Name: Autor im Rampenlicht: Erforschung der Dynamik des Zytoskeletts zur Enthüllung neuartiger Antibiotika durch innovative zellbasierte Assays
Uploaded: 2024-04-26T14:35:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Unveil Novel Antibiotics Through Innovative Cell-Based Assays at JoVE.com

SMP, SR und AKS würdigen die Stipendien, die sie vom National Institute of Science Education and Research, Department of Atomic Energy, erhalten haben. RS bedankt sich für die interne finanzielle Unterstützung durch das Department of Atomic Energy, und diese Arbeit wird durch ein Forschungsstipendium des Department of Biotechnology (DBT) an RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) unterstützt. Die Autoren danken auch V Badireenath Konkimalla für seine Kommentare, Vorschläge und Diskussionen während der Entwicklung des Protokolls.

1. Expression von GFP-markierten bakteriellen Zytoskelettproteinen in S. pombe
HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie Informationen zu allen hier verwendeten Plasmiden und Stämmen. In Tabelle 2 finden Sie alle Medienzusammensetzungen.
<ol><li>Durchführung der Klonierung von E. coli MreB mit einer N-terminalen GFP-Fusion (GFP-MreB) und S. aureus FtsZ mit einem C-terminalen GFP (SaFtsZ-GFP) in den S. pombe-Expressio...

Identifizierung von Medikamenten, die die Polymerisation von bakteriellen Zytoskelettproteinen beeinflussen

<ol>
	<li>Antimicrobial Resistance Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+in+2019:+a+systematic+analysis.">Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis.</a> Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).</li><li>Haselbeck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+essential+gene+identification+as+a+platform+for+novel+anti-infective+drug+discovery.">Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery.</a> Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+small+molecule+that+inhibits+cell+division+by+blocking+FtsZ,+a+novel+therapeutic+target+of+antibiotics.">Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).</li><li>Sanchez, S., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).</li><li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prokaryotic+cytoskeleton:+a+putative+target+for+inhibitors+and+antibiotics.">The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).</li><li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+bacterial+Z-ring.">Targeting the bacterial Z-ring.</a> Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).</li><li>Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+as+an+antibacterial+target:+status+and+guidelines+for+progressing+this+avenue.">FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue.</a> ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).</li><li>Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RND-type+efflux+pumps+confers+the+FtsZ-directed+prodrug+TXY436+with+activity+against+Gram-negative+bacteria.">Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria.</a> Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).</li><li>Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bacterial+cell+division:+A+binding+site-centered+approach+to+the+most+promising+inhibitors+of+the+essential+protein+FtsZ.">Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ.</a> Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).</li><li>Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistance+efflux+pumps+-+not+just+for+resistance.">Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance.</a> Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).</li><li>K&#228;ufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+correctly+excises+a+mammalian+RNA+transcript+intervening+sequence.">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence.</a> Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).</li><li>Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe:+A+unicellular+micromammal+model+organism.">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism.</a> Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).</li><li>Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+targeting+of+Bacillus+subtilis+cell+division+protein+DivIVA+to+division+sites+in+Escherichia+coli+and+fission+yeast.">Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast.</a> EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).</li><li>Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filament+formation+of+the+Escherichia+coli+actin-related+protein,+MreB,+in+fission+yeast.">Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast.</a> Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).</li><li>Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+cytoplasmic+rings+in+fission+yeast.">The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast.</a> Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).</li><li>TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+functions+of+chloroplast+FtsZ1+and+FtsZ2+in+Z-ring+structure+and+remodeling.">Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling.</a> J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).</li><li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+of+salt+bridge-mediated+resistance+to+FtsZ+inhibitor+PC190723+revealed+by+a+cell-based+screen.">A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen.</a> Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).</li><li>Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TATA+box+mutations+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+nmt1+promoter+affect+transcription+efficiency+but+not+the+transcription+start+point+or+thiamine+repressibility.">TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility.</a> Gene. 123 (1), 131-136 (1993).</li><li>Moreno, M. B., Dur&#225;n, A., Carlos Ribas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+multifunctional+thiamine-repressible+expression+vectors+for+fission+yeast.">A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast.</a> Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caring+for+Escherichia+coli.">Caring for Escherichia coli.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+DNA.">Isolation and quantification of DNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li><li>B&#228;hler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filament+organization+of+the+bacterial+actin+MreB+is+dependent+on+the+nucleotide+state.">Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state.</a> J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+for+enumeration+of+cell+colony+forming+units.">Machine learning for enumeration of cell colony forming units.</a> Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).</li><li>Moen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+for+cellular+image+analysis.">Deep learning for cellular image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+cytoskeletal+organizations+by+microscopic+image+analysis.">Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis.</a> Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).</li><li>Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACTIN+DEPOLYMERIZING+FACTOR4+regulates+actin+dynamics+during+innate+immune+signaling+in+Arabidopsis.">ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Butler, M. S., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+in+the+clinical+pipeline+in+October+2019.">Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019.</a> J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).</li><li>Andreu, J. M., Huecas, S., Ara&#250;jo-Baz&#225;n, L., V&#225;zquez-Villa, H., Mart&#237;n-Fontecha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+antibacterial+inhibitors+targeting+cell+division+protein+ftsz+at+its+nucleotide+and+allosteric+binding+sites.">The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites.</a> Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).</li><li>Vje&#353;tica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+stable+integration+vectors+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+bacterial+actin+homologs.">The structure and function of bacterial actin homologs.</a> Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+yeast+for+young+geneticists:+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system.">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li><li>Aoi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+first+and+the+second+meiotic+divisions+using+a+marker-less+drug-hypersensitive+fission+yeast.">Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast.</a> Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+sensitivity+of+HIV-1+protease+inhibitors+by+restriction+of+cellular+efflux+system+in+a+fission+yeast+model.">Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model.</a> Pathogens. 11 (7), 804 (2022).</li></ol>

Antimikrobielle Resistenzen (AMR) sind eine ernsthafte globale Gesundheitsbedrohung, und es besteht ein dringender Bedarf an neuen Antibiotika mit neuen Zielen. Das bakterielle Zytoskelett hat sich als attraktives Ziel für die Entwicklung neuer Antibiotika erwiesen, wobei sich niedermolekulare Inhibitoren des Zellteilungsproteins FtsZ, wie TXA709, bereits in klinischen Phase-I-Studienbefinden 30. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Inhibitoren der FtsZ-Polymerisationzu ide...

Die weit verbreitete Resistenz gegen fast alle Antibiotika, die derzeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt werden, hat einen unmittelbaren Bedarf an neuen Kategorien von Antibiotika geschaffen. Ein Bericht aus dem Jahr 2019 zeigte, dass antibiotikaresistente Infektionen zum Verlust von 1,27 Millionen Menschenleben führten, was zu einer Gesamtzahl von 4,95 Millionen Todesfällen beitrug, wenn man die Komplikationen durch resistente bakterielle Infektionen berücksichtigte1. Während das derzeitige Arsenal an Antibiotika in der klinischen Praxis immer noch wirksam ist, zielt es hauptsächlich auf ein schmales Spektrum zellulärer Prozesse ab, die sich hauptsächlich auf die Zellwand-, DNA- und Proteinsynthese konzentrieren. In den letzten 50 Jahren wurden weniger als 30 Proteine kommerziell als Ziele für die Entwicklung neuer antibakterieller Wirkstoffe genutzt 2,3. Diese begrenzte Auswahl an praktikablen Zielen schränkt die Entdeckung neuer Antibiotika oder ihrer Derivate zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien erheblich ein. Um das sich abzeichnende Problem der Antibiotikaresistenz zu überwinden, besteht daher die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Antibiotika mit neuartigen Zielen und Wirkmechanismen.
Ein antibakterielles Ziel sollte idealerweise ein wesentlicher Bestandteil des bakteriellen Zellwachstums sein, in allen phylogenetisch vielfältigen Spezies konserviert sein, die geringste eukaryotische Homologie aufweisen und für Antibiotika zugänglich sein4. Seit der Entdeckung bakterieller Zytoskelettproteine, die an der Zellteilung und der Aufrechterhaltung der Zellform beteiligt sind, haben sie sich zu einem vielversprechenden Schwerpunkt für die Entwicklung antibakterieller Wirkstoffe entwickelt5. Diese Proteine sind essentiell für die Lebensfähigkeit von Bakterien und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellform (MreB, CreS), der Teilung (FtsZ, FtsA) und der DNA-Segregation (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), ähnlich dem Zytoskelett in eukaryotischen Zellen. Bemerkenswert ist, dass FtsZ ein bemerkenswert hohes Maß an Konservierung bei einer Vielzahl von prokaryotischen Organismen aufweist, während MreB in fast allen stäbchenförmigen Bakterien vorkommt. Diese weite Verbreitung und Relevanz für die Lebensfähigkeit von Zellen machen diese Proteine zu einem faszinierenden Ziel in der Antibiotikaforschung 5,6,7.
Es ist von entscheidender Bedeutung, einen mehrgleisigen Ansatz zu verfolgen, der In-vivo-Beobachtungen, In-vitro-Interaktionen und enzymatische Experimente kombiniert, um bakterielle Zytoskelettproteine als primäres Ziel eines potenziellen Inhibitors gründlich zu validieren7. Aufwändige Verfahren oder erhebliche Kostenauswirkungen belasten viele verfügbare Assays für diesen Zweck. Dies sind bemerkenswerte Hindernisse für ihre weit verbreitete Verwendung beim Screening von Leitverbindungen, die das bakterielle Zytoskelett beeinträchtigen könnten. Unter diesen sticht die Mikroskopie als eine außergewöhnlich effiziente und schnelle Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Verbindungen hervor, indem Veränderungen in der Zellmorphologie direkt untersucht werden. Die Heteroassoziation des Zielproteins mit anderen Zytoskelettkomplexen, indirekte Effekte aufgrund von Off-Target-Bindung und Veränderungen des Membranpotentials, Schwierigkeiten bei der effizienten Durchdringung der Zelle und das Vorhandensein von Effluxpumpen, insbesondere in gramnegativen Bakterien, machen es jedoch komplex, die genaue Ursache der bakteriellen Zelldeformation zu bestimmen 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, oder Spalthefe, wie sie allgemein genannt wird, ist ein stäbchenförmiger, einzelliger eukaryotischer Organismus. Die Spalthefe wird aufgrund der außergewöhnlichen Konservierung zellulärer Prozesse wie dem Zellzyklus und der Zellteilung, der zellulären Organisation und der Chromosomenreplikation mit höheren Eukaryoten, einschließlich des Menschen, häufig als Modellorganismus in der Zell- und Molekularbiologie verwendet11,12. Darüber hinaus exprimierten Errington und Kollegen ein pollokalisiertes bakterielles Zytoskelettprotein DivIVA in Spalthefe, um zu zeigen, dass sich DivIVA auf negativ gekrümmten Oberflächen ansammelte13. Auch hier hatten Balasubramanian und seine Gruppe zunächst die Spalthefe als zelluläres Modellsystem etabliert, um neue Einblicke in den Mechanismus, die Assemblierung und die Dynamik des Aktin-Zytoskelett-Proteins von E. coli wie MreB14 und dem Tubulin-Homolog FtsZ15 zu gewinnen. Sie zeigen auch die Fähigkeit von A22, die Polymerisation von MreB durch Epifluoreszenzmikroskopie effizient zu behindern, wenn es in Hefeexprimiert wird 14. Im Anschluss daran haben auch andere Gruppen erfolgreich Spalthefe eingesetzt, um die Assemblierungseigenschaften der Chloroplasten FtsZ1 und FtsZ2 Proteine zu untersuchen16. In jüngerer Zeit haben wir einen Proof-of-Concept für die Machbarkeit der Verwendung von Spalthefe als zelluläre Plattform für das spezifische Screening auf bakterielle Zytoskelett-Inhibitoren erstellt, indem wir eine umfassende Bewertung der Auswirkungen von drei bekannten FtsZ-Inhibitoren - Sanguinarin, Berberin und PC190723-on-FtsZ-Proteine - durchgeführt haben, die von zwei pathogenen Bakterien, nämlich Staphylococcus aureus und Helicobacter pylori17. Darüber hinaus erweist sich dieser einstufige zellbasierte Assay als entscheidend für die Minimierung des Risikos bei der Identifizierung von Verbindungen, die für eukaryotische Zellen potenziell toxisch sein können.
In diesem Bericht schlagen wir unter Verwendung des Spalthefesystems einen systematischen Arbeitsablauf vor, der die Standard-96-Well-Platte für das halbautomatische Screening und die Quantifizierung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren verwendet, die auf FtsZ aus Staphylococcus aureus und MreB aus Escherichia coli abzielen. Hier haben wir den teilautomatisierten Workflow mit den etablierten Inhibitoren PC190723 und A22 aufgebaut und optimiert, die spezifisch auf FtsZ bzw. MreB abzielen. Bei diesem Arbeitsablauf wird ein Epifluoreszenzmikroskop verwendet, das mit einem motorisierten, hochpräzisen Tisch und einer automatisierten Bildaufnahme in einer Standard-96-Well-Platte ausgestattet ist, um die derzeitige Standardisierung zu verbessern. Daher kann es sowohl auf Mittel- als auch auf Hochdurchsatz-Screenings von synthetischen chemischen Bibliotheken angewendet werden und umgeht einige der oben genannten Herausforderungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>160376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>&#160;CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A22 Hydrochloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>SML0471</td>
			<td>Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0229</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C5275-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PMD0210</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion&#174; 96 with 2-position slider</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5069000101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0144</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>German company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0157</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>517992-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>344580</td>
			<td>Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>202398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td>Filter sterilised</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydrochloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>194855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0214</td>
			<td>225 mg/L of media, Store solution at 36&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YES (Yeast extract + supplements) Agar</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PCM0410</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YES (Yeast extract + supplements) Broth</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PCM0310</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast (S. pombe) media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract + supplements (YES)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
			<td>g/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dextrose</td>
			<td>30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Agar</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adenine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Lysine HCl</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Uracil</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburg minimal medium (EMM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
			<td>g/L</td>
			<td>concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>potassium hydrogen phthallate&#160;</td>
			<td>3</td>
			<td>14.7mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4&#160;</td>
			<td>2.2</td>
			<td>15.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>5</td>
			<td>93.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>glucose</td>
			<td>2% (w/v) or 20 g/L</td>
			<td>&#160;111 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Salts (stock x 50)</td>
			<td>20 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Vitamins (stock x 1000)</td>
			<td>1 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Minerals (Stock x 10,000)</td>
			<td>0.1 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts x 50&#160;</td>
			<td>52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)&#160;</td>
			<td>52.5</td>
			<td>0.26 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)&#160;</td>
			<td>0.000735</td>
			<td>4.99 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 g/l KCl (0.67 M)&#160;</td>
			<td>50</td>
			<td>0.67 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 g/l Na2SO4 (14.l mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>14.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins x 1000&#160;</td>
			<td>1 g/l pantothenic acid&#160;</td>
			<td>1</td>
			<td>4.20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 g/l nicotinic acid&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>81.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 g/l inositol&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>55.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 mg/l biotin&#160;</td>
			<td>0.01</td>
			<td>40.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minerals x 10,000&#160;</td>
			<td>boric acid</td>
			<td>5</td>
			<td>80.9 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MnSO4&#160;&#160;</td>
			<td>4</td>
			<td>23.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>4</td>
			<td>13.9 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>FeCl2.6H2O&#160;&#160;</td>
			<td>2</td>
			<td>7.40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>molybdic acid&#160;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>2.47 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>KI&#160;</td>
			<td>1</td>
			<td>6.02 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CuSO4.5H2O&#160;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>1.60 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>citric acid&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>47.6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains/ Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td>Description</td>
			<td>Reference</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD190</td>
			<td>Escherichia coli DH10&#946;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY4&#160;</td>
			<td>MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB</td>
			<td>Srinivasan et al., 2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY340</td>
			<td>CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP</td>
			<td>Sharma et al., 2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY346</td>
			<td>MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]</td>
			<td>Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCCD3</td>
			<td>pREP42-GFP-EcMreB</td>
			<td>Srinivasan et al., 2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCCD713</td>
			<td>pREP42-SaFtsZ-GFP</td>
			<td>Sharma et al., 2023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fission yeast as a platform for antibacterial drug screens targeting bacterial cytoskeleton proteins

Bakterielle Proteine des Zytoskeletts wie FtsZ und MreB erfüllen wesentliche Funktionen wie die Zellteilung und die Aufrechterhaltung der Zellform. Darüber hinaus haben sich FtsZ und MreB als wichtige Ziele für die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe herausgestellt. Es wurden mehrere Assays entwickelt, um Verbindungen zu identifizieren, die auf die Nukleotidbindung und Polymerisation dieser Zytoskelettproteine abzielen, die sich hauptsächlich auf FtsZ konzentrieren. Darüber hinaus sind viele der Assays entweder aufwendig oder kostenintensiv, und um festzustellen, ob diese Proteine das zelluläre Ziel des Medikaments sind, sind oft mehrere Methoden erforderlich. Schließlich stellt auch die Toxizität der Medikamente für eukaryotische Zellen ein Problem dar. Hier beschreiben wir einen einstufigen zellbasierten Assay, um neuartige Moleküle zu entdecken, die auf das bakterielle Zytoskelett abzielen, und um Treffer zu minimieren, die für eukaryotische Zellen potenziell toxisch sein könnten. Spalthefe ist für Hochdurchsatz-Screenings auf der Grundlage der Mikroskopie zugänglich, und ein visueller Screen kann jedes Molekül, das die Polymerisation von FtsZ oder MreB verändert, leicht identifizieren. Unser Assay verwendet die Standard-96-Well-Platte und stützt sich auf die Fähigkeit der bakteriellen Zytoskelettproteine, in einer eukaryotischen Zelle, wie z. B. der Spalthefe, zu polymerisieren. Während die hier beschriebenen Protokolle für Spalthefe gelten und FtsZ aus Staphylococcus aureus und MreB aus Escherichia coli verwenden, sind sie leicht an andere bakterielle Zytoskelettproteine anpassbar, die sich in allen eukaryotischen Expressionswirten leicht zu Polymeren zusammensetzen. Die hier beschriebene Methode sollte dazu beitragen, die weitere Entdeckung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe zu erleichtern, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen.

The widespread resistance to nearly all antibiotics presently employed to combat bacterial infections has created an immediate necessity for novel categories of antibiotics. A 2019 report indicated that antibiotic-resistant infections resulted in the loss of 1.27 million lives, contributing to an overall tally of 4.95 million deaths when considering complications from resistant bacterial infections1. While still effective in clinical practice, the current arsenal of antibiotics predominantly targets a narrow spectrum of cellular processes, primarily focusing on cell wall, DNA, and protein synthesis. Over the past half-century, fewer than 30 proteins have been commercially exploited as targets for the development of new anti-bacterials2,3. This limited range of viable targets significantly creates constraints to discovering new antibiotics or their derivatives for combating antibiotic-resistant bacteria. Thus, to overcome the emerging antibiotic resistance problem, there is a need for the development of new antibiotics with novel targets and mechanisms of action.
An antibacterial target should ideally be an essential component of bacterial cell growth, be conserved throughout the phylogenetically diverse species, show least eukaryotic homology, and be accessible to antibiotics4. Since the discovery of bacterial cytoskeletal proteins involved in cell division and cell shape maintenance, they have emerged as a promising focal point for developing antibacterial compounds5. These proteins are essential for bacterial viability and play a pivotal role in maintaining cell shape (MreB, CreS), division (FtsZ, FtsA), and DNA segregation (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), akin to the cytoskeleton in eukaryotic cells. Notably, FtsZ exhibits a remarkably high level of conservation across a wide range of prokaryotic organisms, while MreB is found in nearly all rod-shaped bacteria. Such wide distribution and relevance in cell viability make these proteins a fascinating target in antibiotic research5,6,7.
It is crucial to adopt a multi-pronged approach that combines in vivo observations, in vitro interactions, and enzymatic experiments to thoroughly validate bacterial cytoskeleton proteins as the primary target of a potential inhibitor7. Laborious procedures or substantial cost implications encumber many available assays for this purpose. These are notable obstacles to their widespread utilization in screening lead compounds that could impact the bacterial cytoskeleton. Among these, microscopy stands out as an exceptionally efficient and rapid method for assessing the effectiveness of compounds by directly examining changes in cell morphology. Yet, the hetero-association of target protein with other cytoskeleton complexes, indirect effects due to off-target binding and changes in membrane potential, difficulty in penetrating the cell efficiently, and presence of efflux pumps, especially in Gram-negative bacteria, make it collectively complex to pinpoint the precise cause of bacterial cell deformation8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, or fission yeast as it&#39;s commonly known, is a rod-shaped unicellular eukaryotic organism. Fission yeast is widely used as a model organism in cellular and molecular biology due to the extraordinary conservation in cellular processes such as the cell cycle and division, cellular organization, and chromosome replication with higher eukaryotes, including humans11,12. Furthermore, Errington and colleagues expressed a pole-localized bacterial cytoskeletal protein DivIVA in fission yeast to demonstrate that DivIVA accumulated on negatively curved surfaces13. Again, Balasubramanian and group had first established fission yeast as a cellular model system to bring new insights into the mechanism, assembly, and dynamicity of the E. coli actin cytoskeleton protein like MreB14 and tubulin homolog FtsZ15. They also demonstrate the ability of A22 to efficiently impede the polymerization of MreB through epifluorescence microscopy when expressed in yeast14. Following this, other groups have also successfully employed fission yeast to study the assembly properties of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 proteins16. More recently, we have established a proof-of-concept of the viability of the use of fission yeast as a cellular platform to specifically screen for bacterial cytoskeleton inhibitors by conducting a comprehensive assessment of the impact of three known FtsZ inhibitors-sanguinarine, berberine, and PC190723-on FtsZ proteins derived from two pathogenic bacteria, namely Staphylococcus aureus and Helicobacter pylori17. Additionally, this single-step cell-based assay proves instrumental in minimizing the risk of identifying compounds that may be potentially toxic to eukaryotic cells.
In this report, utilizing the fission yeast system, we propose a systematic workflow using the standard 96-well plate for semi-automated screening and quantification of the effect of small molecule inhibitors targeting FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli. Here, we set up and optimize the semi-automated workflow using the established inhibitors PC190723 and A22 that specifically target FtsZ and MreB, respectively. This workflow uses an epifluorescence microscope equipped with a motorized high-precision stage and automated image acquisition in a standard 96-well plate to improve upon current standardization. Hence, it can be applied to medium- as well as high-throughput screens of synthetic chemical libraries and circumvents some of the challenges listed above.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Dynamik des Zytoskeletts zur Enthüllung neuartiger Antibiotika durch innovative zellbasierte Assays

Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Our laboratory is interested in understanding how cytoskeletal proteins assemble dynamic structures to regulate functions such as DNA partitioning and cell division in bacteria. We are also interested in discovering compounds that target these cytoskeletal proteins to develop novel antibiotics. Our protocol is a cell-based assay in which the bacterial cytoskeleton protein polymerizes in a molecularly crowded environment in the eukaryotic yeast, Schizosaccharomyces pombe.With this approach, simultaneously, we can identify molecules that directly affects the bacterial cytoskeleton proteins, polymerization, and are potentially toxic. Using this fission yeast platform, we plan to screen libraries of macrocyclic compounds, specifically targeting FtsZ of pathogenic bacteria like Helicobacter pylori and Pseudomonas aeruginosa. We also plan to expand the screens to target actin-like proteins from Clostridium perfringens involved in plasmid segregation.

Aufbau der 96-Well-Platte für das Screening von Medikamenten Die Verwendung von S. pombe zur Expression eines C-terminalen GFP-markierten S. aureus FtsZ aus einem Vektor (pREP42), der den mittelstarken thiaminhaltigen repressiblen Promotor nmt41enthält, wurde zuvor nachgewiesen17 und in ähnlicher Weise wurde das mit N- terminalem GFP markierte E. coli MreB auch in S. pombe14 exprimiert. Wir haben auch gezei...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Unveil Novel Antibiotics Through Innovative Cell-Based Assays at JoVE.com

Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...

Unser Labor interessiert sich für das Verständnis, wie Zytoskelettproteine dynamische Strukturen zusammensetzen, um Funktionen wie die DNA-Partitionierung und die Zellteilung in Bakterien zu regulieren. Wir sind auch daran interessiert, Verbindungen zu entdecken, die auf diese Zytoskelettproteine abzielen, um neuartige Antibiotika zu entwickeln. Unser Protokoll ist ein zellbasierter Assay, bei dem das bakterielle Zytoskelett-Protein in einer molekular überfüllten Umgebung in der eukaryotischen Hefe Schizosaccharomyces pombe polymerisiert.Mit diesem Ansatz können wir gleichzeitig Moleküle identifizieren, die das bakterielle Zytoskelett, die Proteine, die Polymerisation und die Polymerisation direkt beeinflussen und potenziell toxisch sind. Mit dieser Spalthefe-Plattform planen wir, Bibliotheken makrozyklischer Verbindungen zu screenen, die speziell auf FtsZ von pathogenen Bakterien wie Helicobacter pylori und Pseudomonas aeruginosa abzielen. Wir planen auch, die Screens so zu erweitern, dass sie auf aktinähnliche Proteine aus Clostridium perfringens abzielen, die an der Plasmidsegregation beteiligt sind.

fission-yeast-as-platform-for-antibacterial-drug-screens-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.

Forschung

Biologie

Targeting GFP-Tagged Bacterial Cytoskeletal Proteins Expressed in Schizosaccharomyces pombe and Microscopic Imaging of the Polymers

Ausrichtung auf GFP-markierte bakterielle Zytoskelettproteine, die in Schizosaccharomyces pombe exprimiert werden, und mikroskopische Bildgebung der Polymere