Name: neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00
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Les auteurs apprécient les conseils et l&#39;appui technique fourni par le Dr Richard Konz et personnel de l&#39;établissement de base de cytométrie en flux à l&#39;Université du Massachusetts Medical School. Les ressources de base soutenu par le diabète de recherche en endocrinologie Centre DK032520 Grant ont également été utilisés. Ce travail est soutenu par des subventions de l&#39;Institut national de santé mentale (NIMH), le National Institute of Drug Abuse (NIDA) et l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain.

Extraction des noyaux <ol><li> Mettez 250 mg de tissus post-mortem du cerveau congelé dans 5 mL 1 Lysis Buffer dans un douncer et le placer sur la glace. Pour recevoir environ 5 millions de noyaux après la FACS tri, nous utilisons habituellement 1000 mg de tissu par exemple. </li><li> Une fois le tissu a été décongelé, le tissu Dounce pendant 1 minute tout sur la glace. </li><li> Prenez le tissu homogénéisé et le placer dans un tube de 15 ml ultracentrifugeuse clair. Placer le tube sur la glace. </l...

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	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Le protocole présenté ici devrait être particulièrement utile pour les études ont porté sur les modifications épigénétiques de la chromatine neuronale et, plus généralement, sur le phénotype moléculaire du noyau des neurones, au cours normal de la maladie neurologique ou psychiatrique en développement et le vieillissement, ou dans. La méthode est particulièrement avantageuse lorsque l&#39;hétérogénéité cellulaire des tissus du cerveau, y compris d&#39;éventuelles modifications dans le neurone-glie à la ration au cours...

Réactifs: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysis Buffer </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Saccharose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 pi </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acétate) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TNT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Réglez le volume à 50 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solution Sucrée </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Saccharose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acétate) 2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TNT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Réglez le volume à 50 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampon </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuster le pH à 7,5 et le volume à 200 ml avec de l&#39;eau à l&#39;autoclave </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Les neurones dans le cerveau humain devient postmitotiques largement au cours du développement prénatal, et donc de maintenir leurs noyaux à travers la pleine durée de vie. Cependant, on sait peu de changements dans la chromatine neuronale et l&#39;organisation nucléaire au cours du développement et de vieillissement, ou dans la maladie neuropsychiatrique chronique. Toutefois, à ce jour la plupart des dosages d&#39;ADN de la chromatine et basée (autres que les poissons) la résolution de cellules manquent unique. À cette fin, l&#39;hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante, parce que les sous-populations différentes de neurones normalement sont mêlés à différents types de cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Une solution possible serait de développer un type de cellule cultures spécifiques, mais la plupart des cellules du SNC, y compris les neurones, sont ex vivo durable, au mieux, pour seulement quelques semaines et ne serait donc fournir un modèle incomplet pour des mécanismes épigénétiques pourraient exploitation à travers la pleine durée de vie . Ici, nous fournissons un protocole pour extraire et purifier les noyaux de surgelés (jamais fixe) du cerveau post-mortem humain. La méthode consiste à l&#39;extraction de noyaux dans un tampon de lyse hypotonique, suivie par ultracentrifugation et immunotagging avec des anti-NeuN anticorps. Étiqueté noyaux des neurones sont ensuite collectés séparément en utilisant la fluorescence-activated tri. Cette méthode devrait être applicable à n&#39;importe quelle région du cerveau dans une large gamme d&#39;espèces et propice aux études d&#39;immunoprécipitation de chromatine avec des sites et la modification spécifique des anticorps anti-histones et la méthylation de l&#39;ADN et autres tests.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

L&#39;hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l&#39;étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n&#39;ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.

Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Recherche

Biologie

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Obtention d&#39;ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 enrichit le rendement des mélanocytes humains à partir de tissus cutanés adultes

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolement, caractérisation et application thérapeutique de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines en culture

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...