Name: neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

De auteurs waarderen het advies en technische ondersteuning door Dr Richard Konz en medewerkers van de Flow Cytometry Core-faciliteit van de Universiteit van Massachusetts Medical School. Core middelen gesteund door het Diabetes Endocrinologie Research Center Grant DK032520 werden ook gebruikt. Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de National Institute of Mental Health (NIMH), het National Institute of Drug Abuse (NIDA) en het National Institute of Child Health and Human Development.

Kernen Extraction <ol><li> Doe 250 mg van bevroren postmortaal hersenweefsel in 5 ml Lysis Buffer 1 in een douncer en plaats deze op ijs. Voor het ontvangen van ongeveer 5 miljoen kernen na FACS-sortering, we meestal gebruik van 1000 mg van de weefsels per monster. </li><li> Zodra het weefsel is ontdooid, dounce het weefsel voor een minuut, terwijl op ijs. </li><li> Neem de gehomogeniseerd weefsel en plaats deze in een 15 ml helder ultracentrifuge buis. Zet de tube op het ijs. </li><li> Neem 9 mL van Sucrose...

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Het protocol hier gepresenteerde moeten in het bijzonder nuttig zijn voor onderzoek gericht zijn op epigenetische veranderingen van neuronale chromatine en, meer algemeen, over de moleculaire fenotype van de neuronale kern, tijdens de normale ontwikkeling en veroudering, of in de neurologische of psychiatrische ziekte. De methode is vooral van voordeel bij de cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel, inclusief mogelijke verschuivingen in neuron-to-glia rantsoen in de loop van het ouder worden of door ziekte zijn een punt van zor...

Reagentia: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysis Buffer </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sucrose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetaat) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 0.1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 pl </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ui </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stel het volume tot 50 ml met Cellenbeton water </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Sucrose Solution </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sucrose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetaat) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 pl </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stel het volume tot 50 ml met Cellenbeton water </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce buffer </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Breng de pH tot 7,5 en het volume tot 200 ml met Cellenbeton water </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Neuronen in de menselijke hersenen grotendeels worden postmitotische tijdens de prenatale ontwikkeling, en dus behouden hun kernen gedurende de volledige levensduur. Er is echter weinig bekend over veranderingen in neuronale chromatine-en nucleaire organisatie in de loop van de ontwikkeling en veroudering, of bij chronische neuropsychiatrische aandoeningen. Echter, de meeste chromatine en DNA-gebaseerde testen (anders dan die van vissen), gebrek aan enkele cel resolutie datum. Te dien einde, de aanzienlijke cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking, want meestal verschillende subpopulaties van neuronen worden vermengd met verschillende soorten glia en andere niet-neuronale cellen. Een mogelijke oplossing zou zijn om cel-type specifieke culturen groeien, maar de meeste CNS cellen, met inbegrip neuronen, zijn ex vivo een duurzame, op zijn best, maar een paar weken en zou dus een incompleet model voor epigenetische mechanismen mogelijk actief over de gehele levensduur te bieden . Hier bieden we een protocol te halen en kernen te zuiveren van bevroren (nooit vast) menselijke postmortem hersenen. De methode omvat extractie van kernen in hypotone lysis buffer, gevolgd door ultracentrifugatie en immunotagging met anti-Neun antilichaam. Gelabeld neuronale kernen worden vervolgens gescheiden ingezameld met behulp van fluorescentie-geactiveerde sorteren. Deze methode moet worden van toepassing op alle gebied van de hersenen in een breed scala van soorten en geschikt voor chromatine immunoprecipitatie studies met site-en modificatie-specifieke anti-histon antilichamen, en voor DNA-methylering en andere testen.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...