עבודה זו נתמכה על ידי מענקי קרן המחקר המיוחדת (BOF) של אוניברסיטת גנט (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), קרן המחקר פלנדריה (FWO, I001922N) והאיחוד האירופי, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN מס '101073507.

1. דור של ספרואידים רב תאיים
<ol><li>תרבית תאים הערה: ניתן לאסוף תרביות תאים מאוסף תרביות הסוג האמריקאי (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich או ספקים אחרים. ATCC מספק את כל מידע הטיפול הנדרש, כולל מדיית גידול מועדפת, נהלי תת-תרבות, רמת בטיחות ביולוגית, קצב צמיחה ופרופילי STR. כאן, 500 תאים/ספרואיד של קו תאי סרט?...

היווצרות ספרואידים רב-תאיים לניתוח מטבולי והיפוקסיה מבוסס FLIM

אין מה לחשוף.

ספרואידים רב-תאיים הופכים לשיטת בחירה במחקרים של מיקרו-סביבות נישה של גידולים ותאי גזע, גילוי תרופות ופיתוח "אבני הבניין של הרקמות" לייצור ביולוגי. הארכיטקטורה הפנימית ההטרוגנית של הספרואידים, שיפועים של חומרים מזינים וחמצון יכולים לחקות את אלה של רקמות in vivo וגידולים בסביבה פשוטה ונ?...

ספרואידים רב-תאיים מייצגים קבוצה של מודלים תלת-ממדיים של רקמות המתקבלות על ידי צבירה עצמית של תאים ומציגים צורה כדורית. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות אינטראקציה בין תאים ומטריצות תאים במבחנה ולשחזר הקשר תלת-ממדי בתוך מספר רב של מבנים שמקורם בסרטן ובתאי גזע. מספר טכניקות משמשות כדי להפחית את התקשרות התא ולקדם את הצבירה. אלה כוללים את שיטת התלייה-טיפה המסתמכת על מתח פני השטח1; שיטות דוחות התקשרות תאים כגון לוחות התקשרות נמוכים במיוחד, תבניות מיקרו ומיקרו-בארות 2,3; גישה מבוססת גלים אקוסטיים4; שיטות צבירה המושרות על ידי זרימה (צלוחיות ספינר, ביוריאקטור והתקנים מיקרופלואידים)5; היווצרות בעזרת חלקיקים מגנטיים6 ושימוש במטריצות ופיגומים סינתטיים ומבוססי ECM המקדמים צבירה 7,8,9.
במחקר, פיתוח ותיקוף של טיפולים תרופתיים חדשים, ספרואידים הם מודל אטרקטיבי בשל יכולתם לשחזר את השיפועים המוגבלים בדיפוזיה מרחבית של חומרים מזינים, תוצרי פסולת ו-O2, מה שמוביל לעתים קרובות להיווצרות ליבה נמקית, האופיינית לגידולים מוצקים10,11. מודלים מבינים אמינים ומתוחכמים יותר אלה מאתגרים את הצורך בשימוש נרחב במודלים של בעלי חיים (חוק המודרניזציה של מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) 2.012), על פי עקרון 3Rs של מחקר בבעלי חיים (החלפה, הפחתה ועידון). בנוסף לסרטן, ספרואידים מוצאים את יישומם במחקר תאי גזע. לדוגמה, לתאי גזע פלוריפוטנטיים יש את היכולת ליצור גופים עובריים (EB), אשר יכולים לשמש להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) לעבר סוגי תאים מיוחדים שמאתגרים להשיג ישירות ממטופלות, כגון תאים מקדימים עצביים13 או תאי גרנולוזה בשחלות 13,14. יתר על כן, היווצרות EB היא לעתים קרובות הצעד הראשון בפיתוח מודלים אורגנואידים מורכבים יותר, למשל, עצבי15, רשתית16, לב17, כבד18, קיבה19, ואורגנואידים במעיים20. יש לקחת בחשבון גורמים הכוללים גודל, יכולת שחזור, תפוקה ויישומים במורד הזרם בעת בחירת שיטת היווצרות ספרואידים מתאימה לניסויים.
המורכבות המוגברת של תרבות תלת-ממדית יכולה להוביל לשונות גבוהה יותר בהשוואה לתרבות דו-ממדית. גורמים כגון הרכב תזונתי21, אידוי מדיה22, צמיגות23, בקרת pH24, שיטת היווצרות ספרואידים, ואפילו הזמן בתרבית25,26 יכולים לגרום לקבלת ספרואידים בעלי מורפולוגיה משתנה, גדלים, כדאיות ועמידות כימותרפית שונה27,28. מחקרים אחרונים הראו כי שיפועי חמצן ספרואידים אינם תמיד סטטיים ומושפעים משיטת היווצרות, גודל הספרואיד וצמיגות חוץ-תאית, המשפיעים על ההטרוגניות הספרואידית29. כדי לשפר את יכולת השחזור ונגישות הנתונים על ספרואידים, בסיס הידע MISpheroID פותח26, המזהה קו תאים, מדיום תרבית, שיטת היווצרות וגודל ספרואידים כמידע המינימלי לתוצאה הניתנת לשחזור. לכן, נעשתה השוואה מפורטת של מספר רב של תפוקות גבוהות (SphericalPlate 5D, מיקרותבניות מיוצרות במעבדה ותבניות מיקרו-רקמות) ושיטות חיבור נמוכות (כלומר, לוחות 96 בארות מצופות Biofloat וליפדור, שניהם נטולי פיגומים ומבוססי פיגומים) (איור 1 וטבלה 1), כולל גודל הבאר (בהינתן הערכה של גודל הספרואיד המרבי), חומרים מתכלים בשימוש, זמן הכנה והאפשרות לנטר ספרואידים מבלי להעבירם לצלחות מיקרוסקופיה. האחרון מאפשר מחקרים ארוכי טווח, בעוד ספרואידים המיוצרים בשיטות תפוקה גבוהה מביאים לעתים קרובות לניסויים בנקודות קצה. כל השיטות למעט הרשתות של 5DspheriPlate אינן מביאות אוטופלואורסצנטיות לא רצויות, ובכך מאפשרות שימוש ישיר בהן במיקרוסקופיה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> איור 1: שיטות היווצרות ספרואידים מוסברות. שיטות בעלות תפוקה גבוהה כגון SphericalPlate 5D, אשר שילבה מיקרו-בארות מוגנות בפטנט בצלחת, בעוד שהמיקרו-תבניות המיוצרות במעבדה ותבניות MicroTissue משתמשות בבולים כדי ליצור מיקרו-בארות מרובות באגרוז (כחול). לוחות בעלי חיבור נמוך כגון Lipidure (Amsbio) ו- Biofloat (Sarstedt) משתמשים בציפוי לא נדבק המעכב היצמדות לפני השטח של התא ומקדם צבירה עצמית של תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>מיקרותבניות בייצור עצמי</td>
			<td>מיקרו-רקמה</td>
			<td>שיטות התקשרות נמוכות</td>
		</tr><tr><td>מספר ספרואידים/באר</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>קוטר באר</td>
			<td>90 מיקרומטר</td>
			<td>400 מיקרומטר</td>
			<td>800 מיקרומטר</td>
			<td>1 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>נפח תרבות</td>
			<td>1 מ"ל</td>
			<td>5 מ"ל</td>
			<td>1 מ"ל</td>
			<td>200 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>חומרים מתכלים אחרים</td>
			<td>/</td>
			<td>7 מ"ל של 3% agarose</td>
			<td>500 μL של 2% agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>זמן הכנה</td>
			<td>10 דק'</td>
			<td>שעתיים + 3 ימים עיבוד מדיה</td>
			<td>0.5 שעות + 15 דקות עיבוד מדיה</td>
			<td>10-30 דקות + שעה ייבוש</td>
		</tr><tr><td>ניטור</td>
			<td>כן</td>
			<td>לא**</td>
			<td>כן</td>
			<td>כן</td>
		</tr><tr><td>אוטופלואורסצנט</td>
			<td>כן</td>
			<td>לא</td>
			<td>לא</td>
			<td>לא</td>
		</tr><tr><td>לשימוש חוזר</td>
			<td>לא</td>
			<td>כן</td>
			<td>כן</td>
			<td>לא**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">עלות</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: ציפוי ומטריג'ל</td>
		</tr><tr><td>€€: צלחת מסחרית 96 בארות</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*קווי תאים מסוימים זקוקים לתוספת של ECM (כלומר 2%-5% מטריג'ל) כדי ליצור ספרואידים קומפקטיים.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**הציפוי ניתן לשימוש חוזר עד להתרוקנות. עם זאת, כל צלחת תצרוך כמות קטנה של מדיה ואבק יכול להצטבר עם הזמן. יש צורך בעיקור מסננים באופן קבוע.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: השוואה בין שיטות היווצרות ספרואידים מרובים29. "ניטור": היכולת לפקח על ספרואיד ללא צורך בהעברה לצלחת מיקרוסקופיה. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€: 150-500€ , €€€: >500€
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר ניטור ישיר של ההיבטים הביולוגיים המרכזיים בתוך הספרואידים, כולל מוות תאי, כדאיות, התפשטות, חילוף חומרים, צמיגות ואפילו תכונות מכניות30. מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM) מספק ממד כמותי נוסף לחקר אינטראקציות של גשושיות פלואורסצנטיות בתוך סביבתן (מיקרו) 31,32,33,34, ומאפשר לפתור את ספקטרום הפליטה החופף על פי זמני חיי פליטה שונים 35,36 וחקירת חילוף החומרים בתאים בהתבסס על אוטופלואורסצנטיות תאית פנימית. לפיכך, תרכובות אוטופלואורסצנטיות תאיות נפוצות כגון ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד פוספט (NAD(P)H), פלבין מונונוקלאוטיד (FMN), פלבין אדנין דינוקלאוטיד (FAD), פרוטופורפירין IX ואחרים ניתנים למדידה באמצעות FLIM של פוטון אחד או שניים ומשמשים כ"חיישנים" פנימיים של קטבוליזם גלוקוז, זרחן חמצוני (OxPhos) ומספקים סקירה כללית של מצב חמצון-חיזור התא. NAD(P)H קיים בציטופלזמה חופשית, או במיטוכונדריה37,38 הקשורות לחלבון. באופן דומה, המצב המחומצן של FAD הוא פלואורסצנטי עם אורך חיים ארוך יותר של הצורה החופשית. מיקרוסקופיות NAD(P)H ו-FAD כוללות בדרך כלל FLIM מעורר של שני פוטונים, במטרה למנוע נזק לאור מדגם39. לעתים קרובות, ניתן לשלב FLIM 'הדמיה מטבולית אופטית' עם שימוש בבדיקות מבוססות צבע, ביו-חיישנים מקודדים גנטית, מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של זרחן (PLIM), ומדידות מבוססות עוצמה רציומטרית על מנת לספק תמונה מלאה יותר של חילוף חומרים ספרואידי או אורגנואידים, חמצון, שגשוג וכדאיות התא 29,30,31. בנוסף, FLIM יכול גם להיות משולב עם שיטת Förster resonance energy transfer (FRET) כדי למדוד את השונות לאורך החיים של פלואורופור התורם כאשר הוא נמצא בקשר הדוק עם המקבל כדי לחקור את הקישור של תרופה עם תחום היעד שלה 33,40,41.
תמונות FLIM שנרכשו מנותחות בדרך כלל כדי לחשב את אורך החיים פיקסל אחר פיקסל. נכון לעכשיו, ישנן לפחות 3 אסטרטגיות נפוצות המשמשות להשגת אורך חיים פלואורסצנטי: 'FLIM מהיר' 42 כמותי למחצה (המכונה לעתים 'חוש טאו'43,44), התאמת עקומת דעיכה, באמצעות התאמה מעריכית אחת, שתיים או שלוש, וגישה 'ללא התאמה' עם טרנספורמציית פאזור וניתוח תרשים פאזור. בהתאם לספק, ניתן להשתמש בתוכנה המסופקת (LAS X, Symphotime, SPCImage וכו') או בתוכנת קוד פתוח (למשל, FLIMfit45, FLIMJ46 או אחרים47) לטיפול בנתוני FLIM שנמדדו. בדרך כלל, תוכנה המסופקת על ידי ספק שימושית לניתוח נתונים ראשוני, בעוד שפתרונות קוד פתוח יכולים לספק מחקרים מדויקים יותר באמצעות, למשל, תרשימי phasor והדמיה תלת-ממדית.
למרות התועלת והאטרקטיביות של FLIM כשיטה לחקר ספרואידים, מעט מאוד פרוטוקולים ניסיוניים זמינים, וקיים חוסר ידע כללי בבחירת שיטת ההיווצרות המתאימה ביותר לניסויים מוצלחים במיקרוסקופ רב-פרמטרי חי הכוללים FLIM. כאן, מוצגת השוואה מפורטת של פרוטוקולי היווצרות ספרואידים נפוצים בהתבסס על המורפולוגיה, הכדאיות והחמצון שלהם עם ננו-חיישן חישת חמצן (MMIR1) שאומת לאחרונה ואופיין לאחרונה באדום רחוק וקרוב לאינפרא אדום (NIR). הננו-חלקיק הקטיוני ספוג בשני צבעי כתב, הייחוס O2-insensitive aza-BODIPY (עירור 650 ננומטר, פליטה 675 ננומטר) ו-NIR O2-sensitive metalloporphyrin, PtTPTBPF (עירור 620 ננומטר, פליטה 760 ננומטר). MMIR1 מאפשר ניתוח בזמן אמת של שיפועי חמצן במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי (באמצעות ניתוח יחסימטרי) או במיקרוסקופ חיי זרחן (PLIM) מבלי להציג רעילות תאית ומאפשר אותות יציבים, ניטור לטווח ארוך וריבוב25,29. בהתאם לצורך להכתים באמצעות צבעים או ננו-חיישנים, תפוקת ספרואידים או סוג התא, ניתן לבחור את פרוטוקול ההיווצרות המתאים ביותר. מכיוון שמחקרי הכדאיות והחמצון של ספרואידים רלוונטיים למחקרים של סרטן וספרואידים שמקורם בתאי גזע, הפרוטוקולים המוצגים כוללים גם דוגמאות ותוצאות אופייניות צפויות של NAD(P)H-FLIM ו- FAD-FLIM עם מודלים אלה. צינורות ההדמיה והניתוח המוצגים מכוונים לפלטפורמות המיקרוסקופ הפופולריות ביותר מבוססות ספירת פוטונים בודדים מבוססות ספירת פוטונים בזמן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Also available from Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-3700</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665-180</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Chamber slide, removable</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81201</td>
			<td>Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nerbe plus</td>
			<td>02-502-3001</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Petri Dish micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Z764000-6EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL02.0537.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biofloat</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3925.400</td>
			<td>Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Green-AM</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>AS-89201</td>
			<td>Apply in dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>version 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta, type IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal FLIM Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td>Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030-10X1L</td>
			<td>For preparation of imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;(FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td>Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colon cancer cells HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>version 4.6.1.27508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure-CM5206</td>
			<td>Amsbio</td>
			<td>AMS.52000034GB1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>392-0420</td>
			<td>Standard growth medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-patterned 3D-printed PDMS stamps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chemlab</td>
			<td>CL00.1429.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer couting chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15980396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 probes: MMIR1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 
			v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>Gibco18912014</td>
			<td>Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 &#956;g/mL) 100x solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5mg</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>Cell death staining, use 1 &#181;g/mL at 1h incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A35149</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphericalPlate 5D 24-well</td>
			<td>Kugelmeiers</td>
			<td>SP5D-24W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile petridish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>633181</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (25 cm&#178; )</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2311</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (75 cm&#178;)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Agarose</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and multi-parameter live cell fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) of multicellular spheroids

ספרואידים סרטניים רב-תאיים הם מודל מיקרו-אגרגטים תלת-ממדי פופולרי לשחזור מיקרו-סביבה של גידולים, בדיקה ואופטימיזציה של טיפולים תרופתיים ושימוש בביו-חיישנים וננו-חיישנים בהקשר תלת-ממדי. קלות הייצור שלהם, גודלם הצפוי, הצמיחה ושיפועי החומרים המזינים והמטבוליטים שנצפו חשובים כדי לשחזר את המיקרו-סביבה התאית דמוית הנישה התלת-ממדית. עם זאת, הטרוגניות ספרואידית ושונות של שיטות הייצור שלהם יכולות להשפיע על חילוף החומרים הכולל בתאים, על הכדאיות ועל התגובה לתרופות. זה מקשה על בחירת המתודולוגיה המתאימה ביותר, בהתחשב בדרישות בגודל, שונות, צרכים של ייצור ביולוגי, ושימוש כמו מודלים תלת ממדיים של רקמות במבחנה בביולוגיה של תאי גזע וסרטן. בפרט, ייצור ספרואידים יכול להשפיע על התאמתם למיקרוסקופיות חיות כמותיות, כגון דימות מטבולי אופטי, מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM), ניטור היפוקסיה ספרואידית באמצעות ננו-חיישנים, או כדאיות. כאן מוצגים מספר פרוטוקולים קונבנציונליים להיווצרות ספרואידים, המדגישים את התאמתם למיקרוסקופים חיים של שדה רחב, קונפוקלי ושני פוטונים. הדמיית המעקב לצנרת הניתוח עם FLIM אוטופלואורסצנטי מרובה, ותוך שימוש בסוגים שונים של סרטן וכדורי תאי גזע, מוצגת גם כן.

Multicellular spheroids represent a group of 3D tissue models obtained by the self-aggregation of cells and exhibiting a spherical shape. They are widely used to mimic cell-cell and cell-matrix interaction in vitro and to reproduce&#160;a 3D context within a multitude of cancer and stem cell-derived constructs. Several techniques are employed to reduce cell attachment and promote the aggregation. These include the hanging-drop method relying on the surface tension1; cell attachment repelling methods such as ultra-low attachment plates, micro-molds, and microwells2,3; acoustic wave-based approach4; flow-induced aggregation methods (spinner flasks, bioreactor, and microfluidic devices)5; magnetic particles-assisted formation6 and use of the aggregation-promoting synthetic and ECM-based matrices and scaffolds7,8,9.
In cancer research, development, and validation of new drug therapies, spheroids are an attractive model due to their ability to recapitulate the spatial diffusion-limited gradients of nutrients, waste products, and O2, often leading to the formation of a necrotic core, typical to the solid tumors10,11. These more reliable and sophisticated in vitro models challenge the need for extensive use of animal models (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), according to the 3Rs principle of animal research (replacement, reduction, and refinement). In addition to cancer, spheroids find their application in stem cell research. For instance, pluripotent stem cells have the capacity to form embryoid bodies (EB), which can be used for the differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) towards specialized cell types that are challenging to obtain directly from patients, such as neural precursor cells13 or ovarian granulosa cells13,14. Furthermore, the formation of an EB is often the first step in the development of more complex organoid models, e.g., neural15, retinal16, cardiac17, liver18, stomach19, and intestinal organoids20. Factors including size, reproducibility, throughput, and downstream applications should be considered when choosing an appropriate spheroid formation method for the experiments.
The increased complexity of 3D culture can lead to higher variability compared to 2D culture. Factors such as nutrient composition21, media evaporation22, viscosity23, pH control24, spheroid formation method, and even the time in the culture25,26 can result in obtaining spheroids of varying morphology, sizes, viability, and different chemoresistance27,28. Recent research demonstrated that spheroid oxygen gradients are not always static and are affected by the formation method, spheroid size, and extracellular viscosity, affecting the spheroid heterogeneity29. To improve reproducibility and data accessibility on spheroids, the MISpheroID knowledge base has been developed26, identifying cell line, culture medium, formation method, and spheroids size as the minimal information for a reproducible result. Therefore, a detailed comparison was made of multiple high-throughput (SphericalPlate 5D, lab-made micromolds, and Microtissue molds) and low attachment methods (i.e., Biofloat and Lipidure-coated 96-well plates, both scaffold-free and scaffold-based) (Figure 1 and Table 1), including the well size (given an estimation of the maximum spheroid size), consumables used, preparation time and the possibility of monitoring spheroids without transporting them to microscopy dishes. The latter enables long-term studies, whereas spheroids produced with high-throughput methods often result in endpoint experiments. All methods except for the grids of the 5DspheriPlate do not bring unwanted autofluorescence, hereby enabling their direct use in microscopy.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg" /> 
Figure 1: Spheroid formation methods explained. High-throughput methods such as the SphericalPlate 5D, which has integrated patented microwells in the plate, while the lab-produced micromolds and the MicroTissue molds use stamps to make multiple microwells in agarose (blue). Low-attachment plates such as Lipidure (Amsbio) and Biofloat (Sarstedt) use a non-adherent coating inhibiting cell-surface adhesion and promoting cell self-aggregation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Self-produced micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Low attachment methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number of spheroids/well&#160;</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diameter well</td>
			<td>90 &#181;m</td>
			<td>400 &#181;m</td>
			<td>800 &#181;m</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture volume</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other consumables</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL of 3% agarose</td>
			<td>500 &#181;L of 2% agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation time</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2 h + 3 days media adaptation</td>
			<td>0.5 h + 15 min media adaptation</td>
			<td>10&#8211;30 min + 1 h drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescent</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable</td>
			<td>No</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cost</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#160;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;</td>
			<td>&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: Coating and Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8364;&#8364;: Commercial 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Some cell lines need addition of&#160; ECM (i.e. 2%&#8211;5% Matrigel) to form compact spheroids.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">**The coating is reusable until depleted. However, each plate will consume a small amount of media and dust can accumulate over time. Filter sterilization is regularly needed.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Comparison of multiple spheroid formation methods29. &#34;Monitoring&#34;: the ability to monitor spheroid without the need for transfer to a microscopy dish. &#8364;: 0-50&#8364;, &#8364;&#8364;: 50-150&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;: 150-500&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: &#62;500&#8364;
Fluorescence microscopy enables direct monitoring of the key biological aspects within spheroids, including cell death, viability, proliferation, metabolism, viscosity, and even mechanical properties30. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) provides an additional quantitative dimension for studying fluorescent probe interactions within their (micro)environment31,32,33,34, allowing resolving the overlapping emission spectra according to different emission lifetimes35,36 and probing cell metabolism based on intrinsic cellular autofluorescence. Thus, such widespread cellular autofluorescent compounds as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), protoporphyrin IX, and others can be measured with one- and two-photon FLIM and serve as intrinsic &#39;sensors&#39; of glucose catabolism, oxidative phosphorylation (OxPhos) and provide a general overview of the cell redox state. NAD(P)H exists in free cytoplasmic, or in protein-bound mitochondrial forms37,38. Similarly, the oxidized state of FAD is fluorescent with a longer lifetime of the free form. NAD(P)H and FAD microscopies usually involve two-photon excited FLIM, aiming at preventing sample photodamage39. Frequently, &#39;optical metabolic imaging&#39; FLIM can be combined with the use of dye-based probes, genetically encoded biosensors, phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM), and ratiometric intensity-based measurements in order to provide a more complete picture of spheroid or organoid metabolism, oxygenation, proliferation and cell viability29,30,31. In addition, FLIM can also be combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) method to measure the lifetime variation of the donor fluorophore when in close contact with the acceptor to investigate the binding of a drug with its target domain33,40,41.
The acquired FLIM images are typically analyzed to calculate the lifetime pixel-by-pixel. Currently, there are at least 3 common strategies used to obtain fluorescence lifetime: semi-quantitative &#39;fast FLIM&#39;42 (sometimes referred to as &#39;tau sense&#39;43,44), decay curve fitting, using one-, two- or three-exponential fitting, and &#39;fitting-free&#39; approach with phasor transformation and phasor plot analysis. Depending on the vendor, either provided (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) or open-source software (e.g., FLIMfit45, FLIMJ46, or others47) can be used to handle measured FLIM data. Typically, vendor-provided software is useful for preliminary data analysis, while open-source solutions can provide for more accurate studies using, e.g., phasor plots and 3D visualization.
Despite the usefulness and attractiveness of FLIM as a method for studying spheroids, very few experimental protocols are available, and there is a general lack of knowledge in choosing the most appropriate formation method for successful live multiparametric microscopy experiments involving FLIM. Here, a detailed comparison of commonly used spheroid formation protocols is presented based on their morphology, viability, and oxygenation with the recently validated and characterized far-red and near-infra-red (NIR) oxygen-sensing nanosensor (MMIR1). The cationic nanoparticle is impregnated with two reporter dyes, the reference O2-insensitive aza-BODIPY (excitation 650 nm, emission 675 nm) and the NIR O2-sensitive metalloporphyrin, PtTPTBPF (excitation 620 nm, emission 760 nm). The MMIR1 enables real-time analysis of oxygen gradients on a conventional fluorescence microscope (using ratiometric analysis) or phosphorescence lifetime microscope (PLIM) without introducing cellular toxicity and allowing for stable signals, long-term monitoring, and multiplexing25,29. Depending on the need to stain with dyes or nanosensors, spheroid throughput, or cell type, the most appropriate formation protocol can be chosen. Since the studies of spheroids viability and oxygenation are relevant for studies of cancer and stem cell-derived spheroids, the presented protocols also include examples and expected typical results of NAD(P)H-FLIM and&#160;FAD-FLIM with these models. The presented imaging and analysis pipelines target the most popular time-correlated single photon counting-based FLIM microscopy platforms.

מחבר זרקור: סטנדרטיזציה של שיטות היווצרות כדוריד לניתוח מטבולי וחמצון באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

In this work, we present and compare spheroid formation methods that can be used for analysis of cell metabolism and oxygen distribution using live cell microscopy. In recent years, fluorescence lifetime imaging microscopy has been extensively used to investigate metabolic biomarkers like NADPH and FAD in live cells, and several fluorescent nanoparticles have been developed to multiplex such measurements with imaging of cell and tissue oxygenation. Multicellular spheroids, organoids, and organ-on-a-chip can replicate a complex, in-vivo-like microenvironment, minimizing the need in animal research.For spheroid production, we show different formation methods, can span from low to high throughput. They also highlight their optical accessibility, compatibility with fluorescence lifetime imaging microscope, and the possibility of including extracellular matrix components. So, even though 3D in vitro models provide better context in comparison to 2D cultures, their high variability, low reproducibility, and incomplete experimental reporting remain a problem.Parameters such as the spheroid size, the nutrient composition, the extracellular viscosity, and even spheroid formation methods can all lead to increased cellular heterogeneity. With this protocol, we aim to harmonize and standardize the spheroid production methods, highlighting key aspects important for life-continuous and multiparametric analysis of spheroids using FLIM microscopy.

בחירת שיטת היווצרות הספרואידים המתאימה שיטת היווצרות הספרואידים שנבחרה יכולה להשפיע מאוד על גודלם, צורתם, צפיפות התא, הכדאיות והרגישות של הספרואידים לתרופות (איור 2). בעבר, הושוו ההשפעות של מספר רב של תפוקות גבוהות (SphericalPlate 5D, מיקרו-תבניות מיוצרות במעבדה ותבניות ...

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

398 Views.  Ghent University. In this work, we present and compare spheroid formation methods that can be used for analysis of cell metabolism and oxygen distribution using live cell microscopy. In recent years, fluorescence lifetime imaging microscopy has been extensively used to investigate metabolic biomarkers like NADPH and FAD in live cells, and several fluorescent nanoparticles have been developed to multiplex such measurements with imaging of cell and tissue oxygenation. Multicellular spheroids, organoids, and orga...

Video: Author Spotlight: Standardizing Spheroid Formation Methods for Metabolic and Oxygenation Analysis Using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy