Name: تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف ديناميكيات الهيكل الخلوي للكشف عن مضادات حيوية جديدة من خلال المقايسات المبتكرة القائمة على الخلايا
Uploaded: 2024-04-26T14:35:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Unveil Novel Antibiotics Through Innovative Cell-Based Assays at JoVE.com

تعترف SMP و SR و AKS بالزمالات التي تلقتها من المعهد الوطني لتعليم العلوم والبحوث ، قسم الطاقة الذرية. يقر قطاع الأبحاث بدعم التمويل الداخلي من وزارة الطاقة الذرية ، ويتم دعم هذا العمل من خلال منحة بحثية إلى RS (BT / PR42977 / MED/29/1603/2022) من قسم التكنولوجيا الحيوية (DBT). كما يعترف المؤلفون ب V Badireenath Konkimalla لتعليقاته واقتراحاته ومناقشاته طوال فترة تطوير البروتوكول.

1. التعبير عن بروتينات الهيكل الخلوي البكتيرية الموسومة ب GFP في S. pombe
ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 1 للحصول على معلومات حول جميع البلازميدات والسلالات المستخدمة هنا. يرجى الاطلاع على الجدول 2 للاطلاع على جميع التراكيب الإعلامية.
<ol><li>إجراء...

تحديد الأدوية التي تؤثر على بلمرة البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية

<ol>
	<li>Antimicrobial Resistance Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+in+2019:+a+systematic+analysis.">Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis.</a> Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).</li><li>Haselbeck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+essential+gene+identification+as+a+platform+for+novel+anti-infective+drug+discovery.">Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery.</a> Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+small+molecule+that+inhibits+cell+division+by+blocking+FtsZ,+a+novel+therapeutic+target+of+antibiotics.">Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).</li><li>Sanchez, S., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).</li><li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prokaryotic+cytoskeleton:+a+putative+target+for+inhibitors+and+antibiotics.">The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).</li><li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+bacterial+Z-ring.">Targeting the bacterial Z-ring.</a> Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).</li><li>Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+as+an+antibacterial+target:+status+and+guidelines+for+progressing+this+avenue.">FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue.</a> ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).</li><li>Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RND-type+efflux+pumps+confers+the+FtsZ-directed+prodrug+TXY436+with+activity+against+Gram-negative+bacteria.">Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria.</a> Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).</li><li>Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bacterial+cell+division:+A+binding+site-centered+approach+to+the+most+promising+inhibitors+of+the+essential+protein+FtsZ.">Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ.</a> Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).</li><li>Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistance+efflux+pumps+-+not+just+for+resistance.">Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance.</a> Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).</li><li>K&#228;ufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+correctly+excises+a+mammalian+RNA+transcript+intervening+sequence.">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence.</a> Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).</li><li>Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe:+A+unicellular+micromammal+model+organism.">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism.</a> Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).</li><li>Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+targeting+of+Bacillus+subtilis+cell+division+protein+DivIVA+to+division+sites+in+Escherichia+coli+and+fission+yeast.">Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast.</a> EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).</li><li>Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filament+formation+of+the+Escherichia+coli+actin-related+protein,+MreB,+in+fission+yeast.">Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast.</a> Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).</li><li>Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+cytoplasmic+rings+in+fission+yeast.">The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast.</a> Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).</li><li>TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+functions+of+chloroplast+FtsZ1+and+FtsZ2+in+Z-ring+structure+and+remodeling.">Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling.</a> J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).</li><li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+of+salt+bridge-mediated+resistance+to+FtsZ+inhibitor+PC190723+revealed+by+a+cell-based+screen.">A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen.</a> Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).</li><li>Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TATA+box+mutations+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+nmt1+promoter+affect+transcription+efficiency+but+not+the+transcription+start+point+or+thiamine+repressibility.">TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility.</a> Gene. 123 (1), 131-136 (1993).</li><li>Moreno, M. B., Dur&#225;n, A., Carlos Ribas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+multifunctional+thiamine-repressible+expression+vectors+for+fission+yeast.">A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast.</a> Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caring+for+Escherichia+coli.">Caring for Escherichia coli.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+DNA.">Isolation and quantification of DNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li><li>B&#228;hler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filament+organization+of+the+bacterial+actin+MreB+is+dependent+on+the+nucleotide+state.">Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state.</a> J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+for+enumeration+of+cell+colony+forming+units.">Machine learning for enumeration of cell colony forming units.</a> Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).</li><li>Moen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+for+cellular+image+analysis.">Deep learning for cellular image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+cytoskeletal+organizations+by+microscopic+image+analysis.">Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis.</a> Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).</li><li>Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACTIN+DEPOLYMERIZING+FACTOR4+regulates+actin+dynamics+during+innate+immune+signaling+in+Arabidopsis.">ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Butler, M. S., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+in+the+clinical+pipeline+in+October+2019.">Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019.</a> J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).</li><li>Andreu, J. M., Huecas, S., Ara&#250;jo-Baz&#225;n, L., V&#225;zquez-Villa, H., Mart&#237;n-Fontecha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+antibacterial+inhibitors+targeting+cell+division+protein+ftsz+at+its+nucleotide+and+allosteric+binding+sites.">The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites.</a> Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).</li><li>Vje&#353;tica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+stable+integration+vectors+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+bacterial+actin+homologs.">The structure and function of bacterial actin homologs.</a> Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+yeast+for+young+geneticists:+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system.">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li><li>Aoi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+first+and+the+second+meiotic+divisions+using+a+marker-less+drug-hypersensitive+fission+yeast.">Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast.</a> Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+sensitivity+of+HIV-1+protease+inhibitors+by+restriction+of+cellular+efflux+system+in+a+fission+yeast+model.">Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model.</a> Pathogens. 11 (7), 804 (2022).</li></ol>

تشكل مقاومة مضادات الميكروبات تهديدا صحيا عالميا خطيرا، وهناك حاجة ملحة إلى مضادات حيوية جديدة ذات أهداف جديدة. برز الهيكل الخلوي البكتيري كهدف جذاب لتطوير مضادات حيوية جديدة ، مع مثبطات جزيئية صغيرة لبروتين انقسام الخلايا FtsZ ، مثل TXA709 ، بالفعل في المرحلة الأولى من التجارب السريرية<sup class...

خلقت المقاومة الواسعة النطاق لجميع المضادات الحيوية المستخدمة حاليا لمكافحة الالتهابات البكتيرية ضرورة فورية لفئات جديدة من المضادات الحيوية. أشار تقرير صدر عام 2019 إلى أن العدوى المقاومة للمضادات الحيوية أدت إلى فقدان 1.27 مليون شخص ، مما ساهم في حصيلة إجمالية بلغت 4.95 مليون حالة وفاة عند النظر في مضاعفات العدوى البكتيرية المقاومة1. في حين أن الترسانة الحالية من المضادات الحيوية لا تزال فعالة في الممارسة السريرية ، إلا أنها تستهدف في الغالب طيفا ضيقا من العمليات الخلوية ، مع التركيز بشكل أساسي على جدار الخلية والحمض النووي وتخليق البروتين. على مدى نصف القرن الماضي ، تم استغلال أقل من 30 بروتينا تجاريا كأهداف لتطوير مضادات جديدة للبكتيريا 2,3. هذا النطاق المحدود من الأهداف القابلة للتطبيق يخلق قيودا كبيرة على اكتشاف مضادات حيوية جديدة أو مشتقاتها لمكافحة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. وبالتالي ، للتغلب على مشكلة مقاومة المضادات الحيوية الناشئة ، هناك حاجة لتطوير مضادات حيوية جديدة ذات أهداف وآليات عمل جديدة.
يجب أن يكون الهدف المضاد للبكتيريا بشكل مثالي مكونا أساسيا لنمو الخلايا البكتيرية ، وأن يتم حفظه في جميع أنحاء الأنواع المتنوعة من الناحية التطورية ، وأن يظهر أقل تماثل حقيقي النواة ، وأن يكون في متناول المضادات الحيوية4. منذ اكتشاف البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية المشاركة في انقسام الخلايا والحفاظ على شكل الخلية ، ظهرت كنقطة محورية واعدة لتطوير المركبات المضادة للبكتيريا5. هذه البروتينات ضرورية لحيوية البكتيريا وتلعب دورا محوريا في الحفاظ على شكل الخلية (MreB ، CreS) ، والانقسام (FtsZ ، FtsA) ، وفصل الحمض النووي (ParM ، TubZ ، PhuZ ، AlfA) ، على غرار الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. والجدير بالذكر أن FtsZ يظهر مستوى عاليا بشكل ملحوظ من الحفظ عبر مجموعة واسعة من الكائنات بدائية النواة ، بينما يوجد MreB في جميع البكتيريا على شكل قضيب تقريبا. هذا التوزيع الواسع والأهمية في صلاحية الخلية يجعل هذه البروتينات هدفا رائعا في أبحاث المضادات الحيوية5،6،7.
من الأهمية بمكان اعتماد نهج متعدد الجوانب يجمع بين الملاحظات في الجسم الحي والتفاعلات في المختبر والتجارب الأنزيمية للتحقق بدقة من صحة بروتينات الهيكل الخلوي البكتيري كهدف أساسي لمثبط محتمل7. الإجراءات الشاقة أو الآثار المترتبة على التكلفة الكبيرة تثقل كاهل العديد من المقايسات المتاحة لهذا الغرض. هذه عقبات ملحوظة أمام استخدامها على نطاق واسع في فحص مركبات الرصاص التي يمكن أن تؤثر على الهيكل الخلوي البكتيري. من بين هذه ، يبرز الفحص المجهري كطريقة فعالة وسريعة بشكل استثنائي لتقييم فعالية المركبات من خلال الفحص المباشر للتغيرات في مورفولوجيا الخلية. ومع ذلك ، فإن الارتباط غير المتجانس للبروتين المستهدف مع مجمعات الهيكل الخلوي الأخرى ، والآثار غير المباشرة بسبب الارتباط خارج الهدف والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وصعوبة اختراق الخلية بكفاءة ، ووجود مضخات التدفق ، خاصة في البكتيريا سالبة الجرام ، تجعل الأمر معقدا بشكل جماعي لتحديد السبب الدقيق لتشوه الخلايا البكتيرية8،9،10.
فطرية الفصام بومب، أو خميرة الانشطار كما هو معروف، كائن حقيقي النواة وحيد الخلية على شكل قضيب. تستخدم خميرة الانشطار على نطاق واسع ككائن نموذجي في البيولوجيا الخلوية والجزيئية بسبب الحفظ الاستثنائي في العمليات الخلوية مثل دورة الخلية والانقسام ، والتنظيم الخلوي ، وتكرار الكروموسوم مع حقيقيات النوى الأعلى ، بما في ذلك البشر11,12. علاوة على ذلك ، أعرب Errington وزملاؤه عن بروتين هيكلي خلوي بكتيري موضعي في القطب DivIVA في خميرة الانشطار لإثبات أن DivIVA تراكمت على الأسطح المنحنية سلبا13. مرة أخرى ، أنشأ Balasubramanian والمجموعة لأول مرة خميرة الانشطار كنظام نموذج خلوي لجلب رؤى جديدة حول آلية وتجميع وديناميكية بروتين الهيكل الخلوي E. coli actin مثل MreB14 و tubulin homolog FtsZ15. كما أنها توضح قدرة A22 على إعاقة بلمرة MreB بكفاءة من خلال الفحص المجهري epifluorescence عند التعبير عنها في الخميرة14. بعد ذلك ، نجحت مجموعات أخرى أيضا في استخدام خميرة الانشطار لدراسة خصائص تجميع بروتينات البلاستيدة الخضراء FtsZ1 و FtsZ216. في الآونة الأخيرة ، أنشأنا دليلا على مفهوم جدوى استخدام خميرة الانشطار كمنصة خلوية لفحص مثبطات الهيكل الخلوي البكتيري على وجه التحديد من خلال إجراء تقييم شامل لتأثير ثلاثة مثبطات FtsZ معروفة - سانجوينارين ، بربارين ، وبروتينات FtsZ PC190723 مشتقة من اثنين من البكتيريا المسببة للأمراض ، وهما المكورات العنقودية الذهبية وهيليكوباكتر بيلوري17. بالإضافة إلى ذلك ، يثبت هذا الفحص القائم على الخلية أحادي الخطوة أنه فعال في تقليل مخاطر تحديد المركبات التي قد تكون سامة للخلايا حقيقية النواة.
في هذا التقرير ، باستخدام نظام الخميرة الانشطارية ، نقترح سير عمل منهجي باستخدام لوحة 96 بئرا القياسية للفحص شبه الآلي والقياس الكمي لتأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف FtsZ من المكورات العنقودية الذهبية و MreB من الإشريكية القولونية. هنا ، قمنا بإعداد وتحسين سير العمل شبه الآلي باستخدام مثبطات PC190723 و A22 التي تستهدف على وجه التحديد FtsZ و MreB ، على التوالي. يستخدم سير العمل هذا مجهرا فوق فلوري مزودا بمرحلة عالية الدقة مزودة بمحرك والحصول الآلي على الصور في لوحة قياسية ذات 96 بئرا لتحسين التوحيد الحالي. وبالتالي ، يمكن تطبيقه على الشاشات المتوسطة والعالية الإنتاجية للمكتبات الكيميائية الاصطناعية والتحايل على بعض التحديات المذكورة أعلاه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>160376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>&#160;CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A22 Hydrochloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>SML0471</td>
			<td>Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0229</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C5275-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PMD0210</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion&#174; 96 with 2-position slider</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5069000101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0144</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>German company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0157</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>517992-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>344580</td>
			<td>Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>202398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td>Filter sterilised</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydrochloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>194855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0214</td>
			<td>225 mg/L of media, Store solution at 36&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YES (Yeast extract + supplements) Agar</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PCM0410</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YES (Yeast extract + supplements) Broth</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PCM0310</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast (S. pombe) media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract + supplements (YES)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
			<td>g/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dextrose</td>
			<td>30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Agar</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adenine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Lysine HCl</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Uracil</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburg minimal medium (EMM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
			<td>g/L</td>
			<td>concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>potassium hydrogen phthallate&#160;</td>
			<td>3</td>
			<td>14.7mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4&#160;</td>
			<td>2.2</td>
			<td>15.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>5</td>
			<td>93.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>glucose</td>
			<td>2% (w/v) or 20 g/L</td>
			<td>&#160;111 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Salts (stock x 50)</td>
			<td>20 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Vitamins (stock x 1000)</td>
			<td>1 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Minerals (Stock x 10,000)</td>
			<td>0.1 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts x 50&#160;</td>
			<td>52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)&#160;</td>
			<td>52.5</td>
			<td>0.26 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)&#160;</td>
			<td>0.000735</td>
			<td>4.99 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 g/l KCl (0.67 M)&#160;</td>
			<td>50</td>
			<td>0.67 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 g/l Na2SO4 (14.l mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>14.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins x 1000&#160;</td>
			<td>1 g/l pantothenic acid&#160;</td>
			<td>1</td>
			<td>4.20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 g/l nicotinic acid&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>81.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 g/l inositol&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>55.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 mg/l biotin&#160;</td>
			<td>0.01</td>
			<td>40.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minerals x 10,000&#160;</td>
			<td>boric acid</td>
			<td>5</td>
			<td>80.9 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MnSO4&#160;&#160;</td>
			<td>4</td>
			<td>23.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>4</td>
			<td>13.9 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>FeCl2.6H2O&#160;&#160;</td>
			<td>2</td>
			<td>7.40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>molybdic acid&#160;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>2.47 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>KI&#160;</td>
			<td>1</td>
			<td>6.02 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CuSO4.5H2O&#160;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>1.60 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>citric acid&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>47.6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains/ Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td>Description</td>
			<td>Reference</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD190</td>
			<td>Escherichia coli DH10&#946;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY4&#160;</td>
			<td>MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB</td>
			<td>Srinivasan et al., 2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY340</td>
			<td>CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP</td>
			<td>Sharma et al., 2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY346</td>
			<td>MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]</td>
			<td>Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCCD3</td>
			<td>pREP42-GFP-EcMreB</td>
			<td>Srinivasan et al., 2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCCD713</td>
			<td>pREP42-SaFtsZ-GFP</td>
			<td>Sharma et al., 2023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fission yeast as a platform for antibacterial drug screens targeting bacterial cytoskeleton proteins

تؤدي البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية مثل FtsZ و MreB وظائف أساسية مثل انقسام الخلايا والحفاظ على شكل الخلية. علاوة على ذلك ، برزت FtsZ و MreB كأهداف مهمة لاكتشاف مضادات الميكروبات الجديدة. تم تطوير العديد من المقايسات لتحديد المركبات التي تستهدف ربط النوكليوتيدات وبلمرة هذه البروتينات الهيكلية الخلوية ، والتي تركز بشكل أساسي على FtsZ. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الفحوصات إما شاقة أو كثيفة التكلفة ، والتأكد مما إذا كانت هذه البروتينات هي الهدف الخلوي للدواء غالبا ما يتطلب طرقا متعددة. أخيرا ، تشكل سمية الأدوية للخلايا حقيقية النواة مشكلة أيضا. هنا ، نصف مقايسة قائمة على الخلية من خطوة واحدة لاكتشاف جزيئات جديدة تستهدف الهيكل الخلوي البكتيري وتقليل الضربات التي قد تكون سامة للخلايا حقيقية النواة. خميرة الانشطار قابلة للشاشات عالية الإنتاجية القائمة على الفحص المجهري ، ويمكن للشاشة المرئية التعرف بسهولة على أي جزيء يغير بلمرة FtsZ أو MreB. يستخدم الفحص الخاص بنا الصفيحة القياسية المكونة من 96 بئرا ويعتمد على قدرة البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية على البلمرة في خلية حقيقية النواة مثل خميرة الانشطار. في حين أن البروتوكولات الموصوفة هنا مخصصة لخميرة الانشطار وتستخدم FtsZ من المكورات العنقودية الذهبية و MreB من الإشريكية القولونية ، إلا أنها قابلة للتكيف بسهولة مع البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية الأخرى التي تتجمع بسهولة في البوليمرات في أي مضيفات تعبير حقيقية النواة. يجب أن تساعد الطريقة الموصوفة هنا في تسهيل اكتشاف المزيد من مضادات الميكروبات الجديدة التي تستهدف البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية.

The widespread resistance to nearly all antibiotics presently employed to combat bacterial infections has created an immediate necessity for novel categories of antibiotics. A 2019 report indicated that antibiotic-resistant infections resulted in the loss of 1.27 million lives, contributing to an overall tally of 4.95 million deaths when considering complications from resistant bacterial infections1. While still effective in clinical practice, the current arsenal of antibiotics predominantly targets a narrow spectrum of cellular processes, primarily focusing on cell wall, DNA, and protein synthesis. Over the past half-century, fewer than 30 proteins have been commercially exploited as targets for the development of new anti-bacterials2,3. This limited range of viable targets significantly creates constraints to discovering new antibiotics or their derivatives for combating antibiotic-resistant bacteria. Thus, to overcome the emerging antibiotic resistance problem, there is a need for the development of new antibiotics with novel targets and mechanisms of action.
An antibacterial target should ideally be an essential component of bacterial cell growth, be conserved throughout the phylogenetically diverse species, show least eukaryotic homology, and be accessible to antibiotics4. Since the discovery of bacterial cytoskeletal proteins involved in cell division and cell shape maintenance, they have emerged as a promising focal point for developing antibacterial compounds5. These proteins are essential for bacterial viability and play a pivotal role in maintaining cell shape (MreB, CreS), division (FtsZ, FtsA), and DNA segregation (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), akin to the cytoskeleton in eukaryotic cells. Notably, FtsZ exhibits a remarkably high level of conservation across a wide range of prokaryotic organisms, while MreB is found in nearly all rod-shaped bacteria. Such wide distribution and relevance in cell viability make these proteins a fascinating target in antibiotic research5,6,7.
It is crucial to adopt a multi-pronged approach that combines in vivo observations, in vitro interactions, and enzymatic experiments to thoroughly validate bacterial cytoskeleton proteins as the primary target of a potential inhibitor7. Laborious procedures or substantial cost implications encumber many available assays for this purpose. These are notable obstacles to their widespread utilization in screening lead compounds that could impact the bacterial cytoskeleton. Among these, microscopy stands out as an exceptionally efficient and rapid method for assessing the effectiveness of compounds by directly examining changes in cell morphology. Yet, the hetero-association of target protein with other cytoskeleton complexes, indirect effects due to off-target binding and changes in membrane potential, difficulty in penetrating the cell efficiently, and presence of efflux pumps, especially in Gram-negative bacteria, make it collectively complex to pinpoint the precise cause of bacterial cell deformation8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, or fission yeast as it&#39;s commonly known, is a rod-shaped unicellular eukaryotic organism. Fission yeast is widely used as a model organism in cellular and molecular biology due to the extraordinary conservation in cellular processes such as the cell cycle and division, cellular organization, and chromosome replication with higher eukaryotes, including humans11,12. Furthermore, Errington and colleagues expressed a pole-localized bacterial cytoskeletal protein DivIVA in fission yeast to demonstrate that DivIVA accumulated on negatively curved surfaces13. Again, Balasubramanian and group had first established fission yeast as a cellular model system to bring new insights into the mechanism, assembly, and dynamicity of the E. coli actin cytoskeleton protein like MreB14 and tubulin homolog FtsZ15. They also demonstrate the ability of A22 to efficiently impede the polymerization of MreB through epifluorescence microscopy when expressed in yeast14. Following this, other groups have also successfully employed fission yeast to study the assembly properties of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 proteins16. More recently, we have established a proof-of-concept of the viability of the use of fission yeast as a cellular platform to specifically screen for bacterial cytoskeleton inhibitors by conducting a comprehensive assessment of the impact of three known FtsZ inhibitors-sanguinarine, berberine, and PC190723-on FtsZ proteins derived from two pathogenic bacteria, namely Staphylococcus aureus and Helicobacter pylori17. Additionally, this single-step cell-based assay proves instrumental in minimizing the risk of identifying compounds that may be potentially toxic to eukaryotic cells.
In this report, utilizing the fission yeast system, we propose a systematic workflow using the standard 96-well plate for semi-automated screening and quantification of the effect of small molecule inhibitors targeting FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli. Here, we set up and optimize the semi-automated workflow using the established inhibitors PC190723 and A22 that specifically target FtsZ and MreB, respectively. This workflow uses an epifluorescence microscope equipped with a motorized high-precision stage and automated image acquisition in a standard 96-well plate to improve upon current standardization. Hence, it can be applied to medium- as well as high-throughput screens of synthetic chemical libraries and circumvents some of the challenges listed above.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف ديناميكيات الهيكل الخلوي للكشف عن مضادات حيوية جديدة من خلال المقايسات المبتكرة القائمة على الخلايا

خميرة الانشطار كمنصة لشاشات الأدوية المضادة للبكتيريا التي تستهدف بروتينات الهيكل الخلوي البكتيرية

Our laboratory is interested in understanding how cytoskeletal proteins assemble dynamic structures to regulate functions such as DNA partitioning and cell division in bacteria. We are also interested in discovering compounds that target these cytoskeletal proteins to develop novel antibiotics. Our protocol is a cell-based assay in which the bacterial cytoskeleton protein polymerizes in a molecularly crowded environment in the eukaryotic yeast, Schizosaccharomyces pombe.With this approach, simultaneously, we can identify molecules that directly affects the bacterial cytoskeleton proteins, polymerization, and are potentially toxic. Using this fission yeast platform, we plan to screen libraries of macrocyclic compounds, specifically targeting FtsZ of pathogenic bacteria like Helicobacter pylori and Pseudomonas aeruginosa. We also plan to expand the screens to target actin-like proteins from Clostridium perfringens involved in plasmid segregation.

إعداد لوحة 96 بئرا لفحص المخدرات تم استخدام S. pombe للتعبير عن C- نهائيا GFP الموسوم S. aureus FtsZ من ناقل (pREP42) يحتوي على مروج الثيامين القابل للقمع متوسط القوة nmt41تم تحديده سابقا17 وبالمثل ، تم التعبير عن E. coli MreB الموسوم ب N- terminal GFP أيضا في S. pombe1...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Unveil Novel Antibiotics Through Innovative Cell-Based Assays at JoVE.com

تستخدم خميرة الانشطار هنا كمضيف غير متجانس للتعبير عن البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية مثل FtsZ و MreB كبروتينات اندماج متعدية مع GFP لتصور بلمرتها. أيضا ، يتم تحديد المركبات التي تؤثر على البلمرة عن طريق التصوير باستخدام المجهر الفلوري.

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...

يهتم مختبرنا بفهم كيفية تجميع البروتينات الهيكلية الخلوية للهياكل الديناميكية لتنظيم وظائف مثل تقسيم الحمض النووي وانقسام الخلايا في البكتيريا. نحن مهتمون أيضا باكتشاف المركبات التي تستهدف هذه البروتينات الهيكلية الخلوية لتطوير مضادات حيوية جديدة. بروتوكولنا عبارة عن اختبار قائم على الخلايا يتبلمر فيه بروتين الهيكل الخلوي البكتيري في بيئة مزدحمة جزيئيا في الخميرة حقيقية النواة ، Schizosaccharomyces pombe.باستخدام هذا النهج ، في نفس الوقت ، يمكننا تحديد الجزيئات التي تؤثر بشكل مباشر على بروتينات الهيكل الخلوي البكتيري ، والبلمرة ، والتي يحتمل أن تكون سامة. باستخدام منصة الخميرة الانشطارية هذه ، نخطط لفحص مكتبات المركبات الحلقية الكبيرة ، وتستهدف على وجه التحديد FtsZ للبكتيريا المسببة للأمراض مثل هيليكوباكتر بيلوري و Pseudomonas aeruginosa. نخطط أيضا لتوسيع الشاشات لاستهداف البروتينات الشبيهة بالأكتين من كلوستريديوم بيرفرينجنز المشاركة في فصل البلازميد.

fission-yeast-as-platform-for-antibacterial-drug-screens-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.