能です。バイオリアクターは、優れた時間分解能を提供しますが、スループットには限界があります。マイクロウェルプレートデバイスは、より高いスループットを提供しますが、時間の経過とともに出力を確実に記録するための自動化が不足しています。Lustro は、光遺伝学的システムの信頼性の高いハイスループット特性評価をリアルタイムで提供します。また、液質処理ロボットで実行できるアッセイとのインターフェースも可能です。光遺伝学システムは、細胞の挙動を空間的および時間的に細かく制御できるため、魅力的なツールです。光遺伝学的システムをより迅速に設計、構築、テストする能力は、生物学的行動のより良い理解と制御への道を開くでしょう。