Name: neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00
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Los autores agradecen el asesoramiento y apoyo técnico proporcionado por el Dr. Richard Konz y el personal en las instalaciones de flujo básico de Citometría de la Universidad de Massachusetts Medical School. Los recursos básicos con el apoyo de la Diabetes Endocrinología del Centro de Investigación de Grant DK032520 también fueron utilizados. Este trabajo es apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH), el Instituto Nacional de Abuso de Drogas (NIDA) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano.

Los núcleos de extracción <ol><li> Poner 250 mg de tejido congelado el cerebro post mortem en 5 ml de un tampón de lisis en un douncer y colocarlo sobre hielo. Para recibir unos 5 millones de núcleos después de FACS clasificación, por lo general el uso de 1000 mg de tejido por muestra. </li><li> Una vez que el tejido se ha descongelado, el tejido Dounce durante 1 minuto, mientras que en el hielo. </li><li> Tome el tejido homogeneizado y colocarlo en un tubo de ultracentrífuga 15 ml claro. Ponga el tub...

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	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

El protocolo que aquí se presenta debe ser particularmente útil para los estudios se centraron en los cambios epigenéticos de la cromatina neuronal y, en general, sobre el fenotipo molecular del núcleo neuronal, durante el funcionamiento normal desarrollo de la enfermedad y el envejecimiento, o neurológicos o psiquiátricos. El método es particularmente ventajoso cuando la heterogeneidad celular del tejido cerebral, incluyendo posibles cambios en la ración de las neuronas a células gliales en el transcurso del tiempo ya causa de la ...

Reactivos: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Tampón de lisis </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Sacarosa </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl2 </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 l </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 l </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuste el volumen a 50 ml con agua esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solución de sacarosa </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sacarosa </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 l </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 l </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajuste el volumen a 50 ml con agua esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce buffer </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar el pH a 7.5 y el volumen a 200 ml con agua esterilizada </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Las neuronas en el cerebro humano se postmitóticas en gran parte durante el desarrollo prenatal, y así mantener sus núcleos en todo el ciclo de vida completo. Sin embargo, poco se sabe acerca de los cambios en la cromatina nuclear y la organización neuronal durante el curso del desarrollo y el envejecimiento, o en las enfermedades neuropsiquiátricas crónicas. Sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los ensayos basados ​​en la cromatina y el ADN (excepto los de pescado) Resolución de la falta de células individuales. Con este fin, la gran heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante, ya que por lo general diversas subpoblaciones de neuronas se entremezclan con los diferentes tipos de glía y otras células no neuronales. Una posible solución sería hacer crecer células de tipo culturales específicas, pero la mayoría de las células del SNC, incluyendo las neuronas, son ex vivo sostenible, en el mejor de los casos, sólo un par de semanas y por lo tanto proporcionaría un modelo incompleto de los mecanismos epigenéticos potencialmente operan en todo el ciclo de vida completo . Aquí, ofrecemos un protocolo para extraer y purificar los núcleos de congelación (no fijos) del cerebro de cadáver. El método consiste en la extracción de núcleos en solución amortiguadora de lisis hipotónica, seguida por ultracentrifugación y immunotagging con anticuerpos anti-NeuN. Núcleos etiquetados neuronal continuación, se recogen por separado mediante fluorescencia activadas por la clasificación. Este método debe ser aplicable a cualquier región del cerebro en una amplia gama de especies y adecuada para los estudios de inmunoprecipitación de la cromatina en el sitio-y la modificación de los anticuerpos específicos anti-histonas, y por la metilación del ADN y otros ensayos.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Investigación

Biología

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...