Name: Yazar Spotlight: Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Metabolik ve Oksijenasyon Analizi için Küresel Oluşum Yöntemlerinin Standardizasyonu
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00
Description: Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Bu çalışma, Ghent Üniversitesi'nin Özel Araştırma Fonu (BOF) hibeleri ile desteklenmiştir (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Flanders Araştırma Vakfı (FWO, I001922N) ve Avrupa Birliği, fliMAGIN3D-DN Ufuk Avrupa-MSCA-DN No. 101073507.

1. Çok hücreli sferoidlerin oluşumu
<ol><li>Hücre kültürü NOT: Hücre kültürleri, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich veya diğer satıcılardan toplanabilir. ATCC, tercih edilen büyüme ortamı, alt kültürleme prosedürleri, biyogüvenlik seviyesi, büyüme oranı ve STR profilleri dahil olmak üzere gerekli tüm kullanım bilgilerini sağlar. Burada, McCoy'un 5A ortamında (VWR, 392-0420) %10 FBS ve 1 mM Sodyum Piruvat ile desteklenmiş 500 hücre / sferoid ...

FLIM Tabanlı Metabolik ve Hipoksi Analizi için Çok Hücreli Spheroid Oluşumu

Çok hücreli sferoidler, tümör ve kök hücre niş mikro çevreleri, ilaç keşfi ve biyofabrikasyon için 'doku yapı taşlarının' geliştirilmesi çalışmalarında tercih edilen bir yöntem haline gelmektedir. Sferoidlerin heterojen iç mimarisi, besin gradyanları ve oksijenasyon, nispeten basitleştirilmiş ve erişilebilir bir ortamda in vivo doku ve tümörlerinkini taklit edebilir. Daha fazla metodolojik şeffaflığa 26,28 ve standardizasyona71</...

Çok hücreli sferoidler, hücrelerin kendi kendine toplanmasıyla elde edilen ve küresel bir şekil sergileyen bir grup 3B doku modelini temsil eder. Hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimini in vitro olarak taklit etmek ve çok sayıda kanser ve kök hücre türevi yapı içinde 3B bir bağlamı yeniden üretmek için yaygın olarak kullanılırlar. Hücre bağlanmasını azaltmak ve agregasyonu teşvik etmek için çeşitli teknikler kullanılır. Bunlar, yüzey gerilimine1 dayanan asılı-damla yöntemini; ultra düşük bağlantı plakaları, mikro kalıplar ve mikro kuyular gibi hücre bağlanma itme yöntemleri 2,3; akustik dalga tabanlı yaklaşım4; akış kaynaklı toplama yöntemleri (eğirme şişeleri, biyoreaktör ve mikroakışkan cihazlar)5; manyetik parçacık destekli oluşum6 ve toplamayı teşvik eden sentetik ve ECM bazlı matrislerin ve iskelelerin kullanımı 7,8,9.
Kanser araştırmaları, geliştirilmesi ve yeni ilaç tedavilerinin doğrulanmasında, sferoidler, besinlerin, atık ürünlerin ve O2'nin mekansal difüzyonla sınırlı gradyanlarını özetleme yetenekleri nedeniyle çekici bir modeldir ve genellikle katı tümörler için tipik olan nekrotik bir çekirdek oluşumuna yol açar10,11. Bu daha güvenilir ve sofistike in vitro modeller, hayvan araştırmalarının 3R ilkesine (değiştirme, azaltma ve iyileştirme) göre hayvan modellerinin (Gıda ve İlaç İdaresi [FDA] Modernizasyon Yasası 2.012) kapsamlı kullanımına duyulan ihtiyacı sorgulamaktadır. Kansere ek olarak, sferoidler uygulamalarını kök hücre araştırmalarında bulurlar. Örneğin, pluripotent kök hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nöral öncü hücreler13 veya yumurtalık granüloza hücreleri13,14 gibi doğrudan hastalardan elde edilmesi zor olan özel hücre tiplerine farklılaşması için kullanılabilen embriyoid cisimler (EB) oluşturma kapasitesine sahiptir. Ayrıca, bir EB oluşumu genellikle nöral15, retinal16, kardiyak17, karaciğer18, mide19 ve bağırsak organoidleri20 gibi daha karmaşık organoid modellerin geliştirilmesinde ilk adımdır. Deneyler için uygun bir sferoid oluşturma yöntemi seçerken boyut, tekrarlanabilirlik, verim ve aşağı akış uygulamaları gibi faktörler göz önünde bulundurulmalıdır.
3B kültürün artan karmaşıklığı, 2B kültüre kıyasla daha yüksek değişkenliğe yol açabilir. Besin bileşimi21, ortam buharlaşması22, viskozite23, pH kontrolü24, sferoid oluşum yöntemi ve hatta kültürdeki süre 25,26 gibi faktörler, değişen morfoloji, boyut, canlılık ve farklı kemorezistanslı sferoidlerin elde edilmesine neden olabilir27,28. Son araştırmalar, küresel oksijen gradyanlarının her zaman statik olmadığını ve küresel heterojenliği etkileyen oluşum yöntemi, küresel boyut ve hücre dışı viskoziteden etkilendiğini göstermiştir29. Sferoidlerde tekrarlanabilirliği ve veri erişilebilirliğini iyileştirmek için, MISpheroID bilgi tabanıgeliştirilmiştir 26 ve tekrarlanabilir bir sonuç için minimum bilgi olarak hücre hattını, kültür ortamını, oluşum yöntemini ve sferoid boyutunu belirler. Bu nedenle, kuyu boyutu (maksimum sferoid boyutunun bir tahmini verilen), kullanılan sarf malzemeleri, hazırlama süresi ve sferoidleri mikroskopi kaplarına taşımadan izleme olasılığı dahil olmak üzere çoklu yüksek verimli (SphericalPlate 5D, laboratuvar yapımı mikro kalıplar ve Mikrodoku kalıpları) ve düşük bağlanma yöntemleri (yani, Biofloat ve Lipidure kaplı 96 kuyulu plakalar, hem iskelesiz hem de iskele tabanlı) arasında ayrıntılı bir karşılaştırma yapılmıştır (Şekil 1 ve Tablo 1). İkincisi, uzun vadeli çalışmalara olanak tanırken, yüksek verimli yöntemlerle üretilen sferoidler genellikle son nokta deneyleriyle sonuçlanır. 5DspheriPlate'in ızgaraları dışındaki tüm yöntemler istenmeyen otofloresan getirmez, bu nedenle mikroskopide doğrudan kullanımlarını sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Şekil 1: Sferoid oluşum yöntemleri açıklanmıştır. Plakaya patentli mikro kuyuları entegre eden SphericalPlate 5D gibi yüksek verimli yöntemler, laboratuvarda üretilen mikro kalıplar ve MicroTissue kalıpları, agarozda (mavi) birden fazla mikro kuyu yapmak için damgalar kullanır. Lipidure (Amsbio) ve Biofloat (Sarstedt) gibi düşük bağlantılı plakalar, hücre yüzeyi yapışmasını engelleyen ve hücrenin kendi kendine toplanmasını destekleyen yapışmayan bir kaplama kullanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D Küresel Plaka</td>
			<td>Kendi ürettiği mikro kalıplar</td>
			<td>Mikro doku</td>
			<td>Düşük bağlanma yöntemleri</td>
		</tr><tr><td>Sferoid/kuyu sayısı</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Çap kuyusu</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 Milimetre</td>
		</tr><tr><td>Kültür hacmi</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Diğer sarf malzemeleri</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL% 3 agaroz</td>
			<td>500 μL% 2 agaroz</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Hazırlanma zamanı</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>2 saat + 3 gün medya adaptasyonu</td>
			<td>0,5 saat + 15 dk medya adaptasyonu</td>
			<td>10–30 dk + 1 saat kurutma</td>
		</tr><tr><td>Izleme</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Hayır**</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr><tr><td>Otofloresan</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Hayır</td>
		</tr><tr><td>Yeniden</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Hayır**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Masraf</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Kaplama ve Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Ticari 96 kuyulu plaka</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Bazı hücre hatları, kompakt sferoidler oluşturmak için ECM (yani %2-%5 Matrigel) ilavesine ihtiyaç duyar.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**Kaplama tükenene kadar tekrar kullanılabilir. Bununla birlikte, her plaka az miktarda ortam tüketir ve zamanla toz birikebilir. Filtre sterilizasyonuna düzenli olarak ihtiyaç duyulur.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Çoklu sferoid oluşturma yöntemlerinin karşılaştırılması29. "İzleme": bir mikroskopi çanağına aktarmaya gerek kalmadan sferoidi izleme yeteneği. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: >500€
Floresan mikroskobu, hücre ölümü, canlılık, proliferasyon, metabolizma, viskozite ve hatta mekanik özellikler dahil olmak üzere sferoidler içindeki temel biyolojik yönlerin doğrudan izlenmesini sağlar30. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), (mikro) ortamlarında 31,32,33,34 floresan prob etkileşimlerini incelemek için ek bir nicel boyut sağlar ve farklı emisyon ömürlerine göre örtüşen emisyon spektrumlarının çözülmesine izin verir 35,36 ve içsel hücresel otofloresansa dayalı hücre metabolizmasının araştırılması. Bu nedenle, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NAD (P) H), flavin mononükleotid (FMN), flavin adenin dinükleotid (FAD), protoporfirin IX ve diğerleri gibi yaygın hücresel otofloresan bileşikler bir ve iki foton FLIM ile ölçülebilir ve glikoz katabolizması, oksidatif fosforilasyon (OxPhos) ve hücre redoks durumuna genel bir bakış sağlar. NAD(P)H serbest sitoplazmik veya proteine bağlı mitokondriyal formlardabulunur 37,38. Benzer şekilde, FAD'ın oksitlenmiş hali, serbest formun daha uzun bir ömrüne sahip floresandır. NAD(P)H ve FAD mikroskopileri genellikle numune fotohasarını önlemeyi amaçlayan iki foton uyarılmış FLIM'i içerir39. Sıklıkla, 'optik metabolik görüntüleme' FLIM, sferoid veya organoid metabolizması, oksijenasyon, proliferasyon ve hücre canlılığının daha eksiksiz bir resmini sağlamak için boya bazlı problar, genetik olarak kodlanmış biyosensörler, fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) ve oransal yoğunluğa dayalı ölçümlerin kullanımıyla birleştirilebilir 29,30,31. Ek olarak, FLIM, bir ilacın hedef alanı 33,40,41 ile bağlanmasını araştırmak için alıcı ile yakın temas halindeyken donör floroforun ömür boyu değişimini ölçmek için Förster rezonans enerji transferi (FRET) yöntemi ile de birleştirilebilir.
Elde edilen FLIM görüntüleri, kullanım ömrünü piksel piksel hesaplamak için tipik olarak analiz edilir. Şu anda, floresan ömrünü elde etmek için kullanılan en az 3 yaygın strateji vardır: yarı kantitatif 'hızlı FLIM'42 (bazen 'tau sense'43,44 olarak anılır), bir, iki veya üç üstel uydurma kullanarak bozunma eğrisi uydurma ve fazör dönüşümü ve fazör grafiği analizi ile 'uydurmasız' yaklaşım. Satıcıya bağlı olarak, ölçülen FLIM verilerini işlemek için sağlanan (LAS X, Symphotime, SPCImage, vb.) veya açık kaynaklı yazılım (örneğin, FLIMfit45, FLIMJ46 veya diğerleri47) kullanılabilir. Tipik olarak, satıcı tarafından sağlanan yazılım, ön veri analizi için yararlıdır, açık kaynaklı çözümler, örneğin fazör grafikleri ve 3D görselleştirme kullanarak daha doğru çalışmalar sağlayabilir.
Sferoidleri incelemek için bir yöntem olarak FLIM'in kullanışlılığına ve çekiciliğine rağmen, çok az deneysel protokol mevcuttur ve FLIM'i içeren başarılı canlı multiparametrik mikroskopi deneyleri için en uygun oluşum yönteminin seçiminde genel bir bilgi eksikliği vardır. Burada, yaygın olarak kullanılan sferoid oluşum protokollerinin ayrıntılı bir karşılaştırması, yakın zamanda doğrulanmış ve karakterize edilmiş uzak kırmızı ve yakın kızılötesi (NIR) oksijen algılayıcı nanosensör (MMIR1) ile morfolojilerine, canlılıklarına ve oksijenasyonlarına dayalı olarak sunulmaktadır. Katyonik nanoparçacık, referans O2 duyarsız aza-BODIPY (uyarma 650 nm, emisyon 675 nm) ve NIR O2 duyarlı metaloporfirin, PtTPTBPF (uyarma 620 nm, emisyon 760 nm) olmak üzere iki raportör boya ile emprenye edilir. MMIR1, hücresel toksisite oluşturmadan ve kararlı sinyallere, uzun süreli izlemeye ve çoğullamaya izin vermeden geleneksel bir floresan mikroskobu (oransal analiz kullanılarak) veya fosforesans ömür mikroskobu (PLIM) üzerinde oksijen gradyanlarının gerçek zamanlı analizini sağlar25,29. Boyalar veya nanosensörler ile boyama ihtiyacına, sferoid verimine veya hücre tipine bağlı olarak en uygun oluşum protokolü seçilebilir. Sferoidlerin canlılığı ve oksijenasyonu ile ilgili çalışmalar, kanser ve kök hücre kaynaklı sferoidler ile ilgili olduğundan, sunulan protokoller ayrıca bu modellerle NAD(P)H-FLIM ve FAD-FLIM örneklerini ve beklenen tipik sonuçlarını da içermektedir. Sunulan görüntüleme ve analiz boru hatları, en popüler zamanla ilişkili tek foton sayma tabanlı FLIM mikroskopi platformlarını hedeflemektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Also available from Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-3700</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665-180</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Chamber slide, removable</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81201</td>
			<td>Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Nerbe plus</td>
			<td>02-502-3001</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Petri Dish micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Z764000-6EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell-culture plates, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL02.0537.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biofloat</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3925.400</td>
			<td>Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein Green-AM</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>AS-89201</td>
			<td>Apply in dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>version 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from human placenta, type IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal FLIM Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td>Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5030-10X1L</td>
			<td>For preparation of imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;(FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td>Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human colon cancer cells HCT116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>version 4.6.1.27508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure-CM5206</td>
			<td>Amsbio</td>
			<td>AMS.52000034GB1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>392-0420</td>
			<td>Standard growth medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-patterned 3D-printed PDMS stamps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chemlab</td>
			<td>CL00.1429.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer couting chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15980396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 probes: MMIR1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 
			v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>Gibco18912014</td>
			<td>Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 &#956;g/mL) 100x solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5mg</td>
			<td>For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>Cell death staining, use 1 &#181;g/mL at 1h incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A35149</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphericalPlate 5D 24-well</td>
			<td>Kugelmeiers</td>
			<td>SP5D-24W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile petridish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>633181</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (25 cm&#178; )</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2311</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask (75 cm&#178;)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Agarose</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and multi-parameter live cell fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) of multicellular spheroids

Çok hücreli tümör sferoidleri, tümör mikroçevresini yeniden üretmek, ilaç tedavilerini test etmek ve optimize etmek ve biyo ve nanosensörleri 3D bağlamda kullanmak için popüler bir 3D doku mikroagregat modelidir. Üretim kolaylığı, öngörülebilir boyutları, büyümeleri ve gözlemlenen besin ve metabolit gradyanları, 3B niş benzeri hücre mikro ortamını özetlemek için önemlidir. Bununla birlikte, sferoid heterojenliği ve üretim yöntemlerinin değişkenliği, genel hücre metabolizmasını, canlılığını ve ilaç yanıtını etkileyebilir. Bu, kök ve kanser hücresi biyolojisinde in vitro 3D doku modellerinde olduğu gibi boyut, değişkenlik, biyofabrikasyon ihtiyaçları ve kullanım gereksinimleri göz önüne alındığında en uygun metodolojiyi seçmeyi zorlaştırır. Özellikle, sferoid üretimi, optik metabolik görüntüleme, floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), nanosensörlerle küresel hipoksinin izlenmesi veya canlılık gibi kantitatif canlı mikroskoplarla uyumluluklarını etkileyebilir. Burada, canlı geniş alan, konfokal ve iki fotonlu mikroskoplarla uyumluluklarını vurgulayan bir dizi geleneksel sferoid oluşum protokolü sunulmaktadır. Çoğullanmış otofloresan FLIM ile ve çeşitli kanser türleri ve kök hücre sferoidleri kullanılarak analiz hattına yönelik takip görüntülemesi de sunulmaktadır.

Multicellular spheroids represent a group of 3D tissue models obtained by the self-aggregation of cells and exhibiting a spherical shape. They are widely used to mimic cell-cell and cell-matrix interaction in vitro and to reproduce&#160;a 3D context within a multitude of cancer and stem cell-derived constructs. Several techniques are employed to reduce cell attachment and promote the aggregation. These include the hanging-drop method relying on the surface tension1; cell attachment repelling methods such as ultra-low attachment plates, micro-molds, and microwells2,3; acoustic wave-based approach4; flow-induced aggregation methods (spinner flasks, bioreactor, and microfluidic devices)5; magnetic particles-assisted formation6 and use of the aggregation-promoting synthetic and ECM-based matrices and scaffolds7,8,9.
In cancer research, development, and validation of new drug therapies, spheroids are an attractive model due to their ability to recapitulate the spatial diffusion-limited gradients of nutrients, waste products, and O2, often leading to the formation of a necrotic core, typical to the solid tumors10,11. These more reliable and sophisticated in vitro models challenge the need for extensive use of animal models (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), according to the 3Rs principle of animal research (replacement, reduction, and refinement). In addition to cancer, spheroids find their application in stem cell research. For instance, pluripotent stem cells have the capacity to form embryoid bodies (EB), which can be used for the differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) towards specialized cell types that are challenging to obtain directly from patients, such as neural precursor cells13 or ovarian granulosa cells13,14. Furthermore, the formation of an EB is often the first step in the development of more complex organoid models, e.g., neural15, retinal16, cardiac17, liver18, stomach19, and intestinal organoids20. Factors including size, reproducibility, throughput, and downstream applications should be considered when choosing an appropriate spheroid formation method for the experiments.
The increased complexity of 3D culture can lead to higher variability compared to 2D culture. Factors such as nutrient composition21, media evaporation22, viscosity23, pH control24, spheroid formation method, and even the time in the culture25,26 can result in obtaining spheroids of varying morphology, sizes, viability, and different chemoresistance27,28. Recent research demonstrated that spheroid oxygen gradients are not always static and are affected by the formation method, spheroid size, and extracellular viscosity, affecting the spheroid heterogeneity29. To improve reproducibility and data accessibility on spheroids, the MISpheroID knowledge base has been developed26, identifying cell line, culture medium, formation method, and spheroids size as the minimal information for a reproducible result. Therefore, a detailed comparison was made of multiple high-throughput (SphericalPlate 5D, lab-made micromolds, and Microtissue molds) and low attachment methods (i.e., Biofloat and Lipidure-coated 96-well plates, both scaffold-free and scaffold-based) (Figure 1 and Table 1), including the well size (given an estimation of the maximum spheroid size), consumables used, preparation time and the possibility of monitoring spheroids without transporting them to microscopy dishes. The latter enables long-term studies, whereas spheroids produced with high-throughput methods often result in endpoint experiments. All methods except for the grids of the 5DspheriPlate do not bring unwanted autofluorescence, hereby enabling their direct use in microscopy.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg" /> 
Figure 1: Spheroid formation methods explained. High-throughput methods such as the SphericalPlate 5D, which has integrated patented microwells in the plate, while the lab-produced micromolds and the MicroTissue molds use stamps to make multiple microwells in agarose (blue). Low-attachment plates such as Lipidure (Amsbio) and Biofloat (Sarstedt) use a non-adherent coating inhibiting cell-surface adhesion and promoting cell self-aggregation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Self-produced micromolds</td>
			<td>Microtissue</td>
			<td>Low attachment methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number of spheroids/well&#160;</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diameter well</td>
			<td>90 &#181;m</td>
			<td>400 &#181;m</td>
			<td>800 &#181;m</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture volume</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other consumables</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL of 3% agarose</td>
			<td>500 &#181;L of 2% agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation time</td>
			<td>10 min</td>
			<td>2 h + 3 days media adaptation</td>
			<td>0.5 h + 15 min media adaptation</td>
			<td>10&#8211;30 min + 1 h drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescent</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable</td>
			<td>No</td>
			<td>Yes</td>
			<td>Yes</td>
			<td>No**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cost</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#160;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;</td>
			<td rowspan="2">&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;</td>
			<td>&#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: Coating and Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8364;&#8364;: Commercial 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Some cell lines need addition of&#160; ECM (i.e. 2%&#8211;5% Matrigel) to form compact spheroids.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">**The coating is reusable until depleted. However, each plate will consume a small amount of media and dust can accumulate over time. Filter sterilization is regularly needed.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Comparison of multiple spheroid formation methods29. &#34;Monitoring&#34;: the ability to monitor spheroid without the need for transfer to a microscopy dish. &#8364;: 0-50&#8364;, &#8364;&#8364;: 50-150&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;: 150-500&#8364; , &#8364;&#8364;&#8364;&#8364;: &#62;500&#8364;
Fluorescence microscopy enables direct monitoring of the key biological aspects within spheroids, including cell death, viability, proliferation, metabolism, viscosity, and even mechanical properties30. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) provides an additional quantitative dimension for studying fluorescent probe interactions within their (micro)environment31,32,33,34, allowing resolving the overlapping emission spectra according to different emission lifetimes35,36 and probing cell metabolism based on intrinsic cellular autofluorescence. Thus, such widespread cellular autofluorescent compounds as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H), flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide (FAD), protoporphyrin IX, and others can be measured with one- and two-photon FLIM and serve as intrinsic &#39;sensors&#39; of glucose catabolism, oxidative phosphorylation (OxPhos) and provide a general overview of the cell redox state. NAD(P)H exists in free cytoplasmic, or in protein-bound mitochondrial forms37,38. Similarly, the oxidized state of FAD is fluorescent with a longer lifetime of the free form. NAD(P)H and FAD microscopies usually involve two-photon excited FLIM, aiming at preventing sample photodamage39. Frequently, &#39;optical metabolic imaging&#39; FLIM can be combined with the use of dye-based probes, genetically encoded biosensors, phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM), and ratiometric intensity-based measurements in order to provide a more complete picture of spheroid or organoid metabolism, oxygenation, proliferation and cell viability29,30,31. In addition, FLIM can also be combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) method to measure the lifetime variation of the donor fluorophore when in close contact with the acceptor to investigate the binding of a drug with its target domain33,40,41.
The acquired FLIM images are typically analyzed to calculate the lifetime pixel-by-pixel. Currently, there are at least 3 common strategies used to obtain fluorescence lifetime: semi-quantitative &#39;fast FLIM&#39;42 (sometimes referred to as &#39;tau sense&#39;43,44), decay curve fitting, using one-, two- or three-exponential fitting, and &#39;fitting-free&#39; approach with phasor transformation and phasor plot analysis. Depending on the vendor, either provided (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) or open-source software (e.g., FLIMfit45, FLIMJ46, or others47) can be used to handle measured FLIM data. Typically, vendor-provided software is useful for preliminary data analysis, while open-source solutions can provide for more accurate studies using, e.g., phasor plots and 3D visualization.
Despite the usefulness and attractiveness of FLIM as a method for studying spheroids, very few experimental protocols are available, and there is a general lack of knowledge in choosing the most appropriate formation method for successful live multiparametric microscopy experiments involving FLIM. Here, a detailed comparison of commonly used spheroid formation protocols is presented based on their morphology, viability, and oxygenation with the recently validated and characterized far-red and near-infra-red (NIR) oxygen-sensing nanosensor (MMIR1). The cationic nanoparticle is impregnated with two reporter dyes, the reference O2-insensitive aza-BODIPY (excitation 650 nm, emission 675 nm) and the NIR O2-sensitive metalloporphyrin, PtTPTBPF (excitation 620 nm, emission 760 nm). The MMIR1 enables real-time analysis of oxygen gradients on a conventional fluorescence microscope (using ratiometric analysis) or phosphorescence lifetime microscope (PLIM) without introducing cellular toxicity and allowing for stable signals, long-term monitoring, and multiplexing25,29. Depending on the need to stain with dyes or nanosensors, spheroid throughput, or cell type, the most appropriate formation protocol can be chosen. Since the studies of spheroids viability and oxygenation are relevant for studies of cancer and stem cell-derived spheroids, the presented protocols also include examples and expected typical results of NAD(P)H-FLIM and&#160;FAD-FLIM with these models. The presented imaging and analysis pipelines target the most popular time-correlated single photon counting-based FLIM microscopy platforms.

Yazar Spotlight: Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Metabolik ve Oksijenasyon Analizi için Küresel Oluşum Yöntemlerinin Standardizasyonu

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

In this work, we present and compare spheroid formation methods that can be used for analysis of cell metabolism and oxygen distribution using live cell microscopy. In recent years, fluorescence lifetime imaging microscopy has been extensively used to investigate metabolic biomarkers like NADPH and FAD in live cells, and several fluorescent nanoparticles have been developed to multiplex such measurements with imaging of cell and tissue oxygenation. Multicellular spheroids, organoids, and organ-on-a-chip can replicate a complex, in-vivo-like microenvironment, minimizing the need in animal research.For spheroid production, we show different formation methods, can span from low to high throughput. They also highlight their optical accessibility, compatibility with fluorescence lifetime imaging microscope, and the possibility of including extracellular matrix components. So, even though 3D in vitro models provide better context in comparison to 2D cultures, their high variability, low reproducibility, and incomplete experimental reporting remain a problem.Parameters such as the spheroid size, the nutrient composition, the extracellular viscosity, and even spheroid formation methods can all lead to increased cellular heterogeneity. With this protocol, we aim to harmonize and standardize the spheroid production methods, highlighting key aspects important for life-continuous and multiparametric analysis of spheroids using FLIM microscopy.

Uygun sferoid oluşum yönteminin seçilmesi Seçilen sferoid oluşturma yöntemi, sferoidlerin boyutunu, şeklini, hücre yoğunluğunu, canlılığını ve ilaç duyarlılığını büyük ölçüde etkileyebilir (Şekil 2). Daha önce, çoklu yüksek verimli (SphericalPlate 5D, laboratuvar yapımı mikro kalıplar ve MicroTissue kalıpları) ve 'orta verimli' düşük bağlanma (Biofloat ve Lipidür kaplı 96 oyuklu plakalar) yöntemlerinin etkileri, sferoidlerin canl?...

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Biyomühendislik

High-Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging

To cast 3D Petri dishes, rinse the micromolds in distilled water and place them in an autoclavable container for autoclaving. Add 0.9%sterile saline to the autoclave agarose powder in a 200 milliliter glass bottle. Screw on the lid loosely to avoid pressure buildup and swirl the bottle to mix the agarose powder.Boil the agarose powder in a microwave oven with intermittent shaking. Once the agarose solution is cooled down, pipette the molten agarose into the micro mold and wait until it solidifies. Afterward, carefully flex the micro mold to remove the 3D Petri dish and transfer it to a 12-well tissue culture plate.To equilibrate the 3D Petri dish, add 2.5 milliliters of McCoy's 5A medium per well, and incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After the final equilibration, completely remove all culture medium surrounding the 3D Petri dish and inside of the dish. Dropwise, seed 190 microliters of cell suspension containing 40, 500 cells into the seeding chamber and allow the cells to settle for 10 minutes.Add two milliliters of McCoy's 5A medium to the outside of the 3D Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After four days, the spheroids are compact enough for microscopy. Add 200 microliters of the coating solution to each well of a 96-well U-bottom culture plate, and incubate for one minute.Remove the excess coating solution and allow the plate to dry for one hour. See 200 microliters of cell suspension containing 500 cells to each well and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for at least four days.

Canlı 3D Görüntüleme için İnsan Kanser Hücre Hattından Yüksek Verimli Çok Hücreli Sferoid Üretimi

Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

To begin, place the prewarmed imaging medium and sterile microscopy dishes with coated or non-coated cover glass surfaces on a working platform. After removing the medium surrounding the agarose mold, carefully resuspend the content of the molds in 190 microliters media before transferring floating spheroids into a two milliliter vial. For spheroids in a low-attachment plate, transfer spheroids one by one from individual wells to a vial.Allow the spheroids to settle down at the bottom of the vial for five minutes, forming a visible pellet. Remove the media from the vial, leaving spheroids undisturbed, and gently resuspend them in a sufficient amount of fresh McCoy's 5A medium. Now, transfer an equal volume of spheroid suspension per well of the microscopy dish.Incubate spheroid for 1 to 2 hours at 37 degrees Celsius in a carbon dioxide incubator. Add a fluorescence probe to a known volume of spheroid suspension and continue incubation for 1 hour at 37 degrees Celsius. After incubation, exchange the media containing fluorescent probes with a necessary volume of imaging media.Start the microscope control software and initialize the stage calibration. Then, choose the required objective. Choose the Open project window and click Create a New Project.Then, right click on the newly created project and select the Rename option in the dropdown menu. Give a standard name to the research project file. Open the Acquisition window.Set the pulse white light laser excitation wavelength and the required range of hybrid or resonance scanning detectors. Then, choose line or frame types of scan. In the Acquisition window, select FLIM mode to perform imaging combined with photon counting.Then, choose the white light laser pulse repetition rate. Start the preview imaging using Fast Live mode and adjust the fine focus of the imaging object on a section of interest. By looking at the pixel intensity histogram, adjust the appropriate laser intensity pinhole size and resolution.While in Fast Live, set the coordinates and scan direction and attribute them to begin and end in the Z-Stack window. Choose a z-step size or number of steps. Once all necessary settings are applied, start imaging.Give the image an appropriate name and save the imaging project. Different formation methods resulted in varying spheroid sizes. HCT116 spheroids in low attachment plates were significantly larger after five days compared to high throughput methods.Low attachment methods led to the evident development of a necrotic core detected by the propidium iodide staining. In contrast, spheroids generated with other methods demonstrated the diffused distribution of dead cells across the spheroid body. Oxygenation in HCT116 spheroids produced by different methods showed more oxygenated spheroid with the microtissue and lab-made micromolds than the Sphericalplate 5D.Spheroid oxygenation of Sphericalplate 5D spheroids showed lower oxygenation compared to microtissue and lab-made micromolds. Phasor analysis of HCT116 spheroids made using low-attachment plates reveals the presence of glycolytic and non-glycolytic cores via two-photon NADPH-FLIM.

Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM) Kullanılarak 3 Boyutlu Hücre Kültürü Sistemlerinde Sferoid Oluşturma Yöntemlerinin Etkisinin Değerlendirilmesi