Name: neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00
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Os autores agradecem o aconselhamento e apoio técnico fornecido pelo Dr. Richard Konz e pessoal nas instalações Núcleo Citometria de Fluxo na Universidade de Massachusetts Medical School. Recursos suportados pelo núcleo de Endocrinologia Diabetes Research Center Grant DK032520 também foram utilizados. Este trabalho é suportado por concessões do National Institute of Mental Health (NIMH), do Instituto Nacional de Abuso de Drogas (NIDA) e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano.

Extração de núcleos <ol><li> Colocar 250 mg de tecido congelado cérebro pós-morte em 5 mL de Lise um tampão em um douncer e colocá-lo no gelo. Para receber cerca de 5 milhões núcleos após FACS triagem, geralmente usamos 1000 mg de tecido por amostra. </li><li> Uma vez que o tecido tem descongelado, Dounce o tecido por 1 minuto enquanto no gelo. </li><li> Pegue o tecido homogeneizado e colocá-lo em um tubo de ultracentrífuga 15 mL claro. Colocar o tubo em gelo. </li><li> Tome 9 mL da solução de ...

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	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado deve ser particularmente útil para os estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina neuronal e, mais genericamente, sobre o fenótipo molecular do núcleo neuronal, durante a doença em desenvolvimento e envelhecimento, ou em condições normais neurológicos ou psiquiátricos. O método é uma vantagem particular quando a heterogeneidade celular de tecido do cérebro, incluindo mudanças potenciais no neurônio-glia de-ração durante o curso do envelhecimento ou devido a doenças são uma preocupaç...

Reagentes: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Tampão de Lise </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sacarose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, PH8 </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 mL </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o volume para 50 ml com água esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solução de sacarose </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sacarose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 mL </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 mL </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, PH8 </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o volume para 50 ml com água esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampão </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o pH para 7,5 e volume para 200 ml com água esterilizada </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Neurônios no cérebro humano se tornar pós-mitóticos em grande parte durante o desenvolvimento pré-natal, e assim manter seus núcleos em todo o ciclo de vida completo. No entanto, pouco se sabe sobre as alterações na cromatina nuclear neuronal e na organização durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento, ou doença neuropsiquiátrica crônica. No entanto, a data mais cromatina e DNA ensaios com base (que não FISH) a falta de resolução única célula. Para este fim, a uma considerável heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa, porque normalmente várias subpopulações de neurônios são misturados com diferentes tipos de células gliais e outras células não-neuronais. Uma possível solução seria a crescer células tipo culturas específicas, mas a maioria das células do SNC, incluindo os neurônios, são ex vivo sustentável, na melhor das hipóteses, por apenas algumas semanas e assim proporcionaria um modelo incompleto de mecanismos epigenéticos potencialmente operacional em todo o ciclo de vida completo . Aqui, nós fornecemos um protocolo para extrair e purificar a partir de núcleos congelados do cérebro pós-morte (nunca fixo) humana. O método envolve a extração de núcleos em tampão de lise hipotônica, seguido por ultracentrifugação e immunotagging com anti-NeuN anticorpos. Rotulados núcleos neuronais são então recolhidos separadamente usando fluorescência ativado classificação. Este método deve ser aplicável a qualquer região do cérebro em uma ampla gama de espécies e adequado para estudos de imunoprecipitação de cromatina com local e modificação específica anticorpos anti-histonas, e para a metilação do DNA e outros ensaios.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Biologia

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Isolamento baseado em afinidade de núcleos marcados de tecidos de Drosophila para análise de expressão gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...