Name: a chromatin assay for human brain tissue
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Assay for Human Brain Tissue at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Förfarande: 1: a Day 1. Homogenisera 50-500 mg frysta efter slakt grå vävnad med Douncing buffert. ! VARNING - mänsklig vävnad måste hanteras med omsorg under strikta säkerhetskrav. Det ska hanteras på BSL-2 eller högre säkerhetsstandard. <ol><li> Ta tidigare dissekerade, obduktioner hjärnan från -80 ° C, dounce dem i 5X hjärnans volym Douncing buffert, och placera i 2,0 ml mikrocentrifugrör. Ma...

<ol>
	<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain.">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 .</li><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters.">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 .</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 .</li><li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2,+a+gene+linked+to+speech+and+language,+in+developing+human+brain.">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 .</li><li>Huang, H. u. a. n. g., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia.">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, .</li><li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain.">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 .</li></ol>

Det protokoll som beskrivs här är särskilt användbart för utredarna intresserade histon och / eller DNA-metylering underskrifter mänskliga hjärnan, eftersom dessa kromatin märken kan vara mindre benägna att obduktion artefakter jämfört med andra typer av förändringar, inklusive (histon) acetylering och fosforylering 1, 2. Den obduktion hjärnan är mottaglig för studiet av mono-nucleosomal preparat; DNA är i stort sett knutna till kärnan histoner, åtminstone i prover med representativa autolys intervall (tiden me...

Lösningar: <ul><li> nChIP Douncing buffert: 10 mM Tris, 4 mm MgCl 2, 1 mm CaCl 2 justera pH till 7,5 </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl justera pH till 7,5 </li><li> Låg salt tvättningsbuffert: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Hög salt tvättningsbuffert: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl </li><li> Litiumklorid Buffert: 1% IGEPAL-CA 630, 1% desoxicholsyra syra, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl </li><li> TE buffert: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Eluering Buffer: 0,1 miljoner NaHCO 3, 1% SDS </li><li> Proteinas K matsmältningen buffert (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl justera pH till 8,0 </li><li> 3 M natriumacetat: 24,61 g vattenfritt natriumacetat (MW = 82,03) i 100 ml autoklaveras destillerat vatten. Justera pH till 5,2 med hjälp av koncentrerad ättiksyra. </li></ul>

a chromatin assay for human brain tissue

Kroniska neuropsykiatriska sjukdomar som schizofreni, bipolär sjukdom och autism tros bero på en kombination av genetiska och miljömässiga faktorer som kan leda till epigenetiska förändringar av genuttryck och andra molekylär patologi. Traditionellt var dock uttryck studier i döden hjärnan begränsad till kvantifiering av mRNA eller protein. Begränsningarna stött på döden hjärnforskning som variabilitet i autolys tid och integrities vävnad är också sannolikt att påverka några studier av högre strukturer för kromatin. Men nucleosomal organisation av arvsmassans DNA inklusive DNA: core histon bindande - verkar vara i stort sett bevaras i representativa prover som tillhandahålls av olika hjärnan banker. Därför är det möjligt att studera metylering mönstret och andra kovalenta modifieringar av kärnan histoner vid definierade genetiska loci i döden hjärnan. Här presenterar vi en förenklad infödd kromatin immunoprecipitation (NChIP) protokoll för frysta (aldrig fast) mänskliga hjärnan exemplar. Från och med micrococcal nukleas rötning av hjärnan homogenat, följt NChIP av qPCR kan slutföras inom tre dagar. Den metod som presenteras här bör vara användbar för att belysa epigenetiska mekanismer av genuttryck i normala och sjuka mänskliga hjärnan.

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Assay for Human Brain Tissue at JoVE.com

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Fram till nyligen var uttryck studier på mänskliga hjärnan begränsad till kvantifiering av RNA eller protein. Med kromatin immunoprecipitation tekniker som beskrivs i detta dokument kommer det att vara möjligt att kartlägga histon metylering och andra epigenetiska regulatorer av genuttryck i döden hjärnan.

En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Kromatin Immunoprecipitation (chip) för analys Dynamisk Histon Ändring i aktiverade genuttryck i humana celler

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Kromatin Immunoutfällning (chip) med användning av Drosophila Vävnad

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Av hög kvalitet om Kromatin Immunoprecipitation DNA Mall för hög genomströmning sekvensering (chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Generation och rening av mänskliga INO80 Chromatin Remodeling Komplex och subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metod för att välja Struktur-växling Aptamerer Tillämpat på en kolorimetrisk Gold nanopartiklar analys

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...