Name: isolation, culture, and characterization of dental pulp stem cells from human deciduous and permanent teeth
Uploaded: 2024-05-17T13:10:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Mathew Mazhavancheril, Direktor und Leiter des Pushpagiri-Forschungszentrums in Thiruvalla, für seine Unterstützung bei der Dokumentation der Abläufe im Forschungszentrum.

Das hier beschriebene Protokoll entspricht den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Die Verwendung der extrahierten Zähne erfolgte nach ethischen Standards, um die Integrität, Würde und Rechte der Teilnehmer zu gewährleisten. Bei den für diese Studie ausgewählten Teilnehmern handelte es sich um gesunde Personen unter 30 Jahren, die für eine kieferorthopädische Behandlung eine Zahnextraktion benötigten. Personen mit ausgedehnter Zahnka...

Das Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen. Es enthält eine Beschreibung der Lagerung und Proliferation dieser Zellen sowie die Bewertung ihres in vitro Differenzierungspotenzials in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten35.
Chen et al.36 zeigten, dass Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus versch...

Die Stammzellforschung hat in der biomedizinischen Wissenschaft aufgrund ihrer vielversprechenden Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering floriert. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die aus dem Pulpagewebe sowohl menschlicher Milchzähne als auch bleibender Zähne gewonnen werden, haben aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und multipotenten Kapazität als Quelle für Stammzellen großes Interesse geweckt 1,2. Diese Zellen haben das Potenzial, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, darunter Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten, wie zahlreiche Studien bestätigen3.
In den letzten Jahrzehnten haben die Forschung und die therapeutischen Anwendungen von Stammzellen stark zugenommen. Das expansive Potenzial von Stammzellen erfordert eine Diversifizierung der Quellen, aus denen sie gewonnen werden. Mehrere Faktoren beeinflussen die Effizienz, Lebensfähigkeit und Stammheit ausgewählter Zellen. Trotz der Existenz verschiedener bekannter Stammzellreservoire wie Knochenmark und Fettgewebe schränken die invasiven Verfahren, die Morbidität an der Stelle und ethische Bedenken, die mit diesen Quellen verbunden sind, ihre Erforschung oft ein 4,5. Unter den verschiedenen Stammzellquellen haben dentale Stammzellen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit, hohen Plastizität und vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere humane Stammzellen der Zahnpulpa sind hinsichtlich ihrer therapeutischen Aussichten umfassend erforschtworden 6. Zähne, die häufig als medizinischer Abfall entsorgt werden, enthalten eine Fülle von mesenchymalen Stammzellen7. Der Schutz dieses wertvollen Stammzellpools erfordert gemeinsame Anstrengungen von Patienten, Zahnärzten und Ärzten, um sicherzustellen, dass diese Ressourcen nicht verschwendet werden und jede Zahnpulpa-Stammzelle für zukünftige regenerative Anforderungen verfügbar ist.
Aus der Zahnpulpa gewonnene Stammzellen, wie z. B. humane adulte Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) und Stammzellen aus exfolierten menschlichen Milchzähnen (SHED), befinden sich in der perivaskulären Nische der Zahnpulpa. Es wird angenommen, dass diese Zellen aus kranialen Neuralleistenzellen stammen und frühe Marker sowohl für mesenchymale Stammzellen (MSCs) als auch für neuroektodermale Stammzellen aufweisen. DPSCs und SHEDs haben Multipotenz und die Fähigkeit zur Regeneration verschiedener Gewebetypen bewiesen8.
Mögliche Quellen für dentale Stammzellen sind gesunde Milch- und bleibende Zähne. Stammzellen machen nur etwa 1 % der gesamten Zellpopulation in der Pulpa aus, was die Bedeutung wirksamer Isolierungs- und Expansionstechniken unterstreicht9. Folglich sind die Extraktion und Vermehrung dieser Stammzellen entscheidende Schritte bei der DPSC-Isolierung10. Extrahierte oder exfolierte Zähne müssen in einem nährstoffreichen Transportmedium wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks-gepufferter Kochsalzlösung (HBSS) gelagert werden.
Die Gewinnung von Zahnpulpa kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, abhängig vom Zahntyp 7,11. Bei Milchzähnen mit resorbierten Wurzeln kann die Extraktion über die Wurzelspitze erfolgen. In ähnlicher Weise können sterile Stachelräumnadeln verwendet werden, um Pulpa aus bleibenden Zähnen mit einer unreifen offenen Spitze zu gewinnen. Bei bleibenden Zähnen mit voll entwickelten Wurzeln wird für den Zugang zur Pulpakammer die Zahnkrone von der Wurzel getrennt. Dies wird erreicht, indem der Zahn mit einer Diamantscheibe an der Zementschmelzverbindung geschnitten wird. Dieser Schnitt legt die Pulpakammer frei, wodurch das Pulpagewebe entnommen werdenkann 12,13,14.
Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) können durch enzymatischen Verdau (ED) oder Auswuchs aus Gewebeexplantaten (OG) isoliert werden, was auch als spontanes Wachstum bezeichnet wird. Bei der ED-Methode werden Enzyme, hauptsächlich Kollagenase I und Dispase, verwendet, um das Gewebe in einzellige Suspensionen zu zerlegen15,16. Die OG-Methode, die einfacher und schneller ist, besteht darin, die Pulpafragmente zu zerkleinern und direkt in eine Kulturplatte zu legen, so dass die Zellen aus den Gewebeexplantaten wachsen können17. Forscher haben beide Techniken verwendet und verglichen, um die Zellproliferationsraten, die Erhaltung der Eigenschaften isolierter Stammzellen, die Differenzierung und die Expression von Oberflächenmarkern zu bewerten18. Die Etablierung und Standardisierung von Protokollen für den Erwerb von DPSCs mit hoher Effizienz und Stammheit kann den Weg für wirksame und sichere Therapien ebnen19. Dieses Protokoll umfasst die Extraktion von DPSCs durch enzymatischen Verdau, Laborverarbeitung, Konservierung und Zelldifferenzierung mit kolorimetrischer Färbung für Adipogenese, Osteogenese und Chondrogenese.
Das in diesem Artikel skizzierte Protokoll stellt ein schrittweises Verfahren dar, das mit der anfänglichen Isolierung der Zahnpulpa vom Zahn beginnt, gefolgt von der Kultur und Aufrechterhaltung der DPSCs im Labor und schließlich mit ihrer Charakterisierung unter Verwendung spezifischer Stammzellmarker (Abbildung 1). Die Techniken zur Induktion dieser Stammzellen in verschiedene Zelllinien, die ihre Multipotenz hervorheben, werden ebenfalls beschrieben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobuty-l-methyl-xanthine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>AS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>RM471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S staining solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>GRM894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase -Staining kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium (&#945;-MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium (&#945;-MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>012-04802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet-Laminar flow hood</td>
			<td>Labconco Corporation,MO 64132-2696,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DR</td>
			<td>BioLegend, Inc.CA 92121,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m )</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCP025</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI Elektrotechnik Limited (REMI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>1101 | 1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Growth Medium</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>AT006</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 or 50 )</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td>546021P/546041P</td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>15-350-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolabels</td>
			<td>Label India:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial storage boxes&#160;</td>
			<td>Cryostore Storage Boxes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (1.8 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>PW1282</td>
			<td>Self standing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask (25 cm&#178;)</td>
			<td>Corning Inc.NY 14831,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCG4/TCG6</td>
			<td>T25/T75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plates</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCP129/TCP008</td>
			<td>60 mm/100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Diamond Discs</td>
			<td>Komet SC 29730, USA</td>
			<td></td>
			<td>Komet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Spoon Excavator</td>
			<td>Brasseler,GA 31419,USA</td>
			<td>5023591U0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethosone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethosone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TC185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Roche Diagnostics,Mannheim,Germany.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>MB106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol -70%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction forceps&#160;</td>
			<td>Dentsply Sirona, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>RM9954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-coated tissue culture plate</td>
			<td>Corning Inc.Corning, NY 14831,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry buffer</td>
			<td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip 22 x 22 mm</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCP017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed dental handpiece&#160;</td>
			<td>NSK Ltd,Tokyo 8216, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Ti-Max Z series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Pfizer Inc. NY 10017,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>I5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>I5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premix</td>
			<td>Corning Incorporated,MA 01876,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (60% )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>MB063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine mixed with epinephrine</td>
			<td>DENTSPLY,NC 28277,USA</td>
			<td></td>
			<td>Citanest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air Liquide,75007 Paris,France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage tank</td>
			<td>Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany</td>
			<td>30020</td>
			<td>Accupipet-2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini tissue grinder</td>
			<td>Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USA</td>
			<td></td>
			<td>ReadyPrep mini grinders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 freezer</td>
			<td>Blue Star Limited</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>1024190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic Differentiation Medium (ODM)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TCL119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TS1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td>P3813-1PAK</td>
			<td>1x PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Size 15&#160;</td>
			<td>Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UK</td>
			<td>BDF-6955C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>AS102</td>
			<td>4% w/v solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Tarsons Products Pvt. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile container -20 mL</td>
			<td>3M Center, MN 55144-1000,USA</td>
			<td></td>
			<td>3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>P3813-1PAK</td>
			<td>1x PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )</td>
			<td>Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes and tips</td>
			<td>Eppendorf India Limited</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade Handle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.,NJ,USA</td>
			<td>371030</td>
			<td>BP Handle 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-&#946;3)</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.MN 55413,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-&#946;3)</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.MN 55413,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TCL046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TCL046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>BSW-01D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of dental pulp stem cells from human deciduous and permanent teeth

Im Bereich der regenerativen Medizin und therapeutischer Anwendungen gewinnt die Stammzellforschung rasant an Bedeutung. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die sowohl in Milchzähnen als auch in bleibenden Zähnen vorkommen, haben sich aufgrund ihrer Zugänglichkeit, Anpassungsfähigkeit und angeborenen Differenzierungsfähigkeit zu einer wichtigen Stammzellquelle entwickelt. DPSCs bieten ein leicht verfügbares und reichlich vorhandenes Reservoir an mesenchymalen Stammzellen und zeigen eine beeindruckende Vielseitigkeit und ein beeindruckendes Potenzial, insbesondere für regenerative Zwecke. Trotz ihres Versprechens liegt die größte Hürde in der effektiven Isolierung und Charakterisierung von DPSCs, da sie nur als winzige Fraktion in Zahnpulpazellen dargestellt werden. Ebenso wichtig ist die richtige Konservierung dieser unschätzbaren zellulären Ressource. Die beiden vorherrschenden Methoden für die DPSC-Isolierung sind die enzymatische Verdauung (ED) und das Auswachsen aus Gewebeexplantaten (OG), die oft als Spontanwachstum bezeichnet werden. Dieses Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf den enzymatischen Verdauansatz für die DPSC-Isolierung und beschreibt detailliert die Schritte, die die Extraktion, die Verarbeitung im Labor und die Zellkonservierung umfassen. Über die Extraktion und Konservierung hinaus befasst sich das Protokoll mit der Differenzierungsfähigkeit von DPSCs und beschreibt insbesondere die Verfahren, die angewendet werden, um diese Stammzellen zur Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten zu veranlassen, wobei ihre multipotenten Eigenschaften zur Geltung kommen. Die anschließende Anwendung kolorimetrischer Färbetechniken ermöglicht eine genaue Visualisierung und Bestätigung der erfolgreichen Differenzierung, wodurch das Kaliber und die Funktionalität der isolierten DPSCs validiert werden. Dieses umfassende Protokoll fungiert als Blaupause, die das gesamte Spektrum der Extraktion, Kultivierung, Konservierung und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen umfasst. Es unterstreicht das beträchtliche Potenzial von DPSCs, treibt die Erforschung von Stammzellen voran und verspricht zukünftige regenerative und therapeutische Durchbrüche.

Die erfolgreiche Durchführung des skizzierten Protokolls führte zu Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die in der Lage sind, mehrere Linien zu differenzieren, was ihre Multipotenz demonstriert.
Viabilitäts-Assays Die Viabilität der DPSCs wurde unter Verwendung eines Trypanblau-Ausschlussassays zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet. Die Ergebnisse zeigen eine konstant hohe Lebensfähigkeit (mehr als 95%) über den gesamten Kulturzeitraum, was die Robustheit unseres Isolations...

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Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen der Zahnpulpa aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen

In the realm of regenerative medicine and therapeutic applications, stem cell research is rapidly gaining traction. Dental pulp stem cells (DPSCs), which ...

Beginnen Sie damit, den extrahierten menschlichen Zahn mit einer Zahnzange zu befestigen. Schneiden Sie dann den Zahn mit einer Diamantscheibe, die mit einem zahnärztlichen Handstück und einem Wasserkühlmittel verbunden ist. Entfernen Sie mit einem Dentalbagger das Pulpagewebe vom Zahn.Verwenden Sie anschließend eine sterile chirurgische Klinge, um das Pulpagewebe vorsichtig in kleine Fragmente zu zerkleinern. Geben Sie diese Fragmente dann in eine Mini-Tissue-Mühle mit PBS, um eine homogene Mischung zu bilden. Übertragen Sie die zerkleinerten Gewebefragmente in ein 15-Milliliter-Röhrchen und verdauen Sie sie mit einer Mischung aus Kollagenase Typ eins und Dispase.Inkubieren Sie das Gewebe in der Enzymmischung bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Nach der Inkubation neutralisieren Sie die Enzyme. Anschließend wird das verdaute Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und fünf Minuten lang bei 300 g bei Raumtemperatur geschleudert.Entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in frischem DMEM, ergänzt mit 10 bis 20 % FBS. Für die Zellkultur wird die Zellsuspension vorsichtig in einen 25 Quadratzentimeter großen Kulturkolben überführt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.Nach zwei bis drei Tagen wird das Medium mit einer sterilen serologischen Pipette vorsichtig abgesaugt und durch ein frisches Medium ersetzt. Schalten Sie als Nächstes für die Charakterisierung von DPSCs das Durchflusszytometer ein und bestätigen Sie die mesenchymale Stammzellnatur der isolierten Zellen. Die erfolgreiche Differenzierung von DPSCs in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten bestätigt die multipotente Natur von DPSCs.Die Verdopplungszeit der DPSCs stimmte mit der für mesenchymale Stammzellen berichteten Zeit überein, was auf eine gesunde und proliferative Zellpopulation hindeutet. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die Mehrheit der DPSCs positiv auf CD-90, CD-73 und CD-105 war, was ihre Identität als mesenchymale Stammzellen bestätigt. Darüber hinaus waren weniger als 2 % der Zellen positiv für CD-34, CD-45 und HLADR, was das Fehlen einer signifikanten hämatopoetischen oder endothelialen Zellkontamination bestätigt.

isolation-culture-characterization-dental-pulp-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity

Gravity is one of the key determinants of human cell function, proliferation, cytoskeletal architecture and orientation. Rotary bioreactor systems (RCCSs) mimic the loss of gravity as it occurs in space and instead provide a microgravity environment through continuous rotation of cultured cells or tissues. These RCCSs ensure an un-interrupted supply of nutrients, growth and transcription factors, and oxygen, and address some of the shortcomings of gravitational forces in motionless 2D (two dimensional) cell or organ culture dishes. In the present study we have used RCCSs to co-culture cervical loop cells and dental pulp cells to become ameloblasts, to characterize periodontal progenitor/scaffold interactions, and to determine the effect of inflammation on lung alveoli. The RCCS environments facilitated growth of ameloblast-like cells, promoted periodontal progenitor proliferation in response to scaffold coatings, and allowed for an assessment of the effects of inflammatory changes on cultured lung alveoli. This manuscript summarizes the environmental conditions, materials, and steps along the way and highlights critical aspects and experimental details. In conclusion, RCCSs are innovative tools to master the culture and 3D (three dimensional) growth of cells in vitro and to allow for the study of cellular systems or interactions not amenable to classic 2D culture environments.

This protocol presents a method for the culture and 3D growth of ameloblast-like cells in microgravity to maintain their elongated and polarized shape as well as enamel-specific protein expression. Culture conditions for the culture of periodontal engineering constructs and lung organs in microgravity are also described.

Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

Gravity is one of the key determinants of human cell function, proliferation, cytoskeletal architecture and orientation. Rotary bioreactor systems (RCCSs) ...