Name: neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00
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Gli autori apprezzano la consulenza e il supporto tecnico fornito dal Dr. Richard Konz e del personale presso l&#39;impianto di base Citometria a flusso presso l&#39;Università del Massachusetts Scuola Medica. Risorse di base sostenuto dalla Endocrinologia Diabetes Research Center di Grant DK032520 sono stati utilizzati anche. Questo lavoro è supportato anche da finanziamenti del National Institute of Mental Health (NIMH), l&#39;Istituto Nazionale di Drug Abuse (NIDA) e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano.

Nuclei di estrazione <ol><li> Mettere 250 mg di tessuto cerebrale post-mortem congelato in 5 ml di Lysis Buffer 1 in douncer e posizionarlo sul ghiaccio. Per ricevere circa 5 milioni di nuclei dopo FACS ordinamento, useremo 1000 mg di tessuto per campione. </li><li> Una volta che il tessuto si è scongelato, dounce il tessuto per 1 minuto, mentre sul ghiaccio. </li><li> Prendete il tessuto omogeneizzato e posizionarlo in un tubo da 15 ml ultracentrifuga chiaro. Mettere la provetta in ghiaccio. </li><li> Pren...

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	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Il protocollo presentato qui dovrebbe essere particolarmente utile per gli studi focalizzati sui cambiamenti epigenetici della cromatina neuronale e, più in generale, sul fenotipo molecolare del nucleo neuronale, durante il normale sviluppo delle malattie e l&#39;invecchiamento, o neurologici o psichiatrici. Il metodo è particolarmente vantaggioso quando l&#39;eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale, tra cui i potenziali cambiamenti nei neuroni-to-glia razione durante il corso di invecchiamento oa causa di malattia sono un problema ...

Reagenti: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysis Buffer </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Saccarosio </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 microlitri </td></tr><tr><td> 0.1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 microlitri </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Regolare il volume a 50 ml con acqua autoclavato </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Soluzione di saccarosio </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Saccarosio </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 microlitri </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 microlitri </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH8 </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Regolare il volume a 50 ml con acqua autoclavato </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampone </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Regolare il pH a 7,5 e il volume a 200 ml con acqua autoclavato </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Neuroni nel cervello umano si postmitotic in gran parte durante lo sviluppo prenatale, e quindi mantenere la loro nuclei per tutta la durata della vita piena. Tuttavia, poco si sa sui cambiamenti neuronali e organizzazione della cromatina nucleare durante il corso dello sviluppo e dell&#39;invecchiamento, o in malattie croniche neuropsichiatrici. Tuttavia, ad oggi i test basati la maggior parte della cromatina e DNA (esclusi quelli di pesci) risoluzione mancanza singola cellula. A tal fine, la notevole eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa, perché di solito diverse sottopopolazioni di neuroni sono mescolati con diversi tipi di cellule gliali e di altre cellule non neuronali. Una possibile soluzione sarebbe far crescere specifiche culture di cellule-tipo, ma la maggior parte delle cellule del SNC, tra cui i neuroni, sono ex vivo sostenibile, nella migliore delle ipotesi, solo per poche settimane e quindi avrebbe fornito un modello incompleto per meccanismi epigenetici potenzialmente operanti in tutto il ciclo di vita completo . Ecco, mettiamo a disposizione un protocollo per estrarre e purificare i nuclei da congelati (non fisso) del cervello umano post-mortem. Il metodo prevede l&#39;estrazione dei nuclei in tampone di lisi ipotonica, seguita da ultracentrifugazione e immunotagging con anticorpi anti-NeuN. Etichettati nuclei neuronali vengono poi raccolti separatamente utilizzando la fluorescenza-attivato ordinamento. Questo metodo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi regione del cervello in una vasta gamma di specie e adatto per gli studi di immunoprecipitazione della cromatina con il sito-specifici e modifica-anticorpi anti-istoni, e per la metilazione del DNA ed altri test.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

L&#39;eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Ricerca

Biologia

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

L&#39;ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...