Name: Yazar Gündemi: Yenilikçi Hücre Bazlı Tahliller Yoluyla Yeni Antibiyotikleri Ortaya Çıkarmak için Hücre İskeleti Dinamiklerini Keşfetmek
Uploaded: 2024-04-26T14:35:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Unveil Novel Antibiotics Through Innovative Cell-Based Assays at JoVE.com

SMP, SR ve AKS, Ulusal Bilim Eğitimi ve Araştırma Enstitüsü, Atom Enerjisi Bölümü'nden alınan bursları kabul eder. RS, Atom Enerjisi Bölümü'nden okul içi finansman desteğini kabul eder ve bu çalışma, Biyoteknoloji Bölümü'nden (DBT) RS'ye (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) bir araştırma hibesi yoluyla desteklenir. Yazarlar ayrıca protokolün geliştirilmesi boyunca yorumları, önerileri ve tartışmaları için V Badireenath Konkimalla'ya teşekkür eder.

1. S. pombe'de GFP etiketli bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin ekspresyonu
NOT: Burada kullanılan tüm plazmitler ve suşlar hakkında bilgi için lütfen Tablo 1'e bakın. Tüm medya kompozisyonları için lütfen Tablo 2'ye bakın.
<ol><li>E. coli MreB'nin bir N-terminal GFP füzyonu (GFP-MreB) ile klonlamasını ve S. aureus FtsZ'nin bir C-terminal GFP'yi (SaFtsZ-GFP) S. pombe ekspresyon vektö...

Bakteriyel Hücre İskeleti Proteinlerinin Polimerizasyonunu Etkileyen İlaçların Belirlenmesi

<ol>
	<li>Antimicrobial Resistance Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+in+2019:+a+systematic+analysis.">Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis.</a> Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).</li><li>Haselbeck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+essential+gene+identification+as+a+platform+for+novel+anti-infective+drug+discovery.">Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery.</a> Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+small+molecule+that+inhibits+cell+division+by+blocking+FtsZ,+a+novel+therapeutic+target+of+antibiotics.">Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).</li><li>Sanchez, S., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).</li><li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prokaryotic+cytoskeleton:+a+putative+target+for+inhibitors+and+antibiotics.">The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).</li><li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+bacterial+Z-ring.">Targeting the bacterial Z-ring.</a> Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).</li><li>Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+as+an+antibacterial+target:+status+and+guidelines+for+progressing+this+avenue.">FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue.</a> ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).</li><li>Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RND-type+efflux+pumps+confers+the+FtsZ-directed+prodrug+TXY436+with+activity+against+Gram-negative+bacteria.">Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria.</a> Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).</li><li>Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bacterial+cell+division:+A+binding+site-centered+approach+to+the+most+promising+inhibitors+of+the+essential+protein+FtsZ.">Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ.</a> Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).</li><li>Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistance+efflux+pumps+-+not+just+for+resistance.">Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance.</a> Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).</li><li>K&#228;ufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+correctly+excises+a+mammalian+RNA+transcript+intervening+sequence.">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence.</a> Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).</li><li>Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe:+A+unicellular+micromammal+model+organism.">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism.</a> Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).</li><li>Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+targeting+of+Bacillus+subtilis+cell+division+protein+DivIVA+to+division+sites+in+Escherichia+coli+and+fission+yeast.">Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast.</a> EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).</li><li>Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filament+formation+of+the+Escherichia+coli+actin-related+protein,+MreB,+in+fission+yeast.">Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast.</a> Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).</li><li>Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+cytoplasmic+rings+in+fission+yeast.">The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast.</a> Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).</li><li>TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+functions+of+chloroplast+FtsZ1+and+FtsZ2+in+Z-ring+structure+and+remodeling.">Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling.</a> J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).</li><li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+of+salt+bridge-mediated+resistance+to+FtsZ+inhibitor+PC190723+revealed+by+a+cell-based+screen.">A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen.</a> Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).</li><li>Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TATA+box+mutations+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+nmt1+promoter+affect+transcription+efficiency+but+not+the+transcription+start+point+or+thiamine+repressibility.">TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility.</a> Gene. 123 (1), 131-136 (1993).</li><li>Moreno, M. B., Dur&#225;n, A., Carlos Ribas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+multifunctional+thiamine-repressible+expression+vectors+for+fission+yeast.">A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast.</a> Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caring+for+Escherichia+coli.">Caring for Escherichia coli.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+DNA.">Isolation and quantification of DNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2018).</li><li>B&#228;hler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filament+organization+of+the+bacterial+actin+MreB+is+dependent+on+the+nucleotide+state.">Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state.</a> J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+for+enumeration+of+cell+colony+forming+units.">Machine learning for enumeration of cell colony forming units.</a> Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).</li><li>Moen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+for+cellular+image+analysis.">Deep learning for cellular image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).</li><li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+cytoskeletal+organizations+by+microscopic+image+analysis.">Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis.</a> Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).</li><li>Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACTIN+DEPOLYMERIZING+FACTOR4+regulates+actin+dynamics+during+innate+immune+signaling+in+Arabidopsis.">ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Butler, M. S., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+in+the+clinical+pipeline+in+October+2019.">Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019.</a> J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).</li><li>Andreu, J. M., Huecas, S., Ara&#250;jo-Baz&#225;n, L., V&#225;zquez-Villa, H., Mart&#237;n-Fontecha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+antibacterial+inhibitors+targeting+cell+division+protein+ftsz+at+its+nucleotide+and+allosteric+binding+sites.">The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites.</a> Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).</li><li>Vje&#353;tica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+stable+integration+vectors+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+bacterial+actin+homologs.">The structure and function of bacterial actin homologs.</a> Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+yeast+for+young+geneticists:+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system.">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li><li>Aoi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+first+and+the+second+meiotic+divisions+using+a+marker-less+drug-hypersensitive+fission+yeast.">Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast.</a> Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+sensitivity+of+HIV-1+protease+inhibitors+by+restriction+of+cellular+efflux+system+in+a+fission+yeast+model.">Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model.</a> Pathogens. 11 (7), 804 (2022).</li></ol>

Antimikrobiyal direnç (AMR) ciddi bir küresel sağlık tehdididir ve yeni hedefleri olan yeni antibiyotiklere acil ihtiyaç vardır. Bakteri hücre iskeleti, halihazırda Faz-I klinik çalışmalarda30 olan TXA709 gibi hücre bölünmesi proteini FtsZ'nin küçük moleküllü inhibitörleri ile yeni antibiyotikler geliştirmek için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. FtsZ polimerizasyonunun inhibitörlerini tanımlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir<...

Bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele etmek için şu anda kullanılan hemen hemen tüm antibiyotiklere karşı yaygın direnç, yeni antibiyotik kategorileri için acil bir gereklilik yaratmıştır. 2019 tarihli bir rapor, antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların 1,27 milyon can kaybına yol açtığını ve dirençli bakteriyel enfeksiyonlardan kaynaklanan komplikasyonlar göz önüne alındığında toplam 4,95 milyon ölüme katkıda bulunduğunu belirtti1. Klinik uygulamada hala etkili olsa da, mevcut antibiyotik cephaneliği ağırlıklı olarak hücre duvarı, DNA ve protein sentezine odaklanan dar bir hücresel süreç spektrumunu hedeflemektedir. Son yarım yüzyıl boyunca, 30'dan az protein, yeni anti-bakteriyellerin geliştirilmesi için hedef olarak ticari olarak kullanılmıştır 2,3. Bu sınırlı uygulanabilir hedef yelpazesi, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için yeni antibiyotiklerin veya türevlerinin keşfedilmesinde önemli ölçüde kısıtlamalar yaratır. Bu nedenle, ortaya çıkan antibiyotik direnci sorununun üstesinden gelmek için, yeni hedefleri ve etki mekanizmaları olan yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Bir antibakteriyel hedef ideal olarak bakteriyel hücre büyümesinin önemli bir bileşeni olmalı, filogenetik olarak çeşitli türler boyunca korunmalı, en az ökaryotik homoloji göstermeli ve antibiyotikler için erişilebilir olmalıdır4. Hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunmasında rol oynayan bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin keşfinden bu yana, antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesi için umut verici bir odak noktası olarak ortaya çıkmıştır5. Bu proteinler bakteri canlılığı için gereklidir ve ökaryotik hücrelerdeki hücre iskeletine benzer şekilde hücre şeklinin (MreB, CreS), bölünmenin (FtsZ, FtsA) ve DNA ayrışmasının (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA) korunmasında çok önemli bir rol oynar. Özellikle, FtsZ, çok çeşitli prokaryotik organizmalarda oldukça yüksek bir koruma seviyesi sergilerken, MreB neredeyse tüm çubuk şeklindeki bakterilerde bulunur. Hücre canlılığındaki bu kadar geniş dağılım ve alaka düzeyi, bu proteinleri antibiyotik araştırmalarında büyüleyici bir hedef haline getirmektedir 5,6,7.
Potansiyel bir inhibitörün7 birincil hedefi olarak bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini kapsamlı bir şekilde doğrulamak için in vivo gözlemleri, in vitro etkileşimleri ve enzimatik deneyleri birleştiren çok yönlü bir yaklaşım benimsemek çok önemlidir. Zahmetli prosedürler veya önemli maliyet etkileri, bu amaç için mevcut birçok tahlili zorunlu kılar. Bunlar, bakteri hücre iskeletini etkileyebilecek kurşun bileşiklerinin taranmasında yaygın olarak kullanılmalarının önündeki dikkate değer engellerdir. Bunlar arasında mikroskopi, hücre morfolojisindeki değişiklikleri doğrudan inceleyerek bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için son derece verimli ve hızlı bir yöntem olarak öne çıkıyor. Yine de, hedef proteinin diğer hücre iskeleti kompleksleri ile hetero-ilişkisi, hedef dışı bağlanma ve zar potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanan dolaylı etkiler, hücreye verimli bir şekilde nüfuz etmedeki zorluk ve özellikle Gram-negatif bakterilerde akış pompalarının varlığı, bakteriyel hücre deformasyonunun kesin nedenini belirlemek için toplu olarak karmaşık hale getirir 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe veya yaygın olarak bilinen adıyla fisyon mayası, çubuk şeklinde tek hücreli ökaryotik bir organizmadır. Fisyon mayası, hücre döngüsü ve bölünmesi, hücresel organizasyon ve insanlar da dahil olmak üzere daha yüksek ökaryotlarla kromozom replikasyonu gibi hücresel süreçlerdeki olağanüstü koruma nedeniyle hücresel ve moleküler biyolojide model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır11,12. Ayrıca, Errington ve meslektaşları, DivIVA'nın negatif kavisli yüzeylerde biriktiğini göstermek için fisyon mayasında kutup lokalize bir bakteriyel hücre iskeleti proteini DivIVA'yı ifade ettiler13. Yine Balasubramanian ve grubu, MreB14 ve tubulin homologu FtsZ15 gibi E. coli aktin hücre iskeleti proteininin mekanizması, montajı ve dinamiği hakkında yeni bilgiler getirmek için hücresel bir model sistem olarak fisyon mayasını ilk kez kurmuştu. Ayrıca, A22'nin, maya14'te eksprese edildiğinde epifloresan mikroskobu yoluyla MreB'nin polimerizasyonunu verimli bir şekilde engelleme yeteneğini de gösterirler. Bunu takiben, diğer gruplar da kloroplast FtsZ1 ve FtsZ2 proteinlerinin16 montaj özelliklerini incelemek için fisyon mayasını başarıyla kullandılar. Daha yakın zamanlarda, bilinen üç FtsZ inhibitörünün-sanguinarin, berberin ve PC190723 FtsZ proteinlerinin etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini yaparak, bakteriyel hücre iskeleti inhibitörlerini spesifik olarak taramak için hücresel bir platform olarak fisyon mayasının kullanımının uygulanabilirliğine dair bir kavram kanıtı oluşturduk . Ek olarak, bu tek adımlı hücre bazlı tahlil, ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek bileşikleri tanımlama riskini en aza indirmede etkili olduğunu kanıtlamaktadır.
Bu raporda, fisyon mayası sistemini kullanarak, Staphylococcus aureus'tan FtsZ'yi ve Escherichia coli'den MreB'yi hedefleyen küçük molekül inhibitörlerinin etkisinin yarı otomatik taraması ve nicelleştirilmesi için standart 96 oyuklu plakayı kullanarak sistematik bir iş akışı öneriyoruz. Burada, özellikle FtsZ ve MreB'yi hedefleyen yerleşik inhibitörler PC190723 ve A22'yi kullanarak yarı otomatik iş akışını kuruyor ve optimize ediyoruz. Bu iş akışı, mevcut standardizasyonu iyileştirmek için motorlu yüksek hassasiyetli bir aşama ve standart 96 oyuklu bir plakada otomatik görüntü toplama ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanır. Bu nedenle, sentetik kimyasal kütüphanelerin orta ve yüksek verimli ekranlarına uygulanabilir ve yukarıda listelenen zorlukların bazılarını aşar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>160376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>&#160;CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A22 Hydrochloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>SML0471</td>
			<td>Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0229</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C5275-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PMD0210</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion&#174; 96 with 2-position slider</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5069000101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0144</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>German company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0157</td>
			<td>225 mg/L of media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>517992-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>344580</td>
			<td>Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>202398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td>Filter sterilised</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydrochloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>194855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>DOC0214</td>
			<td>225 mg/L of media, Store solution at 36&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YES (Yeast extract + supplements) Agar</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PCM0410</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YES (Yeast extract + supplements) Broth</td>
			<td>FormediumTM</td>
			<td>PCM0310</td>
			<td>See below for composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast (S. pombe) media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract + supplements (YES)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
			<td>g/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dextrose</td>
			<td>30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Agar</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adenine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-Lysine HCl</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Uracil</td>
			<td>0.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edinburg minimal medium (EMM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
			<td>g/L</td>
			<td>concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>potassium hydrogen phthallate&#160;</td>
			<td>3</td>
			<td>14.7mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4&#160;</td>
			<td>2.2</td>
			<td>15.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>5</td>
			<td>93.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>glucose</td>
			<td>2% (w/v) or 20 g/L</td>
			<td>&#160;111 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Salts (stock x 50)</td>
			<td>20 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Vitamins (stock x 1000)</td>
			<td>1 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Minerals (Stock x 10,000)</td>
			<td>0.1 mL/L (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salts x 50&#160;</td>
			<td>52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)&#160;</td>
			<td>52.5</td>
			<td>0.26 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)&#160;</td>
			<td>0.000735</td>
			<td>4.99 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 g/l KCl (0.67 M)&#160;</td>
			<td>50</td>
			<td>0.67 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 g/l Na2SO4 (14.l mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>14.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins x 1000&#160;</td>
			<td>1 g/l pantothenic acid&#160;</td>
			<td>1</td>
			<td>4.20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 g/l nicotinic acid&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>81.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 g/l inositol&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>55.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10 mg/l biotin&#160;</td>
			<td>0.01</td>
			<td>40.8 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minerals x 10,000&#160;</td>
			<td>boric acid</td>
			<td>5</td>
			<td>80.9 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MnSO4&#160;&#160;</td>
			<td>4</td>
			<td>23.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>4</td>
			<td>13.9 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>FeCl2.6H2O&#160;&#160;</td>
			<td>2</td>
			<td>7.40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>molybdic acid&#160;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>2.47 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>KI&#160;</td>
			<td>1</td>
			<td>6.02 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CuSO4.5H2O&#160;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>1.60 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>citric acid&#160;</td>
			<td>10</td>
			<td>47.6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains/ Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td>Description</td>
			<td>Reference</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD190</td>
			<td>Escherichia coli DH10&#946;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY4&#160;</td>
			<td>MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB</td>
			<td>Srinivasan et al., 2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY340</td>
			<td>CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP</td>
			<td>Sharma et al., 2023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCDY346</td>
			<td>MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]</td>
			<td>Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCCD3</td>
			<td>pREP42-GFP-EcMreB</td>
			<td>Srinivasan et al., 2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCCD713</td>
			<td>pREP42-SaFtsZ-GFP</td>
			<td>Sharma et al., 2023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fission yeast as a platform for antibacterial drug screens targeting bacterial cytoskeleton proteins

FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinleri, hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunması gibi temel işlevleri yerine getirir. Ayrıca, FtsZ ve MreB, yeni antimikrobiyal keşifler için önemli hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Bu hücre iskeleti proteinlerinin nükleotid bağlanmasını ve polimerizasyonunu hedefleyen bileşikleri tanımlamak için, esas olarak FtsZ'ye odaklanan çeşitli testler geliştirilmiştir. Dahası, tahlillerin çoğu ya zahmetli ya da maliyet yoğundur ve bu proteinlerin ilacın hücresel hedefi olup olmadığını belirlemek genellikle birden fazla yöntem gerektirir. Son olarak, ilaçların ökaryotik hücrelere toksisitesi de bir sorun teşkil etmektedir. Burada, bakteri hücre iskeletini hedef alan yeni molekülleri keşfetmek ve ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek isabetleri en aza indirmek için tek adımlı hücre bazlı bir tahlili açıklıyoruz. Fisyon mayası, mikroskopiye dayalı yüksek verimli ekranlara uygundur ve görsel bir ekran, FtsZ veya MreB'nin polimerizasyonunu değiştiren herhangi bir molekülü kolayca tanımlayabilir. Testimiz standart 96 oyuklu plakayı kullanır ve bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin fisyon mayası gibi ökaryotik bir hücrede polimerize olma yeteneğine dayanır. Burada tarif edilen protokoller fisyon mayası için olsa da ve Staphylococcus aureus'tan FtsZ ve Escherichia coli'den MreB'yi kullanırken, herhangi bir ökaryotik ekspresyon konakçısında polimerlere kolayca birleşen diğer bakteriyel hücre iskeleti proteinlerine kolayca uyarlanabilirler. Burada açıklanan yöntem, bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan yeni antimikrobiyallerin daha fazla keşfedilmesini kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.

The widespread resistance to nearly all antibiotics presently employed to combat bacterial infections has created an immediate necessity for novel categories of antibiotics. A 2019 report indicated that antibiotic-resistant infections resulted in the loss of 1.27 million lives, contributing to an overall tally of 4.95 million deaths when considering complications from resistant bacterial infections1. While still effective in clinical practice, the current arsenal of antibiotics predominantly targets a narrow spectrum of cellular processes, primarily focusing on cell wall, DNA, and protein synthesis. Over the past half-century, fewer than 30 proteins have been commercially exploited as targets for the development of new anti-bacterials2,3. This limited range of viable targets significantly creates constraints to discovering new antibiotics or their derivatives for combating antibiotic-resistant bacteria. Thus, to overcome the emerging antibiotic resistance problem, there is a need for the development of new antibiotics with novel targets and mechanisms of action.
An antibacterial target should ideally be an essential component of bacterial cell growth, be conserved throughout the phylogenetically diverse species, show least eukaryotic homology, and be accessible to antibiotics4. Since the discovery of bacterial cytoskeletal proteins involved in cell division and cell shape maintenance, they have emerged as a promising focal point for developing antibacterial compounds5. These proteins are essential for bacterial viability and play a pivotal role in maintaining cell shape (MreB, CreS), division (FtsZ, FtsA), and DNA segregation (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), akin to the cytoskeleton in eukaryotic cells. Notably, FtsZ exhibits a remarkably high level of conservation across a wide range of prokaryotic organisms, while MreB is found in nearly all rod-shaped bacteria. Such wide distribution and relevance in cell viability make these proteins a fascinating target in antibiotic research5,6,7.
It is crucial to adopt a multi-pronged approach that combines in vivo observations, in vitro interactions, and enzymatic experiments to thoroughly validate bacterial cytoskeleton proteins as the primary target of a potential inhibitor7. Laborious procedures or substantial cost implications encumber many available assays for this purpose. These are notable obstacles to their widespread utilization in screening lead compounds that could impact the bacterial cytoskeleton. Among these, microscopy stands out as an exceptionally efficient and rapid method for assessing the effectiveness of compounds by directly examining changes in cell morphology. Yet, the hetero-association of target protein with other cytoskeleton complexes, indirect effects due to off-target binding and changes in membrane potential, difficulty in penetrating the cell efficiently, and presence of efflux pumps, especially in Gram-negative bacteria, make it collectively complex to pinpoint the precise cause of bacterial cell deformation8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe, or fission yeast as it&#39;s commonly known, is a rod-shaped unicellular eukaryotic organism. Fission yeast is widely used as a model organism in cellular and molecular biology due to the extraordinary conservation in cellular processes such as the cell cycle and division, cellular organization, and chromosome replication with higher eukaryotes, including humans11,12. Furthermore, Errington and colleagues expressed a pole-localized bacterial cytoskeletal protein DivIVA in fission yeast to demonstrate that DivIVA accumulated on negatively curved surfaces13. Again, Balasubramanian and group had first established fission yeast as a cellular model system to bring new insights into the mechanism, assembly, and dynamicity of the E. coli actin cytoskeleton protein like MreB14 and tubulin homolog FtsZ15. They also demonstrate the ability of A22 to efficiently impede the polymerization of MreB through epifluorescence microscopy when expressed in yeast14. Following this, other groups have also successfully employed fission yeast to study the assembly properties of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 proteins16. More recently, we have established a proof-of-concept of the viability of the use of fission yeast as a cellular platform to specifically screen for bacterial cytoskeleton inhibitors by conducting a comprehensive assessment of the impact of three known FtsZ inhibitors-sanguinarine, berberine, and PC190723-on FtsZ proteins derived from two pathogenic bacteria, namely Staphylococcus aureus and Helicobacter pylori17. Additionally, this single-step cell-based assay proves instrumental in minimizing the risk of identifying compounds that may be potentially toxic to eukaryotic cells.
In this report, utilizing the fission yeast system, we propose a systematic workflow using the standard 96-well plate for semi-automated screening and quantification of the effect of small molecule inhibitors targeting FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli. Here, we set up and optimize the semi-automated workflow using the established inhibitors PC190723 and A22 that specifically target FtsZ and MreB, respectively. This workflow uses an epifluorescence microscope equipped with a motorized high-precision stage and automated image acquisition in a standard 96-well plate to improve upon current standardization. Hence, it can be applied to medium- as well as high-throughput screens of synthetic chemical libraries and circumvents some of the challenges listed above.

Yazar Gündemi: Yenilikçi Hücre Bazlı Tahliller Yoluyla Yeni Antibiyotikleri Ortaya Çıkarmak için Hücre İskeleti Dinamiklerini Keşfetmek

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Our laboratory is interested in understanding how cytoskeletal proteins assemble dynamic structures to regulate functions such as DNA partitioning and cell division in bacteria. We are also interested in discovering compounds that target these cytoskeletal proteins to develop novel antibiotics. Our protocol is a cell-based assay in which the bacterial cytoskeleton protein polymerizes in a molecularly crowded environment in the eukaryotic yeast, Schizosaccharomyces pombe.With this approach, simultaneously, we can identify molecules that directly affects the bacterial cytoskeleton proteins, polymerization, and are potentially toxic. Using this fission yeast platform, we plan to screen libraries of macrocyclic compounds, specifically targeting FtsZ of pathogenic bacteria like Helicobacter pylori and Pseudomonas aeruginosa. We also plan to expand the screens to target actin-like proteins from Clostridium perfringens involved in plasmid segregation.

İlaçların taranması için 96 oyuklu plakanın kurulması Orta kuvvetli tiamin bastırılabilir promotör nmt41içeren bir vektörden (pREP42) S. aureus FtsZ etiketli bir C-terminal GFP'yi ifade etmek için S. pombe'nin kullanımı daha önce kurulmuştur17 ve benzer şekilde, N-terminal GFP ile etiketlenmiş E. coli MreB de S. pombe14'te ifade edilmiştir. Ayrıca, SaFtsZ'nin spesifik bir inhibitörü olan...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Unveil Novel Antibiotics Through Innovative Cell-Based Assays at JoVE.com

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...

Laboratuvarımız, hücre iskeleti proteinlerinin bakterilerde DNA bölünmesi ve hücre bölünmesi gibi işlevleri düzenlemek için dinamik yapıları nasıl bir araya getirdiğini anlamakla ilgilenmektedir. Ayrıca, yeni antibiyotikler geliştirmek için bu hücre iskeleti proteinlerini hedef alan bileşikleri keşfetmekle de ilgileniyoruz. Protokolümüz, bakteriyel hücre iskeleti proteininin ökaryotik maya Schizosaccharomyces pombe'de moleküler olarak kalabalık bir ortamda polimerize olduğu hücre bazlı bir testtir.Bu yaklaşımla, eş zamanlı olarak, bakteri hücre iskeleti proteinlerini, polimerizasyonu doğrudan etkileyen ve potansiyel olarak toksik olan molekülleri tanımlayabiliriz. Bu fisyon mayası platformunu kullanarak, özellikle Helicobacter pylori ve Pseudomonas aeruginosa gibi patojenik bakterilerin FtsZ'sini hedefleyen makrosiklik bileşiklerin kütüphanelerini taramayı planlıyoruz. Ayrıca, plazmit ayrışmasında yer alan Clostridium perfringens'ten aktin benzeri proteinleri hedeflemek için ekranları genişletmeyi planlıyoruz.

fission-yeast-as-platform-for-antibacterial-drug-screens-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.

Biyoloji

Targeting GFP-Tagged Bacterial Cytoskeletal Proteins Expressed in Schizosaccharomyces pombe and Microscopic Imaging of the Polymers

Schizosaccharomyces pombe'de İfade Edilen GFP Etiketli Bakteriyel Hücre İskeleti Proteinlerinin Hedeflenmesi ve Polimerlerin Mikroskobik Görüntülenmesi