Name: Autore in primo piano: Standardizzazione dei metodi di formazione degli sferoidi per l'analisi metabolica e dell'ossigenazione mediante microscopia per imaging a fluorescenza
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00
Description: Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Fondo speciale per la ricerca (BOF) dell'Università di Gand (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fondazione per la ricerca delle Fiandre (FWO, I001922N) e l'Unione Europea, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n. 101073507.

1. Generazione di sferoidi multicellulari
<ol><li>Coltura cellulare NOTA: Le colture cellulari possono essere raccolte dall'American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich o altri fornitori. L'ATCC fornisce tutte le informazioni necessarie per la manipolazione, compresi i terreni di crescita preferiti, le procedure di subcoltura, il livello di biosicurezza, il tasso di crescita e i profili STR. Qui, 500 cellule/sferoide della linea cellulare di cancro del colon umano HCT116 viene utili...

Formazione di sferoidi multicellulari per analisi metaboliche e ipossia basate su FLIM

Gli sferoidi multicellulari stanno diventando un metodo di scelta negli studi di microambienti di nicchia di tumori e cellule staminali, nella scoperta di farmaci e nello sviluppo di "elementi costitutivi tissutali" per la biofabbricazione. L'architettura interna eterogenea degli sferoidi, i gradienti di nutrienti e l'ossigenazione possono imitare quelli dei tessuti e dei tumori in vivo in un ambiente relativamente semplificato e accessibile. Con la necessità di una maggiore trasparenza metodologica<sup class="...

Gli sferoidi multicellulari rappresentano un gruppo di modelli tissutali 3D ottenuti dall'autoaggregazione di cellule e che esibiscono una forma sferica. Sono ampiamente utilizzati per imitare l'interazione cellula-cellula e cellula-matrice in vitro e per riprodurre un contesto 3D all'interno di una moltitudine di costrutti derivati da cancro e cellule staminali. Diverse tecniche sono impiegate per ridurre l'attaccamento cellulare e promuovere l'aggregazione. Questi includono il metodo della goccia sospesa che si basa sulla tensione superficiale1; metodi di repulsione dell'attacco cellulare come piastre di attacco ultra-basse, microstampi e micropozzetti 2,3; approccio basato sulle onde acustiche4; metodi di aggregazione indotta dal flusso (palloni rotanti, bioreattori e dispositivi microfluidici)5; formazione assistita da particelle magnetiche6 e utilizzo di matrici e scaffold sintetici e basati su ECM che promuovono l'aggregazione 7,8,9.
Nella ricerca, nello sviluppo e nella validazione di nuove terapie farmacologiche sul cancro, gli sferoidi sono un modello attraente grazie alla loro capacità di ricapitolare i gradienti di nutrienti, prodotti di scarto e O2 limitati dalla diffusione spaziale, portando spesso alla formazione di un nucleo necrotico, tipico dei tumori solidi10,11. Questi modelli in vitro più affidabili e sofisticati sfidano la necessità di un uso estensivo di modelli animali (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), secondo il principio delle 3R della ricerca sugli animali (sostituzione, riduzione e perfezionamento). Oltre al cancro, gli sferoidi trovano la loro applicazione nella ricerca sulle cellule staminali. Ad esempio, le cellule staminali pluripotenti hanno la capacità di formare corpi embrioidi (EB), che possono essere utilizzati per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) verso tipi di cellule specializzate che sono difficili da ottenere direttamente dai pazienti, come le cellule precursori neurali13 o le cellule della granulosa ovarica 13,14. Inoltre, la formazione di un EB è spesso il primo passo nello sviluppo di modelli di organoidi più complessi, ad esempio neurale15, retinale16, cardiaco17, fegato18, stomaco19 e organoidi intestinali20. Fattori quali le dimensioni, la riproducibilità, la produttività e le applicazioni a valle dovrebbero essere considerati quando si sceglie un metodo di formazione di sferoidi appropriato per gli esperimenti.
L'aumento della complessità della cultura 3D può portare a una maggiore variabilità rispetto alla cultura 2D. Fattori come la composizione dei nutrienti21, l'evaporazione dei terreni22, la viscosità23, il controllo del pH24, il metodo di formazione degli sferoidi e persino il tempo trascorso nella coltura25,26 possono portare all'ottenimento di sferoidi di diversa morfologia, dimensioni, vitalità e diversa chemioresistenza27,28. Recenti ricerche hanno dimostrato che i gradienti di ossigeno sferoidale non sono sempre statici e sono influenzati dal metodo di formazione, dalle dimensioni degli sferoidi e dalla viscosità extracellulare, influenzando l'eterogeneità degli sferoidi29. Per migliorare la riproducibilità e l'accessibilità dei dati sugli sferoidi, è stata sviluppata la base di conoscenze MISpheroID26, identificando la linea cellulare, il terreno di coltura, il metodo di formazione e la dimensione degli sferoidi come informazioni minime per un risultato riproducibile. Pertanto, è stato effettuato un confronto dettagliato tra più metodi ad alta produttività (SphericalPlate 5D, microstampi realizzati in laboratorio e stampi per microtessuti) e a basso attaccamento (ad esempio, piastre a 96 pozzetti Biofloat e Lipidure-coated sia senza scaffold che basate su scaffold) (Figura 1 e Tabella 1), tra cui la dimensione del pozzetto (data una stima della dimensione massima dello sferoide), i materiali di consumo utilizzati, il tempo di preparazione e la possibilità di monitorare gli sferoidi senza trasportarli in piastre di microscopia. Quest'ultimo consente studi a lungo termine, mentre gli sferoidi prodotti con metodi ad alto rendimento spesso si traducono in esperimenti finali. Tutti i metodi, ad eccezione delle griglie della piastra 5DspheriLast, non apportano un'autofluorescenza indesiderata, consentendone così l'uso diretto in microscopia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Figura 1: Spiegazione dei metodi di formazione degli sferoidi. Metodi ad alta produttività come la SphericalPlate 5D, che ha integrato micropozzetti brevettati nella piastra, mentre i microstampi prodotti in laboratorio e gli stampi MicroTissue utilizzano timbri per realizzare più micropozzetti in agarosio (blu). Le placche a basso attaccamento come Lipidure (Amsbio) e Biofloat (Sarstedt) utilizzano un rivestimento non aderente che inibisce l'adesione cellula-superficie e promuove l'autoaggregazione cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Piastra SpheriPlate 5D</td>
			<td>Microstampi autoprodotti</td>
			<td>Microtessuto</td>
			<td>Metodi di fissaggio bassi</td>
		</tr><tr><td>Numero di sferoidi/pozzetto</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Diametro pozzetto</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 millimetro</td>
		</tr><tr><td>Volume di coltura</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr><tr><td>Altri materiali di consumo</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL di agarosio al 3%</td>
			<td>500 μl di agarosio al 2%</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Tempo di preparazione</td>
			<td>10 minuti</td>
			<td>2 ore + 3 giorni di adattamento dei media</td>
			<td>0,5 ore + 15 minuti di adattamento multimediale</td>
			<td>10-30 min + 1 ora di asciugatura</td>
		</tr><tr><td>Monitoraggio</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No**</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td>Autofluorescente</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td>Riutilizzabile</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Costo</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Rivestimento e Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Piastra commerciale a 96 pozzetti</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Alcune linee cellulari richiedono l'aggiunta di ECM (cioè 2%-5% di Matrigel) per formare sferoidi compatti.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**Il rivestimento è riutilizzabile fino all'esaurimento. Tuttavia, ogni lastra consumerà una piccola quantità di materiale e la polvere può accumularsi nel tempo. La sterilizzazione del filtro è regolarmente necessaria.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Confronto tra più metodi di formazione di sferoidi29. "Monitoraggio": la capacità di monitorare lo sferoide senza la necessità di trasferirlo su una capsula di microscopia. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: >500€
La microscopia a fluorescenza consente il monitoraggio diretto degli aspetti biologici chiave all'interno degli sferoidi, tra cui la morte cellulare, la vitalità, la proliferazione, il metabolismo, la viscosità e persino le proprietà meccaniche30. La microscopia a fluorescenza (FLIM) fornisce un'ulteriore dimensione quantitativa per lo studio delle interazioni delle sonde fluorescenti all'interno del loro (micro)ambiente 31,32,33,34, consentendo di risolvere gli spettri di emissione sovrapposti in base a diverse durate di emissione 35,36 e sondare il metabolismo cellulare basato sull'autofluorescenza cellulare intrinseca. Pertanto, composti autofluorescenti cellulari così diffusi come la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NAD(P)H), la flavina mononucleotide (FMN), la flavina adenina dinucleotide (FAD), la protoporfirina IX e altri possono essere misurati con FLIM a uno e due fotoni e fungere da "sensori" intrinseci del catabolismo del glucosio, della fosforilazione ossidativa (OxPhos) e fornire una panoramica generale dello stato redox cellulare. Il NAD(P)H esiste in forme citoplasmatiche libere o in forme mitocondriali legate a proteine37,38. Allo stesso modo, lo stato ossidato del FAD è fluorescente con una durata più lunga della forma libera. Le microscopie NAD(P)H e FAD di solito utilizzano FLIM eccitate a due fotoni, con l'obiettivo di prevenire il fotodanneggiamento del campione39. Spesso, l'imaging metabolico ottico FLIM può essere combinato con l'uso di sonde basate su coloranti, biosensori geneticamente codificati, microscopia per imaging a tempo di fosforescenza (PLIM) e misurazioni basate sull'intensità raziometrica al fine di fornire un quadro più completo del metabolismo, dell'ossigenazione, della proliferazione e della vitalità cellularedi sferoidi o organoidi 29,30,31 . Inoltre, FLIM può anche essere combinato con il metodo di trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per misurare la variazione del tempo di vita del fluoroforo donatore quando è a stretto contatto con l'accettore per studiare il legame di un farmaco con il suo dominio target 33,40,41.
Le immagini FLIM acquisite vengono in genere analizzate per calcolare la durata pixel per pixel. Attualmente, ci sono almeno 3 strategie comuni utilizzate per ottenere il tempo di vita della fluorescenza: "FLIM veloce" semiquantitativo (a volte indicato come "senso tau"43,44), adattamento della curva di decadimento, utilizzando l'adattamento a uno, due o tre esponenziali e approccio "senza adattamento" con trasformazione dei fasori e analisi del diagramma dei fasori. A seconda del fornitore, per gestire i dati FLIM misurati è possibile utilizzare il software fornito (LAS X, Symphotime, SPCImage, ecc.) o open source (ad esempio, FLIMfit45, FLIMJ46 o altri47). In genere, il software fornito dal fornitore è utile per l'analisi preliminare dei dati, mentre le soluzioni open source possono fornire studi più accurati utilizzando, ad esempio, grafici dei fasori e visualizzazione 3D.
Nonostante l'utilità e l'attrattiva di FLIM come metodo per lo studio degli sferoidi, sono disponibili pochissimi protocolli sperimentali e c'è una generale mancanza di conoscenza nella scelta del metodo di formazione più appropriato per il successo degli esperimenti di microscopia multiparametrica dal vivo che coinvolgono FLIM. Qui, viene presentato un confronto dettagliato dei protocolli di formazione di sferoidi comunemente usati in base alla loro morfologia, vitalità e ossigenazione con il nanosensore di rilevamento dell'ossigeno (MMIR1) recentemente convalidato e caratterizzato nel lontano rosso e nel vicino infrarosso (NIR). La nanoparticella cationica è impregnata con due coloranti reporter, l'aza insensibile al riferimento O 2-BODIPY (eccitazione 650 nm, emissione 675 nm) e la metalloporfirina NIR O2-sensibile, PtTPTBPF (eccitazione 620 nm, emissione 760 nm). L'MMIR1 consente l'analisi in tempo reale dei gradienti di ossigeno su un microscopio a fluorescenza convenzionale (utilizzando l'analisi raziometrica) o un microscopio a fosforescenza (PLIM) senza introdurre tossicità cellulare e consentendo segnali stabili, monitoraggio a lungo termine e multiplexing25,29. A seconda della necessità di colorare con coloranti o nanosensori, della produttività degli sferoidi o del tipo di cellula, è possibile scegliere il protocollo di formazione più appropriato. Poiché gli studi sulla vitalità e l'ossigenazione degli sferoidi sono rilevanti per gli studi sul cancro e sugli sferoidi derivati da cellule staminali, i protocolli presentati includono anche esempi e risultati tipici attesi di NAD(P)H-FLIM e FAD-FLIM con questi modelli. Le pipeline di imaging e analisi presentate si rivolgono alle più diffuse piattaforme di microscopia FLIM basate sul conteggio di singoli fotoni correlati nel tempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Also available from Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-3700</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665-180</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Chamber slide, removable</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81201</td>
			<td>Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nerbe plus</td>
			<td>02-502-3001</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Petri Dish micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Z764000-6EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL02.0537.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biofloat</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3925.400</td>
			<td>Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Green-AM</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>AS-89201</td>
			<td>Apply in dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>version 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta, type IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal FLIM Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td>Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030-10X1L</td>
			<td>For preparation of imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;(FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td>Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colon cancer cells HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>version 4.6.1.27508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure-CM5206</td>
			<td>Amsbio</td>
			<td>AMS.52000034GB1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>392-0420</td>
			<td>Standard growth medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-patterned 3D-printed PDMS stamps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chemlab</td>
			<td>CL00.1429.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer couting chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15980396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 probes: MMIR1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 
			v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>Gibco18912014</td>
			<td>Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 &#956;g/mL) 100x solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5mg</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>Cell death staining, use 1 &#181;g/mL at 1h incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A35149</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphericalPlate 5D 24-well</td>
			<td>Kugelmeiers</td>
			<td>SP5D-24W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile petridish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>633181</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (25 cm&#178; )</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2311</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (75 cm&#178;)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Agarose</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and multi-parameter live cell fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) of multicellular spheroids

Gli sferoidi tumorali multicellulari sono un popolare modello di microaggregato tissutale 3D per la riproduzione del microambiente tumorale, il test e l'ottimizzazione di terapie farmacologiche e l'utilizzo di biosensori e nanosensori in un contesto 3D. La loro facilità di produzione, le dimensioni prevedibili, la crescita e i gradienti di nutrienti e metaboliti osservati sono importanti per ricapitolare il microambiente cellulare di nicchia 3D. Tuttavia, l'eterogeneità degli sferoidi e la variabilità dei loro metodi di produzione possono influenzare il metabolismo cellulare complessivo, la vitalità e la risposta ai farmaci. Ciò rende difficile scegliere la metodologia più appropriata, considerando i requisiti di dimensioni, variabilità, esigenze di biofabbricazione e utilizzo come modelli di tessuto 3D in vitro nella biologia delle cellule staminali e tumorali. In particolare, la produzione di sferoidi può influenzare la loro compatibilità con microscopie quantitative dal vivo, come l'imaging metabolico ottico, la microscopia a fluorescenza (FLIM), il monitoraggio dell'ipossia sferoidale con nanosensori o la vitalità. Qui vengono presentati una serie di protocolli convenzionali di formazione di sferoidi, evidenziando la loro compatibilità con le microscopie a campo largo, confocale e a due fotoni. Viene inoltre presentato l'imaging di follow-up alla pipeline di analisi con FLIM multiplexato in autofluorescenza e, utilizzando vari tipi di cancro e sferoidi di cellule staminali.

Multicellular spheroids represent a group of 3D tissue models obtained by the self-aggregation of cells and exhibiting a spherical shape. They are widely used to mimic cell-cell and cell-matrix interaction in vitro and to reproduce&#160;a 3D context within a multitude of cancer and stem cell-derived constructs. Several techniques are employed to reduce cell attachment and promote the aggregation. These include the hanging-drop method relying on the surface tension1; cell attachment repelling methods such as ultra-low attachment plates, micro-molds, and microwells2,3; acoustic wave-based approach4; flow-induced aggregation methods (spinner flasks, bioreactor, and microfluidic devices)5; magnetic particles-assisted formation6 and use of the aggregation-promoting synthetic and ECM-based matrices and scaffolds7,8,9.
In cancer research, development, and validation of new drug therapies, spheroids are an attractive model due to their ability to recapitulate the spatial diffusion-limited gradients of nutrients, waste products, and O2, often leading to the formation of a necrotic core, typical to the solid tumors10,11. These more reliable and sophisticated in vitro models challenge the need for extensive use of animal models (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), according to the 3Rs principle of animal research (replacement, reduction, and refinement). In addition to cancer, spheroids find their application in stem cell research. For instance, pluripotent stem cells have the capacity to form embryoid bodies (EB), which can be used for the differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) towards specialized cell types that are challenging to obtain directly from patients, such as neural precursor cells13 or ovarian granulosa cells13,14. Furthermore, the formation of an EB is often the first step in the development of more complex organoid models, e.g., neural15, retinal16, cardiac17, liver18, stomach19, and intestinal organoids20. Factors including size, reproducibility, throughput, and downstream applications should be considered when choosing an appropriate spheroid formation method for the experiments.
The increased complexity of 3D culture can lead to higher variability compared to 2D culture. Factors such as nutrient composition21, media evaporation22, viscosity23, pH control24, spheroid formation method, and even the time in the culture25,26 can result in obtaining spheroids of varying morphology, sizes, viability, and different chemoresistance27,28. Recent research demonstrated that spheroid oxygen gradients are not always static and are affected by the formation method, spheroid size, and extracellular viscosity, affecting the spheroid heterogeneity29. To improve reproducibility and data accessibility on spheroids, the MISpheroID knowledge base has been developed26, identifying cell line, culture medium, formation method, and spheroids size as the minimal information for a reproducible result. Therefore, a detailed comparison was made of multiple high-throughput (SphericalPlate 5D, lab-made micromolds, and Microtissue molds) and low attachment methods (i.e., Biofloat and Lipidure-coated 96-well plates, both scaffold-free and scaffold-based) (Figure 1 and Table 1), including the well size (given an estimation of the maximum spheroid size), consumables used, preparation time and the possibility of monitoring spheroids without transporting them to microscopy dishes. The latter enables long-term studies, whereas spheroids produced with high-throughput methods often result in endpoint experiments. All methods except for the grids of the 5DspheriPlate do not bring unwanted autofluorescence, hereby enabling their direct use in microscopy.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg" /> 
Figure 1: Spheroid formation methods explained. High-throughput methods such as the SphericalPlate 5D, which has integrated patented microwells in the plate, while the lab-produced micromolds and the MicroTissue molds use stamps to make multiple microwells in agarose (blue). Low-attachment plates such as Lipidure (Amsbio) and Biofloat (Sarstedt) use a non-adherent coating inhibiting cell-surface adhesion and promoting cell self-aggregation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Self-produced micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Low attachment methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number of spheroids/well&#160;</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diameter well</td>
			<td>90 &#181;m</td>
			<td>400 &#181;m</td>
			<td>800 &#181;m</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture volume</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other consumables</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL of 3% agarose</td>
			<td>500 &#181;L of 2% agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation time</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2 h + 3 days media adaptation</td>
			<td>0.5 h + 15 min media adaptation</td>
			<td>10&#8211;30 min + 1 h drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescent</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable</td>
			<td>No</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cost</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#160;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;</td>
			<td>&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: Coating and Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8364;&#8364;: Commercial 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Some cell lines need addition of&#160; ECM (i.e. 2%&#8211;5% Matrigel) to form compact spheroids.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">**The coating is reusable until depleted. However, each plate will consume a small amount of media and dust can accumulate over time. Filter sterilization is regularly needed.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Comparison of multiple spheroid formation methods29. &#34;Monitoring&#34;: the ability to monitor spheroid without the need for transfer to a microscopy dish. &#8364;: 0-50&#8364;, &#8364;&#8364;: 50-150&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;: 150-500&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: &#62;500&#8364;
Fluorescence microscopy enables direct monitoring of the key biological aspects within spheroids, including cell death, viability, proliferation, metabolism, viscosity, and even mechanical properties30. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) provides an additional quantitative dimension for studying fluorescent probe interactions within their (micro)environment31,32,33,34, allowing resolving the overlapping emission spectra according to different emission lifetimes35,36 and probing cell metabolism based on intrinsic cellular autofluorescence. Thus, such widespread cellular autofluorescent compounds as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), protoporphyrin IX, and others can be measured with one- and two-photon FLIM and serve as intrinsic &#39;sensors&#39; of glucose catabolism, oxidative phosphorylation (OxPhos) and provide a general overview of the cell redox state. NAD(P)H exists in free cytoplasmic, or in protein-bound mitochondrial forms37,38. Similarly, the oxidized state of FAD is fluorescent with a longer lifetime of the free form. NAD(P)H and FAD microscopies usually involve two-photon excited FLIM, aiming at preventing sample photodamage39. Frequently, &#39;optical metabolic imaging&#39; FLIM can be combined with the use of dye-based probes, genetically encoded biosensors, phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM), and ratiometric intensity-based measurements in order to provide a more complete picture of spheroid or organoid metabolism, oxygenation, proliferation and cell viability29,30,31. In addition, FLIM can also be combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) method to measure the lifetime variation of the donor fluorophore when in close contact with the acceptor to investigate the binding of a drug with its target domain33,40,41.
The acquired FLIM images are typically analyzed to calculate the lifetime pixel-by-pixel. Currently, there are at least 3 common strategies used to obtain fluorescence lifetime: semi-quantitative &#39;fast FLIM&#39;42 (sometimes referred to as &#39;tau sense&#39;43,44), decay curve fitting, using one-, two- or three-exponential fitting, and &#39;fitting-free&#39; approach with phasor transformation and phasor plot analysis. Depending on the vendor, either provided (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) or open-source software (e.g., FLIMfit45, FLIMJ46, or others47) can be used to handle measured FLIM data. Typically, vendor-provided software is useful for preliminary data analysis, while open-source solutions can provide for more accurate studies using, e.g., phasor plots and 3D visualization.
Despite the usefulness and attractiveness of FLIM as a method for studying spheroids, very few experimental protocols are available, and there is a general lack of knowledge in choosing the most appropriate formation method for successful live multiparametric microscopy experiments involving FLIM. Here, a detailed comparison of commonly used spheroid formation protocols is presented based on their morphology, viability, and oxygenation with the recently validated and characterized far-red and near-infra-red (NIR) oxygen-sensing nanosensor (MMIR1). The cationic nanoparticle is impregnated with two reporter dyes, the reference O2-insensitive aza-BODIPY (excitation 650 nm, emission 675 nm) and the NIR O2-sensitive metalloporphyrin, PtTPTBPF (excitation 620 nm, emission 760 nm). The MMIR1 enables real-time analysis of oxygen gradients on a conventional fluorescence microscope (using ratiometric analysis) or phosphorescence lifetime microscope (PLIM) without introducing cellular toxicity and allowing for stable signals, long-term monitoring, and multiplexing25,29. Depending on the need to stain with dyes or nanosensors, spheroid throughput, or cell type, the most appropriate formation protocol can be chosen. Since the studies of spheroids viability and oxygenation are relevant for studies of cancer and stem cell-derived spheroids, the presented protocols also include examples and expected typical results of NAD(P)H-FLIM and&#160;FAD-FLIM with these models. The presented imaging and analysis pipelines target the most popular time-correlated single photon counting-based FLIM microscopy platforms.

Autore in primo piano: Standardizzazione dei metodi di formazione degli sferoidi per l'analisi metabolica e dell'ossigenazione mediante microscopia per imaging a fluorescenza

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

In this work, we present and compare spheroid formation methods that can be used for analysis of cell metabolism and oxygen distribution using live cell microscopy. In recent years, fluorescence lifetime imaging microscopy has been extensively used to investigate metabolic biomarkers like NADPH and FAD in live cells, and several fluorescent nanoparticles have been developed to multiplex such measurements with imaging of cell and tissue oxygenation. Multicellular spheroids, organoids, and organ-on-a-chip can replicate a complex, in-vivo-like microenvironment, minimizing the need in animal research.For spheroid production, we show different formation methods, can span from low to high throughput. They also highlight their optical accessibility, compatibility with fluorescence lifetime imaging microscope, and the possibility of including extracellular matrix components. So, even though 3D in vitro models provide better context in comparison to 2D cultures, their high variability, low reproducibility, and incomplete experimental reporting remain a problem.Parameters such as the spheroid size, the nutrient composition, the extracellular viscosity, and even spheroid formation methods can all lead to increased cellular heterogeneity. With this protocol, we aim to harmonize and standardize the spheroid production methods, highlighting key aspects important for life-continuous and multiparametric analysis of spheroids using FLIM microscopy.

Scegliere il metodo di formazione degli sferoidi appropriato Il metodo di formazione degli sferoidi selezionato può influenzare notevolmente le dimensioni, la forma, la densità cellulare, la vitalità e la sensibilità ai farmaci degli sferoidi (Figura 2). In precedenza, gli effetti di più metodi ad alta produttività (SphericalPlate 5D, microstampi realizzati in laboratorio e stampi MicroTissue) e i metodi a basso attacco "a media produttività" (Biofloat e piastre a ...

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Ricerca

Bioingegneria

High-Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging

To cast 3D Petri dishes, rinse the micromolds in distilled water and place them in an autoclavable container for autoclaving. Add 0.9%sterile saline to the autoclave agarose powder in a 200 milliliter glass bottle. Screw on the lid loosely to avoid pressure buildup and swirl the bottle to mix the agarose powder.Boil the agarose powder in a microwave oven with intermittent shaking. Once the agarose solution is cooled down, pipette the molten agarose into the micro mold and wait until it solidifies. Afterward, carefully flex the micro mold to remove the 3D Petri dish and transfer it to a 12-well tissue culture plate.To equilibrate the 3D Petri dish, add 2.5 milliliters of McCoy's 5A medium per well, and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After the final equilibration, completely remove all culture medium surrounding the 3D Petri dish and inside of the dish. Dropwise, seed 190 microliters of cell suspension containing 40, 500 cells into the seeding chamber and allow the cells to settle for 10 minutes.Add two milliliters of McCoy's 5A medium to the outside of the 3D Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After four days, the spheroids are compact enough for microscopy. Add 200 microliters of the coating solution to each well of a 96-well U-bottom culture plate, and incubate for one minute.Remove the excess coating solution and allow the plate to dry for one hour. See 200 microliters of cell suspension containing 500 cells to each well and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for at least four days.

Generazione ad alto rendimento di sferoidi multicellulari da una linea cellulare di cancro umano per l'imaging 3D dal vivo

Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

To begin, place the prewarmed imaging medium and sterile microscopy dishes with coated or non-coated cover glass surfaces on a working platform. After removing the medium surrounding the agarose mold, carefully resuspend the content of the molds in 190 microliters media before transferring floating spheroids into a two milliliter vial. For spheroids in a low-attachment plate, transfer spheroids one by one from individual wells to a vial.Allow the spheroids to settle down at the bottom of the vial for five minutes, forming a visible pellet. Remove the media from the vial, leaving spheroids undisturbed, and gently resuspend them in a sufficient amount of fresh McCoy's 5A medium. Now, transfer an equal volume of spheroid suspension per well of the microscopy dish.Incubate spheroid for 1 to 2 hours at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator. Add a fluorescence probe to a known volume of spheroid suspension and continue incubation for 1 hour at 37 degrees Celsius. After incubation, exchange the media containing fluorescent probes with a necessary volume of imaging media.Start the microscope control software and initialize the stage calibration. Then, choose the required objective. Choose the Open project window and click Create a New Project.Then, right click on the newly created project and select the Rename option in the dropdown menu. Give a standard name to the research project file. Open the Acquisition window.Set the pulse white light laser excitation wavelength and the required range of hybrid or resonance scanning detectors. Then, choose line or frame types of scan. In the Acquisition window, select FLIM mode to perform imaging combined with photon counting.Then, choose the white light laser pulse repetition rate. Start the preview imaging using Fast Live mode and adjust the fine focus of the imaging object on a section of interest. By looking at the pixel intensity histogram, adjust the appropriate laser intensity pinhole size and resolution.While in Fast Live, set the coordinates and scan direction and attribute them to begin and end in the Z-Stack window. Choose a z-step size or number of steps. Once all necessary settings are applied, start imaging.Give the image an appropriate name and save the imaging project. Different formation methods resulted in varying spheroid sizes. HCT116 spheroids in low attachment plates were significantly larger after five days compared to high throughput methods.Low attachment methods led to the evident development of a necrotic core detected by the propidium iodide staining. In contrast, spheroids generated with other methods demonstrated the diffused distribution of dead cells across the spheroid body. Oxygenation in HCT116 spheroids produced by different methods showed more oxygenated spheroid with the microtissue and lab-made micromolds than the Sphericalplate 5D.Spheroid oxygenation of Sphericalplate 5D spheroids showed lower oxygenation compared to microtissue and lab-made micromolds. Phasor analysis of HCT116 spheroids made using low-attachment plates reveals the presence of glycolytic and non-glycolytic cores via two-photon NADPH-FLIM.

Valutazione dell'impatto dei metodi di formazione degli sferoidi nei sistemi di coltura cellulare 3D utilizzando la microscopia per imaging a fluorescenza con fluorescenza di cellule vive (FLIM)